智能显微镜能发现转瞬即逝的生物

老鼠的心脏每分钟大约跳动600次。随着每一次搏动，流经血管的血液都会震动大脑和其他器官。这种运动对老鼠来说并不麻烦，但对物理学家罗伯特·普雷韦德尔(Robert Prevedel)来说确实是个挑战。

Prevedel在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室设计和制造显微镜来解决研究问题。在他的案例中，问题是当器官本身在运动时，如何捕捉大脑深处的神经活动。“我们想象得越深，我们积累的畸变就越多，”他说。“所以，我们必须建造我们的显微镜来快速测量和适应。”

通常情况下，显微镜很难观察到组织中超过一毫米的地方。除此之外，光从细胞内结构反射会产生扭曲，使图像模糊——即使样本没有移动到心跳。

2021年，普雷韦德尔和他的同事设计了一种显微镜，将一种用于探测组织内部的三光子荧光成像方法与一种自适应光学系统结合起来。后一种方法最初是在天文学中发展起来的，它使用由可变形膜制成的镜子和透镜来引导光线，而不是用刚性光学材料。软件工具根据样品的变化迅速改变膜的形状，以特定的方式弯曲光线以窥视表面结构。这种“样本自适应”方法不需要人工操作，而是依靠显微镜本身实时调整光学来持续生成高质量的图像。

普雷韦德尔的显微镜必须更进一步，以补偿动物心脏跳动的振动。通过将照片与心跳同步，研究小组能够在大脑表面以下近1.5毫米的海马体区域成像细胞，比之前的工作要深0.5毫米¹．普雷韦德尔说:“看到它在比我们预期的更深的地方工作，真的很令人兴奋。”

Prevedel的显微镜只是一套智能显微镜中的一种，这些智能显微镜依赖于可变形膜等自适应光学系统，再加上机器学习方法，可以比以往任何时候都更深入地观察组织，并在关键时刻放大以捕捉细胞生命中稍纵即逝的瞬间。

这些努力通常涉及定制的硬件和软件组件，这些组件可能使更广泛的生物群落无法访问它们，这些努力正在生产不仅能产生清晰图像的工具。它们对生命系统也更温和，使研究人员能够在不损坏样品的情况下观察长时间的过程，从而扩大了显微镜的应用范围。

英国牛津大学光学系统工程师Martin Booth说:“如果你所有的研究都是在玻片上观察细胞，你就不需要自适应显微镜了。”“但如果你深入活标本数十或数百微米，这就是它真正有用的时候。”

空间和时间上的采样

凯特·麦克多尔(Kate McDole)现在是英国剑桥MRC分子生物学实验室的一名发育生物学家，对她来说，设计自适应显微镜的关键考虑因素是样金量。

作为弗吉尼亚阿什本霍华德休斯医学研究所珍妮利亚研究园区的博士后，麦克多尔和她的同事们发明了一种显微镜来研究小鼠胚胎发育过程中细胞团块如何形成复杂组织²．在发育生物学家菲利普·凯勒(Philipp Keller)的带领下，该团队希望在三天内对发育中的胚胎进行成像，在此期间，胚胎的直径从大约200微米增长到近3毫米。McDole说，胚胎固定在一端，“在微风中自由摇摆——它在移动”，它的密度和其他光学性质随着时间的推移而变化。“显微镜需要跟上所有这些，”麦克多尔说。

她和她的同事们从一种被称为同步多视图光片显微镜的技术开始，Keller的团队已经开发了这种技术来跟踪果蝇胚胎发育过程中的细胞运动。为了适应鼠标，他们改变了光学设计，并构建了软件来控制光源的角度和光学元件的位置等因素。该软件能够在收集图像时衡量图像的数据质量，并可以在整个实验中调整这些因素来优化图像。

显微技术定做

显微镜还自动检测生长胚胎在样品室中的位置，并保持其在视野的中心，调整距离以确保一致的图像质量。“许多生物标本喜欢四处游荡，所以你需要让它们集中起来，”麦克多尔说。

McDole和她的团队使用该系统在48小时内观察小鼠胚胎的发育，以单细胞分辨率对胚胎心脏和其他正在发育的器官进行成像。随后，他们对大脑类器官进行了长达两周的成像。麦克多尔说:“这是自主显微镜的未来——让显微镜决定何时、何地以及如何对特定事件起作用。”“你可以教显微镜:‘细胞分裂发生的时间是凌晨3点，我想让你放大，做点什么，然后恢复正常成像。’”

