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结构洞察吨复杂的能量传导的作用

自然体积538年,页面60 - 65 (2016年)引用这篇文章

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在革兰氏阴性细菌外膜转运蛋白导入养分耦合到一种内在膜蛋白复合物称为吨复杂。吨复杂由TonB、ExbB ExbD,并使用质子动力在内膜转换能量通过TonB外膜。在这里,我们结构描述的吨复杂大肠杆菌使用x射线结晶学、电子显微镜、双电子共振(鹿)光谱,和交联。我们的研究结果揭示了化学计量组成的五聚物ExbB, ExbD的二聚体,和至少一个TonB。电生理学研究表明,吨复形形式pH-sensitive cation-selective渠道,并提供洞察的机制也许利用质子动力来产生能量。

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图1:ExbB低聚物的结构。
图2:ExbB-ExbD的结构Δperi复杂。
图3:低聚物的状态中的ExbB吨复杂。
图4:内ExbD吨的低聚物的状态复杂。
图5:频道吨复形的属性。

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坐标和ExbB / ExbD复合物的结构因素已经存入蛋白质数据库(PDB加入代码5 sv0和5 sv1)。

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  • 2016年10月05

    报道的小更改标签剩余113距离,和鹿光谱部分的方法。

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确认

我们感谢的人员SER-CAT和通用汽车/ CA-CAT beamlines先进光子源(APS),阿贡国家实验室(APS的使用是由美国能源部科学办公室,办公室基本能源科学,号合同下。w - 31 - 109 - eng - 38岁,美国能源部,基础能源科学、科学、办公室号合同下。DE-AC02-06CH11357);beamlines 5.0.1及8.2.1捏了一把汗,推进光源在劳伦斯伯克利国家实验室的援助晶体筛选(支持的先进光源主任办公室,办公室基本能源科学,美国能源部号合同下。DE-AC02-05CH11231);g . Jeschke(苏黎世ETH)提供q波段谐振器;t . Assafa再现性测量;资金的德意志Forschungsgemeinschaft AWG E580 q波段光谱仪(本月130/972-1 FUGG);y李在研究所/国家卫生研究院蛋白质/肽测序设施进行质谱分析;Lloubes团队的成员,大肠Cascales j . Sturgis和j.p. Duneau讨论。 N.N. is supported by the Department of Biological Sciences, Purdue University and by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (1K22AI113078-01). E.B. is supported by the Cluster of Excellence RESOLV (EXC 1069) funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft. W.A.C. is supported by the NIH (NIH GM 038323) and the Henry Koffler Professorship at Purdue University. H.C. and R.L. are funded by the Centre National de la Recherche Scientifique, the Aix-Marseille Université and grants from the Agence National de la Recherche (BACMOLMOT [ANR-14-CE09-0023]) and from Projets internationaux de coopération scientifique (PICS05853). H.C., T.J.B., I.B. and S.K.B. are supported by the Intramural Research Program of the NIH, NIDDK.

作者信息

作者指出

  1. Herve西莉亚和尼古拉斯Noinaj:这些作者的贡献同样这项工作。

作者和联系

  1. Laboratoire d 'Ingenierie des情况Macromoleculaires UMR7255科学研究所/法国的大学、研究所de Microbiologie de la地中海,马赛,法国13402年,Cedex 20日

    Herve西莉亚和罗兰Lloubes

  2. 国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所,国立卫生研究院,20892年,美国马里兰州贝塞斯达

    Herve西莉亚,什特宝途,特拉维斯·j·巴纳德和苏珊·k·布坎南

  3. 生物科学,马基结构生物学中心和普渡大学的研究所炎症,免疫学和传染病,普渡大学西拉法叶,47907年,印第安纳州,美国

    斯坦尼斯拉夫·d·尼古拉斯•Noinaj Zakharov &威廉·a·克莱默

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    艾瑞卡Bordignon

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    艾瑞卡Bordignon

  6. Departamento de Cirugia实验研究院Investigacion医院拉巴斯(IdiPAZ),散步de La Castellana 261年马德里,28046年,西班牙

    莫妮卡Santamaria

作者
  1. Herve西莉亚
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  2. 尼古拉斯Noinaj
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  3. 斯坦尼斯拉夫·d·Zakharov
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  4. 艾瑞卡Bordignon
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  5. 什特宝途
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  6. 莫妮卡Santamaria
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  7. 特拉维斯·j·巴纳德
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  8. 威廉·a·克莱默
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  9. 罗兰Lloubes
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  10. 苏珊·k·布坎南
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贡献

硕士准备ExbB野生型构造。H.C.,N.N., T.J.B., and R.L. prepared ExbD constructs and mutants of ExbB and ExbD. T.J.B. prepared the TonB constructs. H.C. performed all expression and purification for assays, electron microscopy, DEER spectroscopy, electrophysiology, and crystallization. H.C. and N.N. performed crystallization and H.C., N.N., and I.B. did screening and data collection. N.N. solved the initial crystal structure using crystals grown by H.C. H.C. performed the electron microscopy experiments. E.B. performed the DEER spectroscopy experiments. S.D.Z. and W.A.C. performed the electrophysiology experiments. All authors analysed and discussed the data. R.L., W.A.C., and S.K.B. conceived the original projects. H.C., N.N., S.D.Z., W.A.C., R.L. and S.K.B. contributed to writing the manuscript.

