tRNA的基于结构的机制和逆转录病毒RNA在引物退火改造gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,MLV数控序列描述了锌指基氨基- carboxy-terminal尾巴。gydF4y2BabgydF4y2Ba显示的一般机制,卡通表示ATP-independent陪伴。gydF4y2BacgydF4y2Ba、卡通的代表的E - b形式U5-PBS基因组RNA,包括二级结构Ψ-genome包装信号,颜色为红色(见高亲和性的网站gydF4y2Ba补充讨论1gydF4y2Ba)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,ITC MLV NC数据绑定到本地U5-PBS-B(黑)和站点1突变体(V1gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba,红色)形式。,原始ITC数据80年1.5µl滴定µM数控进5µM RNA在30°C。底,数据集成峰值后,连续黑线代表适合一个网站绑定模型。消除的网站V1 U5-PBS b形式完全废除了绑定。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2BaITC数据显示弱结合数控艾滋病毒U5-PBS RNA和tRNA HIVgydF4y2Ba^{赖氨酸3gydF4y2Ba}底漆。gydF4y2BaggydF4y2Ba部分二维NOESY谱中收集的DgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO显示免费的tRNA的叠加gydF4y2Ba^{赖氨酸3gydF4y2Ba}底漆(黑色)和0.5版的MLV数控(红色)。缺乏化学位移扰动表明没有任何两个分子之间的相互作用。gydF4y2BahgydF4y2Ba模型在MLV引物退火和hiv - 1:在MLV(左),高亲和性结合数控领域(红色)U5-PBS插科打诨的病毒基因组和tRNA的区域gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba底漆促进tRNA退火在宿主细胞的胞质病毒出芽。进一步支持该模型的证据是MLV tRNA病毒粒子只是稍微丰富gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba底漆(见gydF4y2Ba补充讨论1gydF4y2Ba)。在hiv - 1(右),数控不高亲和力结合U5-PBS域或底漆tRNAgydF4y2Ba^{赖氨酸3gydF4y2Ba}。此外,tRNAgydF4y2Ba^{赖氨酸3gydF4y2Ba}底漆是hiv - 1病毒粒子(见高纯度gydF4y2Ba补充讨论1gydF4y2Ba),导致引物退火后病毒出芽,由弱,非特异性的相互作用与病毒和hiv - 1数控底漆rna。为了简单起见,只有一两个打包逆转录病毒基因组复制。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba上面的部分gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH 2 d NOESY谱显示imino-to-imino不U5-PBS RNA。数据被收集在10°C在10毫米氯化钠和10毫米三(pH值5.0)。Imino-to-imino连接性上阀杆所示的橙色,而较低的茎蓝色所示。插图,二级结构U5-PBS构造用于结构和生化研究。灰色残留显示非职位:G96C: C157G碱基对代表一个碱基对交换改变了援助的明确的作业否则连续5 g,添加终端g c碱基对是转录效率的目的和SmaI DNA模板的消化。底部的部分gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN维HSQC光谱gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN,gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-labelled U5-PBS。U -亚氨基的共振和G-labelled样本显示,配备标签样本和氨基共振。的一个gydF4y2Ba_{98年gydF4y2Ba}氨基共振有异常在前场的化学变化与G的交互gydF4y2Ba_{155年gydF4y2Ba}在螺旋。G的堆积相互作用的形成gydF4y2Ba_{155年gydF4y2Ba}是显示在右边的放大插图。叠加也证实了GgydF4y2Ba_{155年gydF4y2Ba}到UgydF4y2Ba_{156年gydF4y2Ba}在D散步gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO 2 d NOESY谱(数据未显示)。gydF4y2BabgydF4y2Ba,部分gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH 2 d NOESY亚氨基的频谱叠加U5-PBS构造和没有G96C: C157G碱基对交换。没有改变的imino-to-imino连接性观察RNA除了在预期的突变(盒装区域所示)。事实上,GAgydF4y2Ba_{98年gydF4y2Ba},顾gydF4y2Ba_{156年gydF4y2Ba}立即膨胀高于g c交换有精确的化学变化,线宽度等等在这两种结构,证明他们有类似的二级结构。重要的是,也获得了类似的绑定与数控蛋白质的紧密联系的结构。gydF4y2BacgydF4y2BaU5-PBS NMR合奏对齐:最低琥珀的整体结构。他们是一致的部分(左)或底部部分(右)的分子。数控结合位点V1 (UCUGgydF4y2Ba_{110年gydF4y2Ba})和V2 (UCAGgydF4y2Ba_{130年gydF4y2Ba})所示红色和橙色,分别。左对齐的残留112 - 125和132 - 144年的根均方偏差(r.m.s.d)值为0.6±0.2。正确,对齐的残留94 - 106和147 - 159年,排除G155,似乎从一个数据表现出多种构象。