摘要
尽管tRNA具有重要的生物学意义，但由于其丰富的转录后修饰和稳定的结构，干扰了cDNA的合成，因此尚未用标准方法对其进行充分的测序。我们在HEK293T细胞中实现了高效和定量的tRNA测序，方法是使用工程去甲基化酶去除碱基甲基化，并使用高加工热稳定性II组内子逆转录酶克服这些障碍。我们的方法DM-tRNA-seq应该适用于所有生物的tRNA研究。
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参考文献
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确认
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)授予T.P的DP1GM105386，美国国立卫生研究院授予A.M.L的R01GM37949和GM37951, Q.D的K01HG006699，美国国立卫生研究院MCB培训补助金(T32GM007183)授予W.C.C.，以及芝加哥生物医学联盟博士后研究补助金授予G.Z.的支持。我们感谢张亮、陈w.j.和I.A. Gagnon的技术支持。C.H.是霍华德休斯医学研究所的研究员。
作者信息
作者及隶属关系
贡献
G.Z, Y.Q, W.C.C, Q.D, A.M.L.和T.P.设计并进行了实验并分析了数据。G.Z.和T.P.构思了这个项目。g.z.， C.Y.和C.H.设计了去甲基酶结构。G.Z Y.Q。,W.C.C A.M.L.和t写道。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
耐热II组内含子逆转录酶(tgrt)酶及其使用方法是专利和专利申请的主题，这些专利和专利申请已由德克萨斯大学奥斯汀分校和东田纳西州立大学授权给InGex, LLC。A.M.L.和德克萨斯大学是InGex, LLC的少数股权持有人。amml和兰博维茨实验室的其他现任和前任成员从TGIRT酶的销售和知识产权许可中获得特许权使用费。
综合补充信息
补充图1 DM-tRNA-seq的研制。
（一个基于蛋白质数据库(Protein data bank, PDB) ID的AlkB活性位点立体化学模型与m1G配位3“而且3 bie．左下为m1G结合的wtAlkB，右下为D135S突变体结合的m1G。突变的氨基酸用红色表示。（b蛋白质对修饰的去甲基化效率。tRNA分别用等摩尔AlkB(粉色)、等摩尔D135S(青色)或AlkB和D135S的混合物(tRNA: AlkB: D135S = 1:1:1)在pH值5处理。随后分析了m1A(上)和m1G(下)的去甲基化部分。（c) wtAlkB和D135S混合对tRNA中m1A和m1G脱甲基反应的ph -活性谱。（d) m1A和m1G去甲基化反应的蛋白比例分布图。tRNA用等摩尔的wtAlkB和D135S的不同折叠度孵育，如图所示，因为wtAlkB已经被证明能有效地脱甲基m1A。所有的去甲基化实验都进行了三次重复;误差条，n = 3±SD。
补充图2 DM-tRNA-seq映射。
（一个) 4组生物重复的总reads、映射reads和映射速率。（b)比较增加的内部tRNA标准和总读数;误差条，n = 4±SD。尽管每个样品的总reads差异很大，但标准的reads非常相似，这表明各个样品之间的reads变化并不能反映tRNA丰度的变化，而是源于每个样品中样品处理和酶反应效率的变化。
补充图3复制测序图。
（一个纯化的tRNA，未经处理。（b)纯化的tRNA， +去甲基酶。（c)总RNA，未经处理。（d)总RNA， +去甲基酶。
补充图4 6号染色体tRNA同分译码体表达。
在所有人类染色体中，Chr. 6包含最多的注释tRNA基因(166个)，加上9个tRNA假基因。在这175个基因/假基因中，157个聚集在I类MHC基因旁边的~2.7 Mbp区域内。我们能够确定131个基因/假基因的表达，因为它们之间或其他chrc .6 tRNA基因之间的独特序列。其余44个基因与位于其他染色体上的一个或多个tRNA基因具有相同的序列。（一个)未经处理的。箭头指向2.7 Mbp区域内包含tRNA基因簇的扩展区域。可以唯一分析的tRNA基因的数量表明:在2.7 Mbp区域有117个，在该区域以外有14个。（b)加上去甲基酶治疗。
补充信息
补充文字及图表
补充图1-4 (PDF 314kb)
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关于本文
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郑刚，秦勇，克拉克，W。et al。高效定量的高通量tRNA测序。Nat方法12， 835-837(2015)。https://doi.org/10.1038/nmeth.3478
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DOI：https://doi.org/10.1038/nmeth.3478
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