生物物理学家Joerg Bewersdorf说,2006年是荧光显微镜重大之年——“奇迹年”1905年一样重要的以自己的方式,当爱因斯坦彻底改变了物理学领域的相对论,量子理论和原子物理学。在显微镜的情况下,革命包括三篇论文1,2,3第一次,给了科学家们的权力窥视细胞和跟踪单个分子的行为。

结合荧光标签和纸张成像收益率的超分辨率视图结构在一个固定的(非生物)细胞。信贷:韦斯利Legant

“每个分子是一个机器,有点nano-machine,“Bewersdorf说。蛋白质,特别是,是扭曲的复杂分子,flex,开启和关闭以多种方式来执行反应细胞代谢和生长所必需的,发送消息,并提供结构。”这就是我们最终理解感兴趣,“Bewersdorf说:“所有这些小机器如何一起工作的全局函数细胞?”

直到科学家可以观察这个世界,然而,他们只有多云的想法如何回答这个问题。光学显微镜没有帮助;超过一定的放大,衍射光波分散而不是融合形成一个图像。任何特性之间的距离要小于200纳米,约40倍宽度的一个典型的细胞膜,成为绝望的模糊。图片用电子显微镜可以解决好结构——但他们是静态的,几乎不可能获得从一个活细胞。

独立的三个实验室规避“衍射屏障”在2006年采取了类似的策略:研究样本与专门的荧光探针,可以选择性地打开,数一次,直到所有的捕获探针的一系列图像。结合这些图像的数据构建一个图片,类似于一个印象派画家与点建立一个场景的颜色(见“连接这些点”)。三种技术,使光敏化定位显微镜(PALM)1荧光棕榈(FPALM)2重建和随机光学显微镜(风暴)3——可以区分点只是相隔20纳米,在单分子水平产生荧光的光线最清晰的图像。研究人员纷纷利用这些功能。Bewersdorf的实验室在耶鲁大学在纽黑文,康涅狄格州,例如,他拍摄的蛋白质在活细胞的表面移动4。

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自2006年以来的十年间,三种技术,激发了一波又一波的技术和方法上的创新。研究人员正在设计荧光探针,其亮度和强大到足以图像细胞过程展开。他们也在开发方法,导致更少的活细胞破坏。几个照明策略寻求减少视觉干扰引起的背景荧光,而计算方法和策略是让研究人员结合多个实时成像方法看到分子的相互作用。

“大兴奋在过去的几年里,这些技术已经成为可行的活细胞,”Jennifer Lippincott-Schwartz说,细胞生物学家霍华德•休斯医学研究所Janelia研究校园,维吉尼亚州。“肯定是成熟的时间能够形象个人使用荧光蛋白质。”

持久,闪亮的更强

三个超分辨率显微技术发明于2006年依靠光探测器发出的化合物,如绿色荧光蛋白(GFP),第一次被隔离在一个发光水母。这些探头可以插入到基因的DNA编码细胞蛋白质的兴趣。然后,当蛋白质产生,它将有荧光化合物,并通过发光将揭示它的存在。

肯定是成熟的时间能够形象个人使用荧光蛋白质。

但这些技术有严重的局限性。最大的一个是这些探测器只能发出一个有限数目的光子之前不可逆转地破坏强度的激光用于激发发光。甚至在这扎根photo-bleaching影响,当单独成像探测非常微弱的。

这些探测器称为有机合成版本(即含碳)染料是光明的,但他们不能基因编码的目标和细胞内制造。相反,他们常常与抗体可以寻找感兴趣的蛋白质。然而,结合可以使探测器太大通过细胞膜或笨重足以干扰蛋白质的功能。

“探测是真的限制我们,真的定义在某种程度上,这种技术可以,“Bewersdorf说。

幸运的是,替代品出现。Bewersdorf集团正在与两个“点击化学”调查:SNAP-tag,来自新英格兰生物学实验室在伊普斯维奇,马萨诸塞州和HaloTag Promega在麦迪逊,威斯康辛州。这些技术包括短期目标可以编码到感兴趣的蛋白质序列和染料分子与靶蛋白点击到位通过一个简单的化学反应。Bewersdorf和他的同事证明了两个标签可以用于有机染料在活细胞实现分辨率低于50 nm5——一样精确的20海里解决原始技术,与它们结合的优势基因编码探针的特异性和贫瘠的亮度合成染料。