结果r.m.s.d.底部残留的对齐是1.2±0.5。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、三维NOESY-HMQC脱衣舞的情节gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-editedgydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH飞机CgydF4y2Ba_{128年gydF4y2Ba}和一个gydF4y2Ba_{129年gydF4y2Ba}芳香和H1′质子。不从gydF4y2Ba_{129年gydF4y2Ba}H8前CgydF4y2Ba_{128年gydF4y2Ba}核糖质子表明叠加两个残基间相互作用。相比之下,小构造填充在数控绑定不产生任何inter-residue不(数据没有显示)。gydF4y2BabgydF4y2Ba、结构的UCAG tetraloop。的U-G氢键,特点UNCG tetraloops,绿色所示。gydF4y2BacgydF4y2Ba之间缺乏不UgydF4y2Ba_{121年gydF4y2Ba}和一个gydF4y2Ba_{122年gydF4y2Ba}表明在常规叠加这两个残基之间的相互作用。带块gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-editedgydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH飞机对你gydF4y2Ba_{121年gydF4y2Ba}H2′和gydF4y2Ba_{122年gydF4y2Ba}从三维NOESY-HMQC光谱显示H2。美国gydF4y2Ba_{121年gydF4y2Ba}H2′- cgydF4y2Ba_{123年gydF4y2Ba}一直一个gydF4y2Ba_{122年gydF4y2Ba}H2-GgydF4y2Ba_{135年gydF4y2Ba}H1′远程不以红色表示。gydF4y2BadgydF4y2Ba,一个gydF4y2Ba_{122年gydF4y2Ba}隆起形成一个三重基本交互。氢键所示绿色,和一个gydF4y2Ba_{122年gydF4y2Ba}H2-GgydF4y2Ba_{135年gydF4y2Ba}H1′距离是由一个黑色实线表示。gydF4y2BaegydF4y2Ba,带块gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC编辑gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH飞机从三维NOESY HMQC U5-PBS光谱,显示interresidue NOE连接性。黑色虚线显示顺序inter-residue连接性,而橙色线表示远程交互。强克gydF4y2Ba_{110年gydF4y2Ba}H8-to-H1′intraresidue挪亚的象征gydF4y2BasyngydF4y2Ba糖苷的扭转角。残留在PBS和数控结合位点与蓝色和红色标记,分别。gydF4y2BafgydF4y2Ba,最低琥珀(UCUGA的结构gydF4y2Ba_{111年gydF4y2Ba},UUgydF4y2Ba_{146年gydF4y2Ba})内部循环,显示你的灵活性gydF4y2Ba_{107年gydF4y2Ba}由于缺乏inter-residue不。对齐的残留108 - 111和144 - 146年收益率的r.m.s.d. 0.8±0.3。gydF4y2BaggydF4y2Ba从三维NOESY-HMQC光谱收集,部分选择性地标记gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-U5-PBS。ribose-zipper图案作为证据,强烈的H1′H1′inter-residue连接性之间观察到U146 C108,位于反链。gydF4y2BahgydF4y2Ba从三维NOESY-HMQC光谱收集,部分选择性地标记gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-U5-PBS与数控复杂。核糖和芳香质子UgydF4y2Ba_{146年gydF4y2Ba}不产生任何inter-residue不,表明缺乏UgydF4y2Ba_{146年gydF4y2Ba}与邻近的残留物。的插图隆起地区的二级结构可视化显示的可用性尿嘧啶发布。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,gydF4y2BajgydF4y2Ba,gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC二维HMQC光谱收集与0(黑色)和0.9(红色)数控的等价物。G的扰动gydF4y2Ba_{155年gydF4y2Ba},你gydF4y2Ba_{156年gydF4y2Ba}对小信号(星号)构象由虚线所示。蓝色星号表明新释放的出现尿苷共振后数控。gydF4y2BakgydF4y2Ba,特定扰动的GgydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba}被选择性的亚氨基的诺克吗gydF4y2Ba_{101年gydF4y2Ba}。gydF4y2BalgydF4y2Ba部分二维NOESY谱收集在D2O 1:1Ψ-packaging signal-NC复杂(黑色)和U5-PBS-NC复杂(红色)。两个数据集的完整匹配表明,类似于Ψ-NC交互gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba,数控反面继续存在在一个随机线圈确认复杂的形成。