凯勒小组已经发布了建造这种仪器的原理图，该软件可以在网上免费获得go.nature.com/3huukh9)．Keller说，已经使用光片显微镜的研究人员预计将花费约3万美元为他们的系统添加这些功能。他指出，要实现深层组织、单细胞的解决方案，“这是一个相当小的额外投资”。

亚细胞尺度

智能显微镜也正在被开发用来成像更小的结构。例如，斯德哥尔摩KTH皇家理工学院的物理学家Ilaria Testa建造了一个用于观察亚细胞囊泡，当神经细胞放电时，它们在神经突触释放钙，这是信号传递的关键步骤。她说:“这些都是罕见的事件，捕捉到它们并不总是那么容易。”

一种选择是连续拍摄标本，希望能捕捉到那一刻。但是囊泡释放事件是短暂的，而且标准显微镜下的结构太小。超分辨率成像可以揭示更多的细节，但它需要高强度光源，只能在样品损坏之前短暂使用。研究小组尝试了各种延时拍摄方法，即每隔一定的时间间隔拍摄图像。但泰斯塔说，这就像观看一场足球比赛，却因为在关键时刻看向了别处而错失了一个进球。“这有点令人沮丧，”她说。“如果我们知道从哪里看，分辨率就会很好。”

为了帮助他们盯着球，泰斯塔和她的团队结合了两种显微镜方法:荧光宽视场显微镜和一种被称为刺激发射耗竭(STED)的超分辨率显微镜。他们开发了一个软件系统来控制这些显微镜模式:当软件检测到荧光变化时，系统会自动切换到更高分辨率的STED模式。这使得研究小组能够以纳米级的精度捕捉到细胞在释放钙后如何重组它们的突触囊泡^3.．泰斯塔说:“我们基本上是以一种更智能的方式指导图像的获取。”

泰斯塔说，她和她的团队花了大约两年时间来建造这台显微镜，主要使用定制的3d打印硬件。唯一的商业组件是包括目镜的上部，即显微镜头。安装费用约为20万美元，其中最昂贵的是激光，约为6万美元。但结果是一个自动化系统比研究人员试图在显微镜之间切换更有效，泰斯塔说。“我们实际上是在委托一些计算机比人类做得更好的事情。”普雷韦德尔补充说，这种设置还减少了关注生物学中真正重要的短暂时刻所需的精力。“显微镜只获得你真正关心的那几秒钟。”

扩展访问

Testa的软件是可以在GitHub上找到她的团队已经公布了硬件原理图^3.因此，这种显微镜在原则上可以被任何人使用。但她指出，这需要一种超分辨率的显微镜，而不是所有的实验室都能获得，尤其是在世界上资源贫乏的地区。

目前，使用样本自适应方法的研究人员倾向于与能够构建或修改定制显微镜的同事合作。但布斯指出，当涉及到DIY项目时，通常需要调整软件和仪器。McDole说，Keller团队花了几个月的时间来确定在他们的自适应显微镜中使用的最佳指标和计算策略。她说，即便如此，设备经常在不断地变化，而且“用户需要比使用标准商业显微镜多得多的培训”。

显微镜:你好，自适应光学

生物学家想要与工程师合作使用定制显微镜，可能只有在资金雄厚的大型大学和研究中心才能做到。细胞生物学家里卡多·亨利克斯敏锐地意识到这个问题，因为他在研究生期间在英国和南非工作的经历。

“在创造技术方面，我们所做的几乎所有事情都是为了让每个人都能接触到，”亨利克斯说，他现在在他的祖国葡萄牙里斯本的古尔本基安科学研究所领导一个研究小组。“我们特别敏感的是，在获取这些资源方面，全球南方和北方之间存在巨大差异。”

2016年，亨利克斯和他的团队设计了一种称为超分辨率径向波动(SRRF)的计算方法，将超分辨率显微镜扩展到通常广泛使用的常规荧光显微镜⁴．该方法现在依赖于机器学习方法，该方法使显微镜以高速获取图像，然后解析数据以识别荧光中样本特定的光点。用户以高速捕获100张样品图像，以最大限度地减少对荧光标签的化学损伤，即漂白，以及减少运动造成的模糊。然后，这些数据被输入一个寻找荧光变化的算法。