研究人员还将量子点,纳米半导体不仅明亮的和稳定的一个月或者更多,但也可以链接到生物分子。黛安娜Lidke,生物物理学家在阿尔伯克基的新墨西哥大学的,使用量子点在她的实验室的细胞信号。对她来说,量子点的利益大于主要缺点——他们的大小。商用量子点是包围一个shell,可以点链接到其他分子,但扩展点的直径15 - 25 nm。“他们非常大,笨重,”她说,至少在与荧光蛋白相比,也可以是4海里宽。

这陷阱意味着研究人员有困难让量子点进入细胞或其他狭小空间,但他们适合的细胞外,膜结合蛋白Lidke目标。与丈夫凯斯Lidke合作,相同的大学的物理学家,她开发了一个multiple-colour,快,单分子跟踪方法,使用量子点产生图像一个定制的显微镜6。

不过,大部分细胞的内部流程仍然锁在膜内,难以达到与荧光探针。

打开细胞

通过细胞的膜是一种最令人生畏的荧光显微镜所面临障碍。“虽然只有五纳米厚,(细胞膜)有几十亿年的进化分离的内部细胞从外面,它令人惊讶的是,“保罗•Selvin表示厄巴纳伊利诺斯州大学的生物物理学家。

Selvin的实验室已开发出自己的小的量子点,接近9 nm直径7。大小减少帮助他量子点陷入约20 - 40 nm神经细胞之间的空隙,突触,到附近的神经细胞信号分子传递消息。一旦在这个间隙,量子点可以绑定并宣传受体的存在促进记忆的形成。Selvin没有发送这些较小的活细胞内的量子点,但他说,这可能是可能的。

荧光标记的微管(绿色)和线粒体(红色)是在传统模糊显微镜(左)。他们更当随机光学重建显微镜(风暴,中间),依然尖锐(右)当一个高级版本的风暴显示3 d的结构。信贷:b .黄咕咕叫。当今。化学。医学杂志。1410 - 14 (2010)

Selvin的实验室也在研究策略在等离子体膜上打孔,然后迅速重新封装,这样细胞不打扰。“我们有效地钻小微孔膜,大约5纳米,”他说,使用一种称为链球菌溶血素的细菌酶o .这只是宽足以让荧光蛋白,连一个抗体,溜进并找到其细胞内的目标。方法,Selvin尚未发布,然后补丁这些漏洞在20分钟。

然而,总是担心添加调查典型干扰靶蛋白的功能。另一种策略,不损害蛋白质来自杰肖,马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学的生物物理学家。她的探针分子基因编码,而是挂在感兴趣的分子,他们是由一个酶裂解生产和匆匆就去一个特定的细胞膜的一部分。这意味着他们不再携带任何目标分子的位置信息,但他们是在一个位置肖可以精确地数了数,从而得到一个确切的统计产生的蛋白质,而蛋白质本身是免费的,他们的业务的。她调用该方法co-translational激活劈理(CoTrAC)8。

“能够量化的绝对是活细胞中蛋白质含量是非常重要的,”肖解释道。“大多数时候人们使用荧光指示相对变化。“然而,只有少数的基因调控蛋白质的研究生产,这使得他们很难与大多数超分辨率图像技术。此外,小的变化在这些蛋白质的确切数量可以确定细胞变化的状态。CoTrAC的优点是,通过收集调查对不同蛋白质在细胞膜上的不同位置,这种技术可以用来计算多个蛋白质产品使用相同的荧光分子和颜色。时这是一个至关重要的能力产生不同的探针可以需要不同的时间量,可能掩盖了时间的细胞过程。

