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实时观察RNA聚合酶II转录的起始

自然体积525，页面274 - 277 (2015）引用本文

主题

摘要

生物化学和结构研究表明，RNA聚合酶II转录的起始在以下几个阶段进行:聚合酶与一般转录因子和启动子DNA在一个“封闭的”起始前复合物(PIC)中组装。1，2；启动子DNA的大约15个碱基对展开，形成一个“开放”复合体3.，4；向下游扫描到转录起始位点;合成一个短的转录本，被认为大约有10个核苷酸长;启动子逃逸。在这里，我们组装了一个32个蛋白质，1.5百万加仑的PIC5来自酿酒酵母，并利用光镊实时观察后续起爆过程6．与预期相反，扫描是由转录因子IIH驱动的7，8，9，10，11，12包括一个扩展的转录泡的快速打开，平均85个碱基对，伴随着整个扩展泡长度的转录本的合成，随后是启动子逃逸。未能实现启动子逃逸的pic形成开放复合体和扩展气泡，气泡塌陷回闭合或开放复合体，导致重复徒劳扫描。

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图1:辅助负载试验中的转录起始。
图2:阻碍负载试验中的转录起始。
图3:TFIIH运动的记录SNR20*在阻碍负载试验中存在rntp的短结构。

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下载参考

确认

我们感谢A. Chakraborty和B. Milic仔细阅读手稿P.-J。Mattei在蛋白质纯化方面的帮助，R. Landick和J. Gelles进行讨论。本研究由美国国立卫生研究院资助，GM36659和AI21144授予R.D.K.， GM57035授予S.M.B, NSF研究生奖学金授予F.M.F.

作者信息

作者指出

  1. 吴克群村上

    现地址:†现地址:宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和分子生物物理系，费城，宾夕法尼亚州，19104，美国

  2. 法扎尔(Furqan M. Fazal)、康(Cong A.孟)和村上建二(Kenji Murakami):这些作者对这部作品做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

  1. 斯坦福大学应用物理系，美国加利福尼亚州斯坦福94305

    弗坎·m·法扎尔和史蒂文·m·布洛克

  2. 斯坦福大学化学系，美国加利福尼亚州斯坦福94305

    Cong A.孟

  3. 斯坦福大学结构生物学系，斯坦福，94305，加利福尼亚州，美国

    村上健二和罗杰·科恩伯格

  4. 斯坦福大学生物学系，斯坦福，94305，加利福尼亚州，美国

    史蒂文·m·布洛克

作者
  1. 弗坎·m·法扎尔
    查看作者出版物

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  2. Cong A.孟
    查看作者出版物

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  3. 吴克群村上
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  4. 罗杰·d·科恩伯格
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  5. 史蒂文·m·布洛克
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贡献

F.M.F.、C.A.M.和K.M.在S.M.B.和R.D.K.的指导下设计实验，F.M.F.和C.A.M.收集单分子数据。K.M.对PIC组分进行了纯化和重组，并进行了批量实验。F.M.F.分析了单分子数据，C.A.M.和K.M.进行了建模。F.M.F C.A.M。,K.M S.M.B.和R.D.K.写道。

相应的作者

对应到罗杰·d·科恩伯格或史蒂文·m·布洛克．

道德声明

相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

扩展的数据图形和表格

扩展数据图1集成了29个部件的PICSNR20*短启动子。

一个，在不含激酶结构域(TFIIK)的PIC上组装SNR20*短(邻近2.7 kb下游手柄序列)，并沉积在甘油梯度上;采用SDS-PAGE对各组分进行分析。b，对分数12的结果进行了详细的注释，表明所有的PIC组分都被保留，证实了复合物完全由组分蛋白重组而成。Pol II的亚基标记为黑色，TFIIF标记为蓝色，TFIIE标记为洋红色，TFIIH标记为橙色，TFIIA标记为青色，TFIIB标记为红色，TBP标记为浅绿色，Sub1标记为深绿色。后来将TFIIK (3-subunits)添加到PIC中。

扩展数据图2哑铃组装示意图，横截面。

PICs通过生物素亲和素键(黄色)连接到一个珠子上。为了形成哑铃系带，一小部分PICs的另一端(4%)具有地高辛键，可以通过2.7 kb DNA手柄系到抗地高辛包被的珠(黑色和棕色)上。不参与系索形成的PIC有助于提高PIC组分的局部浓度。