用于标记细胞结构的荧光分子或荧光团的亮度随其位置和其他样品性质的不同而波动。Henriques解释说:“每次(算法)捕捉到波动，它就能精确定位波动的确切中心，以及它是否来自荧光团。”“所以，它产生的东西比原来的更脆。”

晶格光片显微镜得到AO升级

显微镜学家Adán Guerrero在库埃纳瓦卡的墨西哥国立自治大学国家高级显微镜实验室是第一批采用SRRF方法的研究人员之一，选择它来探索细菌蛋白质的亚细胞位置⁵．格雷罗的研究所当时有超分辨率显微镜，但用户通常需要等待数周才能使用。格雷罗说，因为亨利克斯和他的团队已经将他们的SRRF工具作为图像处理程序ImageJ的插件发布，它可以与研究所现成的显微镜一起使用，这使得工具特别实用。他补充说，插件元素也很有价值，因为他的用户不习惯自己编写代码。“在此之前或大约同一时间，也有其他类似的技术发布，但获取数据的速度和插件使SRRF更容易使用。”

格雷罗补充说，在不需要昂贵仪器的情况下获得高质量图像的可能性对他的研究团队产生了巨大的影响。但南非开普敦大学的成像科学家Caron Jacobs警告说，用户仍然必须与生化研究或电子显微镜等其他技术交叉验证他们的图像，以避免错误。

例如，当雅各布斯在亨利克斯的实验室读研究生时，她试图想象艾滋病毒是如何与被病毒感染的免疫细胞(称为T细胞)表面的蛋白质受体结合的。在使用SRRF后，雅各布斯和她的同事们看到了一个独特的“蜂窝状晶格”——但研究小组知道，蛋白质受体实际上是均匀分布的。雅各布斯说:“当我们看到蜂窝状的图案时，我们知道它是人工制品。”“但如果你不了解潜在的生物学，就有可能认为它是真实的。”

显微镜制造商将越来越大的生物样本置于聚光灯下

Henriques的团队开发了另一种名为SQUIRREL(超分辨率定量图像评级和错误位置报告)的计算工具，允许用户检查他们的图像是否存在此类人工因素⁶．但是类似的问题也会发生在任何高计算强度的显微镜技术中，雅各布斯说，他现在帮助生物学家对大范围的样品进行成像。当学生向她寻求关于超分辨率或其他显微技术的建议时，雅各布斯鼓励他们思考他们想要的数据。“如果你深入研究科学问题，十有八九他们不需要这两种方法——只需要好的宽视场显微镜和样品制备策略。”

但如果一个样本被证明特别敏感，或者生物学似乎很难确定，或者你正在筛选大量数据以找到一个有趣的时刻，可能值得考虑一种自适应方法，普雷韦德尔说。

所有人的工具箱

布斯说，原则上，样本自适应系统可以整齐地安装在现有的显微镜上，但自适应光学元件目前太大，无法安装在商用显微镜上。他说:“由于身体上的限制，这是一个挑战。”“你已经有了一个设计好的显微镜，你必须以某种方式在它中间添加这些光学器件。”

他补充说，这些设备的成本可能在2万美元到5万美元之间，因此必须降低成本，才能让这种工具得到广泛使用。控制自适应光学的软件也需要改进。“有几件事限制了这些技术的广泛应用，”在巴黎Imagine Optic工作的光学工程师法布里斯·哈姆斯(Fabrice Harms)说，他是少数几家生产各种样本自适应系统的公司之一。但是大多数显微镜不能像泰斯塔的显微镜那样在不同的模式之间切换。哈姆斯说:“在任何成像条件下都能提供更好图像的强大系统目前还没有实现工业化。”

布斯说，如果这些障碍能够被克服，这项技术的覆盖面就会扩大。不是每个人都需要它，但对于那些需要它的人来说，可以根据镜头下的样品进行调整的智能显微镜可以决定实验的成败。普雷韦德尔说:“如果人们对他们的数据满意，就没有必要改变任何东西。”“但如果你对自己的数据感到非常沮丧，那么你应该考虑采用样本自适应方法。”