照明的方式

保鲜储藏格、引人注目的图像可以来自光明的探针,但是使探针脱颖而出的另一种方法是减少背景光。“你有许多不同的飞机,你观察同时大幅但你可以看到只有一个平面,在你的相机的焦点平面,”乌尔里希Kubitscheck说,德国波恩大学的生物物理化学家。“但你仍然有扩散的背景细胞中的一切。”

非目标蛋白甚至可以有自己的,自然的,微弱的荧光,导致噪音。如果背景可以被蒙在鼓里,可以增强图像的对比度和清晰度。

因此,研究人员不断改进照明策略。Kubitscheck的实验室使用纸张显微镜来生成一个非常薄的光束精确聚焦光片的样本。“我们已经从下面是透明的玻璃室,,”他说。通过侧闪亮的光而不是样品的顶部,他的团队照亮一段只有200 - 300 nm厚和观察下面的样本。这样,组织RNA分子视为他们出口的核通过蛋白复合物称为核孔,进入细胞质,继续指导蛋白质合成9。

显微镜装备进行纸张成像从徕卡等公司商用微系统公司在位于德国,德国从卡尔蔡司。组织必要的专业知识甚至可以做Kubitscheck的团队已经完成,构建自己的定制的显微镜。

下一次迭代的选择性平面照明显微镜叫做晶格纸张显微镜和埃里克•Betzig来自实验室的物理学家Janelia也开发棕榈显微镜。技术可以生成一个照明平面300 - 500纳米厚,合作者哲Liu表示细胞生物学家Janelia——但方法的真正优势是结构光。晶格形成一个三维网格移动,连续照明部分的样本。“你可以形象更长的一段时间,因为失焦分子被保存下来,”刘说。拍摄3 d图像也是可能的。刘三年前开始使用这种技术,而Betzig仍在发展中,检查组织的蛋白质必需的集群,维持干细胞自我更新的能力10。

晶格纸张显微镜还没有商业化,尽管卡尔蔡司显微镜。直到今年发售,团体有兴趣使用这项技术需要组装自己的定制的显微镜。“对齐是棘手,”刘警告,但是Betzig和其他人提供研讨会,帮助那些愿意解决的挑战。

运动的缩影

这些探测器和照明策略可以组合为真正新颖的见解。“通常,字段定义结构的细胞,“Lippincott-Schwartz说。“现在我们正在处理底层机制,允许这些结构和互动。”

在她的实验室Janelia, Lippincott-Schwartz和她的同事们利用晶格纸张显微镜——她所谓的“真正变革性技术”——看细胞细胞器和蛋白质相互作用的方式。她和她的同事看过酶反复与内质网(ER)交互,网络膜细胞中蛋白质合成和折叠11。宗教上地,ER一直认为只有一个站点的蛋白质分泌,但这些观察“真的让我开始思考不同的细胞器的主键或主要功能”,她说。ER可能与其他结构比以前认为。

这种工作需要专业知识甚至除此之外需要对齐和正确使用的显微镜。Lippincott-Schwartz解释说,它需要适当的算法重建图像从显微镜获得的数据。“这不仅仅是你可以挑选,”她说。通常情况下,实验室没有实质性的超分辨率成像和经验统计方法,它依赖于可以求助专家举行的专业知识在共享成像设备,一些机构。但她也看到了相关的标准图像采集和分析需要设置的字段。“否则,会有信息不当解释,”她说。

单分子成像的复杂性意味着干净数据,控制和正确的分析是无价的。“如果我可以推荐一些人进入这个领域,”安东尼颤栗者说,生物学研究所的神经生物学家在巴黎高等师范学院研究分子的运动在突触,“这将是在统计物理有一个很好的背景或工作的人一个很好的知识。”

让这种努力是值得的,但是,为了获得分子级生活的“黑盒”占据空间之间的经典的微型光学显微镜和电子显微镜在纳米尺度上。活细胞中单分子的方法提供了一种寻找新的生物参数测量和观察,颤栗者说。“这些参数将使我们能够开发新的理论领域和生活有了新的认识。”