扩展数据图3单分子实验条件下的径流转录。

一个，分离的PICs (0.1 pmol)，形成于SNR20*短启动子片段融合到转录模板(覆盖区域- 62/+636)，并附着在2.7 kb DNA柄上，与组装在PICs上的越来越多的PICs结合SNR20*短启动子，但无手柄，以下称为PIC(−62/+96)。这些成分用等体积的2倍NTP溶液(10 ml)孵育，其中含有1.6 mM ATP, 1.6 mM GTP, 1.6 mM CTP, 40 mM UTP和0.83 mM [α-]32P] UTP (2.5 μCi)。凝胶电泳分析得到的转录本。融合到DNA柄的PIC不能单独支持转录(通道1)，但当反应中添加4倍(通道2)、8倍(通道3)、12倍(通道4)或15倍(通道5)的PIC(−62/+96)时，转录活性恢复(红色箭头)。在第6通道，反应中含有1.5 pmol PIC(−62/+96)。从PIC(−62/+96)流出的96 nt转录显示(黑色箭头)。25倍过量PIC(−62/+96)用于单分子测定(扩展图2）.b将1.5 pmol等份的PIC(−62/+96)引入到不同体积的转录缓冲液中，使PIC的测定浓度在37 nM至4.5 nM之间变化。转录效率(流出带，黑色)随着PIC浓度的增加而降低∼18%到2-3%。单分子分析中使用的低浓度(<1 nM)不能直接使用凝胶进行分析，但我们预计转录效率也相应较低。

扩展数据图4 TFIIH扫描记录SNR20*长rntp或dATP。

一个，b如:SNR20*短(图3)，较长的启动子显示TFIIH与两个rNTPs (一个)或只提供dATP (b)，之后PIC解离(黑色箭头)，或者气泡坍缩到闭合复合体(蓝色和绿色记录)或打开复合体(灰色线)，TFIIH再次移动。虚线表示TSS(+1)的位置。

扩展数据图5 PIC上的核酸外切酶III足迹分析SNR20 *长。

在没有核苷酸的情况下在体外， PIC复合物结合到SNR20 *长启动子产生的障碍外切酶III消化定位∼TATA盒子下游50 bp处(距离TSS约- 40个核苷酸，黑色箭头)。这些障碍取决于TFIIH以及与TFIIH相互作用的TFIIE的存在。加入dATP后，势垒消失，暂停位置的波段在−30和+30之间增强(∼塔塔箱、支架下游60-120 bp)。

的转录起始途径SNR20*长(左)和SNR20*短(右)促销员。

左图为起始路径的模型SNR20 *漫长的启动子。从顶部开始的状态:带有gtf(蓝色)和Ssl2(橙色)的Pol II(米色)以“闭合”形式结合到DNA模板上TSS(箭头)上游的启动子元件(绿色和蓝色线)。标出了酶活性位点(白色圆圈打开)和TATA框(黑色方块关闭)的位置。TFIIH的unwind产生一个开放的复合物(OC)，导致气泡的形成。在TFIIH的驱动下，扫描导致开放复合体到达TSS，形成一个延伸的气泡(虚线表示单链DNA的推测位置)。如果复合物不能识别TSS，它就会被TFIIH驱动，导致“快速状态”，不产生RNA，但以大约两倍于正常速度的速度前进(黑箱;看到文本)。当Pol II识别TSS时，它开始转录RNA(红线)，对应于ITC。ITC的形成导致气泡破裂，随后是gtf的损失并过渡到伸长复合体(EC)。对，对应的起始路径模型SNR20 *短的启动子。类似的状态SNR20 *长。在这种情况下，开放复合体不需要扫描TSS，这是在其DNA足迹中发现的。因此，一旦活性位点识别了TSS, ITC就可以形成并开始RNA合成。因此，在向延伸复合物(EC)过渡之前，可以产生更长的RNA片段。

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法扎尔，F.，孟，C.，村上，K.。et al。实时观察RNA聚合酶II转录的起始。自然525， 274-277(2015)。https://doi.org/10.1038/nature14882

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