相应的作者

对应到尼古拉斯Noinaj,罗兰Lloubes或苏珊·k·布坎南。

道德声明

相互竞争的利益

作者声明没有竞争的经济利益。

额外的信息

审核人信息

自然由于h . Mchaourab t Walz,另一个匿名的评论家(s)为他们的贡献的同行评审工作。

扩展数据数据和表

图1扩展数据结构确定为吨复形(ExbB-ExbDΔperi5.2)使用Se-SAD决议。

一个吨复形的,最初的结构解决了Se-SAD使用各向异性数据扩展到5.2一项决议。两个晶体的数据处理Xia2和最初的网站发现使用HKL2MAP v0.3,每~ 10000尝试找到一个单一的解决方案;分辨率的限制同样重要的是寻找一个解决方案。b,网站输入AUTOSOL /凤凰网站优化和密度改性,生产密度地图(蓝色网),清楚地显示5倍对称和允许一个单体的初始模型建立,几乎完全由α-helices组成。这个模型被用作分子替代搜索模型解决原生2.6结构(数据从单晶获得)。c,异常不同的地图(橙色网)显示硒站点密度在5.2 Se-incorporated结构。

扩展数据图2代表本地吨复形(ExbB-ExbD电子密度Δperi2.6)解决决议。

一个电子密度图(2,代表Fo−Fc波状外形的1.0σ灰色的网;2Fo−Fc省略地图轮廓线,(省略残留113 - 124)为1.0σ、红色网)残留在螺旋α5 113 - 124。b,跨膜孔隙的剖视图ExbB(灰色丝带)从本机结构在pH值7.0显示环状的密度差(绿色等值面,Fo−Fc地图轮廓线为2.5σ)沿着守恒的残留T148 T181(灰色和红色球体)。c,d,倾斜的视图(c)和正交视图(d)(相对于一个环状的密度。使用数据从一个单晶结构测定。

扩展数据图3螺旋变化和整体灵活性ExbB五聚物。

一个,两个五聚物观察每个不对称单元内的晶体结构。这里是五聚物1(绿色)与五聚物2(红色),说明在螺旋的微小改变(气缸)这两个五聚物之间,最大的变化由黑色的箭头表示。循环连接α6α7也显示单体之间的可变性和五聚物。bTonB复形(ExbB-ExbDΔperi)显示值从b因子腻子表示最要求用蓝色最无序的红色。

扩展数据图4为ExbD跨膜螺旋的电子密度。

一个,省略映射(2Fo−Fc1.0,波状外形的σ沿着跨膜孔隙的ExbB)。相对应的密度ExbB五聚物所示蓝色网格,而密度对应的跨膜螺旋ExbD绿色网所示。b,立体相片显示密度(2Fo−Fc0.8,波状外形的σ灰色的网;2Fo−Fc省略地图(省略ExbD)的跨膜螺旋波状外形的为0.8σ、绿网)的跨膜螺旋ExbD后建立和细化。

扩展数据图5的比较观察密度ExbB-ExbD的晶体结构Δperi解决在酸碱7.0和4.5。

电子密度的存在跨膜螺旋的ExbD pH值(红色丝带)是依赖于晶体的生长。在pH值为7.0,我们观察到小密度(橙网)的跨膜孔隙内ExbB(灰色丝带)五聚物(见也扩展数据图3)。然而,对于结构解决了pH值在4.5中,我们观察到清晰的密度(蓝色网)的跨膜螺旋ExbD,虽然在不同程度。密度地图(2Fo−Fc波状外形的1.0σ。

扩展数据图6包装相似的2 d和3 d晶体用于电子显微镜和x射线晶体学。

一个从电子显微镜分析,平均投影映射二维晶体。五个图像进行分析,从900年子图片代表平均投影映射计算。平均的地图显示了两个不同人群的五聚物的大小相似,但不同水平强度由于晶体内部的复杂的相反的方向;也观察到类似的包装安排在我们的晶体结构。ExbD并不在我们的电子显微镜研究发现,可能由于球状域的障碍,长期固定在膜的非结构化的链接器15。b、包装的复杂3 d晶体的x射线晶体结构。右侧显示一个正交视图强调一行的分子晶格(黑色虚线框)。c的分子,配件行三维晶格(x射线)b到平均投影图的二维晶体(电镜)强调一致性在包装。

