文摘
回复m . Schwarzlanderet al。自然514年10.1038 / nature13858 (2014)
在同期发表的一篇评论1,Schwarzlanderet al。挑战我们的最近的研究2因为他们未能重现我们之前发现的荧光强度净化循环排列黄色荧光蛋白(cpYFP)增加氧气和超氧化物阴离子反应由黄嘌呤(X) +黄嘌呤氧化酶(XO)3。从“完全减少”状态(孵化与10毫米二硫苏糖醇> 3 h)在75毫米玫瑰的存在,我们证明了cpYFP展品双重荧光增加氧化后,和一个额外增加两倍后,后续的X + XO,不能占全身的溶剂(氢氧化钾)碱性化。此外,黄嘌呤+黄嘌呤oxidase-induced cpYFP增加荧光逆转了铜/锌超氧化物歧化酶(600 U ml−1)。我们还发现,完全的荧光强度降低cpYFP >四倍和1毫米aldrithiol孵化后增加。值得注意的是,重组cpYFP纯化没有二硫苏糖醇治疗展品高荧光与充分的氧化状态,指示的高敏感性cpYFP在非还氧化环境3。因此,确保一个完全减少状态cpYFP探头感应超氧化物是至关重要的在体外。这个属性可能是原因,像一个可逆超氧化物生物传感器探测功能容易当目标减少线粒体基质的环境。不幸的是,简要描述的方法和Schwarzlander提供的有限的数据et al。1,它是不可能的,以确定cpYFP完全减少在他们的实验中,是否采取了足够的预防措施来防止氧化的调查。此外,在我们的实验cpYFP表达大肠杆菌BL21 (DE3)赖氨酸细胞,而Schwarzlanderet al。1使用大肠杆菌折纸,trxB(硫氧还蛋白还原酶)突变株,还缺乏谷胱甘肽还原酶需要完全限制半胱氨酸氧化4,这可能会导致增加氧化状态的纯化cpYFP呈现超氧化物没有响应。
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程,H。,Wang, W., Wang, X.et al。程et al。回复。自然514年E14-E15 (2014)。https://doi.org/10.1038/nature13859
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