显微镜制造商

在费城宾夕法尼亚大学攻读生物工程博士学位时，韦斯利·莱甘特遇到了一个令人沮丧的障碍:他有想法，但实现这些想法的设备还不存在。

由于对细胞力学和运动感兴趣，李甘特正在开发工具来测量细胞对环境施加的力。他将荧光珠嵌入正在生长的哺乳动物细胞周围的材料中，这样当细胞移动时，就会使材料变形，从而移动荧光珠。通过测量珠子的移动量，李甘特可以计算出细胞施加的力¹．尽管如此，他还是很难获得准确的数据。“这些工具是成功的，但我很快就遇到了现有显微镜的局限性，”他说。

细胞在自身动力作用下移动缓慢，最快的移动速度为每分钟几微米，因此显微镜需要长时间观察细胞的运动。为了在3D中追踪珠子，李甘特必须以高空间分辨率对整个体积进行成像。那是在2000年代末和2010年代初，当时可用的商业显微镜——点扫描和自旋盘共聚焦显微镜——还不能胜任这项工作。

“这两种技术实际上都有足够的分辨率来进行我们想要的跟踪，但它们的光毒性太强，速度太慢，”莱甘特说。

想象一个透明的立方体。共聚焦显微镜使科学家们能够逐个捕捉立方体中的每个点，并逐渐构建出3D图像。为了做到这一点，他们将一束光垂直地穿过样品，照亮在每个点上穿过立方体的一列。但是每一次闪光都会产生破坏样品的活性氧，这就是Legant所说的“光毒性”效应。与此同时，显微镜检测到的发光“荧光团”会随着时间的推移而褪色，这一过程被称为光漂白。

在Legant的实验中，每张3D图像的获取大约需要一分钟。然后，他不得不再等五分钟来拍摄下一张照片，以便给细胞时间恢复，从而避免在收集所需数据之前杀死它们。他能够测量细胞施加的力，但没有达到他想要的细节水平。

为了解决这些问题，李甘特在博士后研究期间转移了研究重点。与霍华德休斯医学研究所的物理学家和显微镜专家埃里克·贝齐格合作Janelia研究校园在弗吉尼亚州的阿什伯恩，他加入了规模不大但不断壮大的DIY显微镜社区。

实时成像

制造显微镜是一项复杂而耗时的挑战，它需要一个拥有正确技能的团队来处理涉及的光学、机械和计算机部件的阵列。但回报可能是巨大的。一种新型显微镜不仅能促进生物学的发展，还能促进显微镜本身的发展。

在Janelia，研究人员突破了神经科学和发育生物学的界限。这些领域严重依赖显微镜和成像技术，而该研究所拥有大量现成的商用显微镜。但是当他们需要的工具不存在时，他们不会等待其他地方发明它们——他们在内部创建它们。

“我们在技术开发方面工作的动机是，我们希望能够实现现有显微镜无法完成的新型实验，”Janelia的物理学家Philipp Keller说，他研究斑马鱼和果蝇的神经系统发育。

2000年代中期，当凯勒在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室工作时，他面临着一个与莱冈特类似的问题:他想追踪正在发育的斑马鱼胚胎中的所有细胞，以了解它们如何移动和结合形成不同的组织和器官。但大多数现有的显微镜无法长时间成像这种大小的标本——一个直径约700微米的细胞球——而不会因为所需的强光而杀死它。

所以，凯勒转向了光片显微镜，一种当时刚刚开始使用的技术。光片显微镜不是照亮整个样品，而是将弱聚焦、低强度的“片”光直接投射到用户想成像的物体的焦平面上。高质量的相机可以在一次曝光中捕捉到整个焦平面，通过垂直移动该平面通过样本，研究人员可以重建整个3D物体。

“光片显微镜是一种非常快速的成像技术，但它也非常温和，”凯勒说。“没有任何失焦结构暴露在光线下或被光线损坏。”当时，没有现成的显微镜适合凯勒的研究，所以在2005年，他决定建造一台²．他的设计被称为数字扫描激光薄片荧光显微镜(DSLM)，可以在90秒内捕获正在发育的斑马鱼胚胎中的每个细胞。

并不是所有的显微镜建造者在开始设计时都有一个特定的研究问题。对于德国马克斯普朗克生物物理化学研究所(Göttingen)的物理学家Stefan Hell来说，提出显微镜学的新概念本身就是一个目标。“这是一个科学项目。我这样做是为了提出一个推动显微镜艺术的想法，”他说。