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2BaITC NC数据交互,U5-PBS域(单体的形式;看到gydF4y2Ba补充讨论1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba),以及各自的突变体rna (V1gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= G110U;V2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= G130A;T1gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= G9A;T2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= G35A G36A G37A;T3gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba不是自G23是一个关键基础三)的一部分。的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba值三个独立实验的平均值,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3。连续线代表适合2 - 3 three-site U5-PBS和tRNA绑定模型gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba,分别。正如所料,V1gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba是符合一个网站绑定模型,而V1gydF4y2Ba_米gydF4y2BaV2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba消除数控绑定。同样,T1gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba和T2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba符合two-site绑定模型,而T1吗gydF4y2Ba_米gydF4y2BaT2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba是符合一个网站绑定模型。熵值计算使用gydF4y2BaTgydF4y2Ba= 303 K。的净收益在焓熵(绿色)和损失(红色)网站T2的长篇tRNA所示gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba在比较孤立的反密码子SLgydF4y2Ba_{交流gydF4y2Ba}RNA。锌指所带来的有利的焓tRNA与反密码子的互动循环gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba(ΔgydF4y2BaHgydF4y2Ba=−14.2千卡摩尔gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是抵消损失焓的RNA元素之外的反密码子茎(损失9.8千卡摩尔gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),因此,一个重要的补偿(增益为11.5千卡摩尔gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是观察(见gydF4y2Ba补充讨论7gydF4y2Ba)。gydF4y2BacgydF4y2Ba,滴定数控tRNA的混合物gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba和U5-PBS。通道1、2、3和4对应1、2、3和4数控的等价物。添加四等价物数控tRNA的混合物gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba和U5-PBS导致几乎完全退火的分子。对于这个实验,U5-PBS二聚的构造,因为使用功能分析,整个18-nucleotide引物结合位点是必需的。核磁共振研究构造,然而,表明构造与单体的形式处于平衡状态。这个实验表明,只有少数NC分子必须产生一个功能复杂。gydF4y2BadgydF4y2Ba,逆转录heat-annealed与NC-annealed U5-PBS-tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba起始复合物。10-nucleotide DNA产品是通过逆转录酶转录终止后将ddCTP位置10(以及随后的tRNA核苷酸由核糖核酸酶治疗)。gydF4y2BaegydF4y2BatRNA, ITC NC数据绑定gydF4y2Ba^箴gydF4y2BaT2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba(AGGGgydF4y2Ba_37gydF4y2Ba是突变AAAA级gydF4y2Ba_37gydF4y2Ba)。gydF4y2BafgydF4y2BaITC数据确认基本不需要修改数控绑定。ITC数据(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)很适合一个网站绑定模型。gydF4y2BaggydF4y2Ba包装试验证实,突变不影响基因组衣壳化(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)。作为一个积极的控制,观察到的减少对Ψ(C331G)控制类似于先前观察到的gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba,non-template控制(NTC)展品没有病毒RNA信号。