扩展数据图7鹿跟踪和分析。

吨复形(ExbB这件-ExbD, ExbB这件-ExbDN78C,ExbB这件-ExbDE113C)在0.08% C10E5(一个DDM)和0.03% (b),完全组装复杂(TonB吨C18A-ExbB这件-ExbD和TonBC18A-ExbB这件-ExbDN78CDDM)的0.05% (c)。上面板、实验q波段鹿主要数据V(t)/V(0)(彩色线条,青色ExbD113年mtsl;紫ExbD78年mtsl;红色和橙色,ExbB25 mtsl)和模拟背景函数(虚线)。中间面板、鹿痕迹后背景校正(彩色线)和符合DeerAnalysis2015(虚线)和Tikhonov正则化参数从10到100年通过调整L-curve分析和数据验证。较低的面板,获得距离分布。为pentameric ExbB样品标签效率(50%),获得了调制深度> 0.45,表明multi-spin系统的存在。样品可溶性DDM,长鹿痕迹(4μs)获得更好地描述ExbB长途5 - 6纳米的峰值25 mtsl。此外,所有面板,另一个鹿跟踪测量后减少12-ns泵脉冲微波功率的25%(橙色线)抑制鬼峰因存在两个以上的系统中旋转。由此产生的距离分布(橙色)被发现非常相似,得到微波功率为100%(红色),表明当前没有鬼峰的文物。较低的调制深度观察ExbD样品标签的位置113对这些标签位置78(包括标签效率> 80%)可能是由于存在距离< 1.5 nm(模拟预测的),这是这项技术的灵敏度范围以外的,或不稳定ExbD二聚体诱导的标签。的底部c显示了一个比较吨复形的DDM(虚线b)完全组装吨复杂(实线)。面板显示所有数据从单一的实验。

扩展数据图8微净化完全组装吨复杂。

一个很多复杂的、sds - page凝胶(+ TonB)和吨复形(−TonB)增加浓度。b,条形图显示在吨ExbB-ExbD比率的比较复杂(+ TonB)和吨复形(−TonB)表明协会的TonB吨复形不会改变组件的化学计量比。当我们看到一个微小的区别在ExbB-ExbD TonB存在与否的比率值,观察到的差异太小,建议一个改变化学计量学ExbB和ExbD之间。三个代表车道为每个示例所示一个;然而,五道被用于所有的计算。与ImageJ微密度分析,计算平均值和标准错误使用Microsoft Excel。的方法进行了净化吨复杂(+ TonB),五个净化实验,一个代表。吨复形的方法进行了净化(−TonB), 50 ~方法进行了净化和显示一个代表执行。

扩展数据图9的圆二色性分析二级吨复形的结构和热稳定性。

远紫外圆二色性光谱(185 - 260 nm)吨复形(ExbB-ExbD)计算百分比显示的二级结构。常规内容和扭曲α-helical结构、47和21%,分别在计算中结合二级结构的贡献。插图,比较吨复形的热稳定性(蓝色)与ExbB独自(红色)测量通过圆二色性的温度依赖性信号幅度在222海里。面板显示数据从一个实验。

图10扩展数据序列保护ExbB orthologues映射到晶体结构。

一个Clustal W ExbB序列的排列:大肠杆菌K12 (P0ABU7),脑膜炎奈瑟氏菌(P64100),淋病奈瑟氏菌(Q5F711),嗜血杆菌ducreyi(O51808),鳗弧菌(D0XEN5),鼠疫杆菌(D1TTA4),Methanothermobacter thermautotrophicus(O27101),铜绿假单胞菌(G3XCW0) ExbB1霍乱弧菌(O52043)和ExbB2霍乱弧菌(AAC69454)。b环保部门的结构映射到ExbB妄想。最保守的残留在蓝色和发现α6 (TM2)和α7 (TM3) ExbB结构。一个广泛的一致性,还包括序列从托尔和年检系统显示了类似的结果22。c下摆裁成圆角的分子表面ExbB五聚物最保守的残留映射到表面。

补充信息

补充表

这个文件包含补充表1 - 2。表1包含一个数据收集和总结吨复形晶体结构细化统计;表2显示了潜在无电流(V牧师奇遇记》)立志从伏安特性测量不对称盐条件。使用Goldman-Hodgkin-Katz相对阳离子/阴离子渗透率计算方程。(XLSX 12 kb)

吨复形的整体结构

这个视频给结构洞察吨复杂的能量传导的作用。(MOV 29929 kb)

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西莉亚,H。,Noinaj, N。,Zakharov, S.et al。结构洞察吨复杂的能量传导的作用。自然538年60 - 65 (2016)。https://doi.org/10.1038/nature19757

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