他在这方面非常成功。2014年，赫尔与加州斯坦福大学的威廉·莫尔纳(William Moerner)以及贝齐格(Betzig)共同获得了诺贝尔化学奖，因为他们发明了超分辨荧光显微镜，这种技术可以让研究人员在纳米尺度上成像生物结构。

他说，尽管赫尔已经制造并商业化了几种显微镜设计，但很少有生物学家需要效仿，尤其是因为商业制造商很快就会抓住新想法。他自己的诺贝尔奖设计^3.1999年，他花了20万美元建造了这座名为“刺激排放耗竭”(STED)的温室。现在，它可以作为一个按钮系统，只有鞋盒的一半大小，可以连接到任何现有的共聚焦荧光显微镜上。他说，还有几家公司也在生产轻型薄片显微镜。

然而，Keller说，光片显微镜领域仍然相对年轻，少数几个商业可用的系统落后于科学研究的“前沿”“七到八年”。“我们真的被迫自己建造。”

这个过程有利有弊。定制系统可以在速度和分辨率方面领先曲线几年，并且可以定制为专注于特定的生物问题或系统。但这是以灵活性为代价的。在一些DIY系统中，像改变放大倍率这样简单的事情都很难做到。定制系统需要花费宝贵的时间和精力来设置和维护。

位于马里兰州贝塞斯达的美国国家心肺血液研究所的细胞生物学家克莱尔·沃特曼说，对于那些愿意接受挑战的人来说，回报是值得的。在20世纪90年代初，沃特曼利用新的相机技术开发了一种称为荧光散斑显微镜的技术⁴这使得研究细胞骨架和其他大型多蛋白复合物成为可能。她说:“这样做的好处是，你得到了一个别人还得不到的答案。”“缺点是你必须自己解决所有的bug。但这很有趣!”

自助指南

无论是为了改进显微镜技术，还是为了回答一个特定的生物学问题，建造一个新显微镜的过程基本上是相同的。凯勒在这方面非常有经验——“我们没有一年不在研制一种新的显微镜”，他说——他已经把这个过程细化到最基本的部分(见“DIY显微镜的十步”)。Keller说，一个好的显微镜团队应该包括一个物理学家或生物医学工程师来运行这个项目，并得到至少四名专家的支持:一个光学工程师来规划光学布局;一个机械工程师，解决如何将所有部件装配在一起;软件开发人员为机器编程;计算机科学家将原始数据转换成可用的图像。

第一步是光学设计。使用专门的软件——Keller和Legant使用的是华盛顿州Kirkland的Zemax公司提供的OpticStudio——光学工程师在虚拟空间中定义激光、透镜、镜子和其他光学组件的正确排列，以提供所需的分辨率和特性。

然后，机械工程师会研究出所有这些部件在现实世界中是如何组合在一起的，就像固定在光学台上的物理部件一样。在Janelia和Keller一起工作的机械工程师Brian Coop说:“在这一点上，它只是一排透镜，漂浮在太空中。”“我要让它自己站稳脚跟。”

Coop说，在这个阶段最大的挑战是在极其严格的物理限制下工作。当显微镜必须聚焦在只有几微米甚至纳米大小的物体上时，几乎没有出错的余地。镜头、镜子和激光需要保持精确的对齐，以产生有用的、聚焦内的图像，Coop需要考虑到微小的变化，比如金属的热膨胀，可能会影响对齐。Coop说:“注意光学对准的准确性会让后面的事情变得更简单。”

Coop尽可能多地使用现成的部件或重用以前的部件来构建显微镜。但每台显微镜至少都有一些定制的部件，这些部件库珀必须自己设计，有时还得在珍妮莉亚的机器车间里制造。

例如，凯勒最新的显微镜中的样品室有一个端口，可以容纳四个物镜，这些物镜被浸入样品被淹没的介质中。显微镜需要密封，防止泄漏，但也允许透镜独立移动。由于目标之间的距离非常近，只有100微米的间隙，而且所有目标都有不同的大小和形状，Coop必须调整室和密封以适应各种可能的组合。他估计，设计和制作每个舱室需要两到三天时间，成本在800到1000美元之间。