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba二维gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba孤立的反密码子茎环H NOESY谱(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和全身的tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba)结构,用蓝线表示国际米兰,intra-residue aromatic-to-H1′NOE连接性(见也gydF4y2Ba补充讨论4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba二维gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH NOESY谱的孤立acceptor-TΨC-stem循环(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和全身的tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba)结构,用黑色和红色线表示国际米兰,intra-residue aromatic-to-H1′NOE连接性受体茎和TΨC-stem循环,分别(见也gydF4y2Ba补充讨论4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba光谱的孤立D-stem循环(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和全身的tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba)结构,用线条表示国际米兰,intra-residue aromatic-to-H1′NOE连接性。D-stem循环中残留的化学变化极大地改变的长篇tRNA由于形成多个远程D-stem循环之间的相互作用和其他地区tRNA的三级结构gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba。gydF4y2BacgydF4y2Ba,极端tRNA的敏感性gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba对温度肘部三级互动。在更高的温度下,D-stem循环失去TΨC-loop远程互动,和化学变化与D-stem循环的孤立的形式(见gydF4y2Ba补充讨论4gydF4y2Ba)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba,tRNA的敏感性gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba肘部三级互动二价镁盐。美国的数据显示,在前场的转变gydF4y2Ba_54gydF4y2Ba基地TΨC-loop和G的特征信号gydF4y2Ba_16gydF4y2BaGgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba随着D-loop变得结构出现在肘部交互形成。相比之下,右下角的面板显示了孤立TΨC循环不敏感的二价盐(见也gydF4y2Ba补充讨论4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,为全身tRNA亚氨基的共振gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba表明适当的三级结构的形成。的部分gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaU - N维HSQC光谱(顶部)和G-labelled长篇tRNA(中心)gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba结构,包括亚氨基的作业。的一部分gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH 2 d NOESY谱显示imino-to-imino不显示在底部。gydF4y2BabgydF4y2Ba,2 d NOESY GgydF4y2Ba^HgydF4y2BaT2的样本gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba构造中只有鸟苷使质子化和其他三个核苷酸氘。这个突变体被选为明确分配G共振D-loop和变量循环通过减少光谱的复杂性G-rich反密码子循环。gydF4y2BacgydF4y2Ba,从完全质子化了的和G-protonated条二维NOESY谱显示D-loop-TΨC交互(见的直接证据gydF4y2Ba补充讨论4gydF4y2Ba)。左边的面板显示了低温收集的数据让我们确认远程作业,因为一个gydF4y2Ba_58gydF4y2BaH1′一个G的芳香质子自旋扩散gydF4y2Ba_19gydF4y2Ba通过GgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba。gydF4y2BadgydF4y2Ba条,从完全质子化了的示例显示了一个从D-stem走循环残留GgydF4y2Ba_15gydF4y2Ba形成的关键列维特与C碱基对gydF4y2Ba_48gydF4y2Ba。这样的安排会导致一个不同寻常的C在前场的转变gydF4y2Ba_48gydF4y2BaH1′(见gydF4y2Ba补充讨论4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba的包装gydF4y2Ba_7gydF4y2Ba对酪氨酸28侧链质子导致在前场的H5和H1′质子的转移gydF4y2Ba_7gydF4y2Ba。分子间不特点的第四个G NNNG主题进入数控锌指蛋白的疏水口袋也观察到GgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba的GUUGgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba。r (GUUG)构造tRNA基本上给同样一个模式gydF4y2Ba^箴gydF4y2BaGUUGgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba在与数控交流,被用作指导作业。这种技术已经使用以前的genome-Ψ-packaging-NC复杂。的tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2BaT2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba构建用于现场作业,因为它没有影响T1绑定但允许明确的作业;也就是说,它可以确保没有数控绑定到第二网站1:1滴定。然而,我们已经证实通过HMQCs相同网站绑定化学变化中观察到本地T1和T2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba突变体。gydF4y2BabgydF4y2Ba部分二维NOESY谱收集为0(黑色)和0.3(红色)数控等价物。选择性扰动之间的螺旋走10号和11号anti-PBS残留,gydF4y2Ba^{−10gydF4y2Ba}CgydF4y2Ba_{67年gydF4y2Ba}和gydF4y2Ba^{−11gydF4y2Ba}一个gydF4y2Ba_{66年gydF4y2Ba},所示。相比之下,典型的小沟的连接gydF4y2Ba_{69年gydF4y2Ba}H2显示相邻分子内的保护协会第七(gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}GgydF4y2Ba_{68年gydF4y2Ba})、八(gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}一个gydF4y2Ba_{69年gydF4y2Ba})和9 (gydF4y2Ba^{−9gydF4y2Ba}GgydF4y2Ba_{70年gydF4y2Ba})anti-PBS残留。gydF4y2BacgydF4y2Ba,部分二维NOESY谱显示H8 / H1′选择性质子化了的T2的相关性gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba- ggydF4y2Ba^HgydF4y2BatRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba样本。T2数据gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba构建显示证明只观察到的结构变化是由于数控绑定网站T1而不是网站T2。仅增加0.1数控等效的结果直接微扰的具体信号(GgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba和GgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba),确认第一数控结合位点的位置。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba部分二维NOESY谱收集0(黑色)和0.3(红色)数控等价物,显示保存的叠加D-stem和反密码子之间的相互作用(gydF4y2BaegydF4y2Ba),而受体之间的行走阀杆和TΨC茎中断(gydF4y2BadgydF4y2Ba)。gydF4y2BafgydF4y2Ba部分二维NOESY谱中收集的DgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO为1:1(黑色)和tRNAΨ-packaging-signal-NC复杂gydF4y2Ba^箴gydF4y2BaT2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba数控复杂(红色)。两个数据集的完整匹配表明,类似于Ψ-NC交互,数控反面继续存在的无规卷曲构象复杂地层gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。gydF4y2BaggydF4y2Ba、特征分子间不从GgydF4y2Ba_37gydF4y2Ba残留的反密码子AGGGgydF4y2Ba_37gydF4y2Ba数控锌指结合位点。孤立的反密码子(SL)构造基本上给网站T2 tRNA一样的一个模式gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba对与数控交流有约束力。然而,这种模式是观察到的只有在滴定的tRNA数控超过1:1gydF4y2Ba^箴gydF4y2Ba构造,展示顺序绑定参与NC-mediated改造。gydF4y2BahgydF4y2Ba、特征分子间不从GgydF4y2Ba_23gydF4y2Ba从UAUG残留gydF4y2Ba_23gydF4y2Ba数控锌指结合位点。的tRNAgydF4y2Ba^箴gydF4y2BaT1gydF4y2Ba_米gydF4y2BaT2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba构造一个模式是一个精确匹配与NC-r (UAUG)gydF4y2Ba_23gydF4y2Ba复杂,明确确认第三数控结合位点,T3。三角洲的酪氨酸28质子质子数控蛋白质显示一个分子间NOE downfield-shifted H5质子的UgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba,这表明包装对酪氨酸28侧链RNA质子质子。此外,分子间不存在特征H8质子之间的GgydF4y2Ba_23gydF4y2BaTrp 35芳香H5和类推质子表示插入特定的GgydF4y2Ba_23gydF4y2Ba的疏水口袋锌关节领域的数控蛋白质。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,数控必将tRNA的结构gydF4y2Ba^箴gydF4y2BaT1gydF4y2Ba_米gydF4y2BaT2gydF4y2Ba_米gydF4y2Ba。gydF4y2Ba