一旦光学和机械工程师组装好一个原型，软件开发人员和计算机科学家就会介入，以确保各个部件正常工作，并产生可用的图像。Janelia公司的计算机程序员丹尼尔·米尔基(Daniel Milkie)说，许多显微镜制造商使用一种名为LabVIEW的商业软件包来控制他们的显微镜，但当机器变得更先进时，有时就需要定制解决方案。

他说:“我们正在设计新的工具和新型显微镜，它们正在推动硬件的极限，所以你需要为此设计软件，以获得最大的性能。”诀窍在于确保软件足够灵活，可以快速调整以满足新的需求，比如增加探测器的数量。因此，Milkie将代码模块化，这意味着无需从头开始就可以轻松集成新元素。

但米尔基说，软件方面最大的挑战是如何处理显微镜产生的大量数据。高速摄像头每秒可以产生十亿字节的数据，有些机器同时运行多个摄像头。Milkie说，仅Betzig实验室一年就能产生50 - 100tb的数据。“我们创造了这个消防水管，那么它会去哪里呢?他说。

成品看起来一点也不像传统的显微镜。所有的部件——镜子、透镜、激光器、相机和样品室——都被固定在桌子上的各种柱子和夹子上，桌子重达数吨，用来隔绝显微镜的振动。利甘特说，这就像一个精心制作的乐高套件。

凯勒估计，从零开始建造一台显微镜至少需要一年的时间，尽管如果团队可以回收上一代仪器的部件和软件，就可以减少这一时间。而且由于设计需要越来越高级的定制，开发成本也越来越高。凯勒的DSLM在2005年的建造成本约为5万美元，而后来的机器成本为10 - 20万美元。他在2015年的最新成果——各向同性多视角显微镜⁵-成本超过100万美元。凯勒说:“我不认为我们会再看到这样的日子:我们造了一个5万美元的显微镜，然后说这是对目前技术水平的改进。”

自定义问题

定制机器也需要更多的技巧来使用，因为它们通常需要对每个实验进行大量的设置和校准——商业制造商试图避免的那种由用户动手调整的操作。但沃特曼表示，这不应该成为障碍。“这是你在基本的显微镜课程中应该学习的基础知识，”她说。

已发表的涉及新型显微镜系统的研究通常包括计划和部件清单。对于那些想要一点手把手的人，Janelia在网上免费提供显微镜的计划和软件，并在建造过程中提供帮助。“大约有20个小时的视频教程教你如何组装和对齐所有东西，”莱甘特说。此外，还有其他专业知识来源。网站包括diSPIM.org来自马里兰州贝塞斯达美国国家生物医学成像和生物工程研究所高分辨率光学成像部门的生物物理学家Hari Shroff，OpenSPIM.org这项研究始于德国德累斯顿马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所帕维尔·托曼克的发育生物学实验室OpenSpinMicroscopy由西班牙巴塞罗那光子科学研究所的埃米利奥·瓜尔达(Emilio Gualda)领导的团队，都免费提供各种轻片显微镜配置方案。

但是，尽管根据现有计划建造一个显微镜比从头开始设计一个显微镜要简单，但它仍然需要光学、力学、电子学、计算机编程和生物学的知识。瓜尔达说，最大的优势是价格。OpenSpinMicroscopy公司提供的选择性平面照明显微镜的商业版本售价约为20万美元。瓜尔达估计，使用他的开源软件和Arduino控制器等廉价硬件，研究人员可以以四分之一的价格制造出高质量的机器，其中大部分成本来自激光和摄像头。瓜尔达补充说:“你可以根据自己的需要定制它。”

还有在线论坛，用户可以在那里获得建议和交易技巧。Srigokul Upadhyayula是马萨诸塞州波士顿哈佛医学院的一名分子生物学家，2014年他在Janelia与Legant一起建造了第一台晶格光片显微镜，据他说，这种合作代表着这些科学家通常工作方式的巨大变化。“在这种社区里很少见，以前每个人都是孤立的。”

至于李甘特，他现在正准备在北卡罗来纳大学教堂山分校建立自己的实验室。该职位将允许他继续从事细胞生物学和显微镜设计方面的工作。他的第一个项目将是重新审视细胞如何移动的问题。他说:“我们用最新的系统解决了技术问题，只是还没有机会把它应用到那个特定的问题上。”现在，他已经创造了完成这项工作所需的工具，李甘特可能最终得到了他多年来一直在追寻的答案。