介绍

全面的基因组研究显示，异柠檬酸脱氢酶(IDH)经常发生在多种类型的人类癌症中，包括神经胶质瘤的一个子集[1］．随后的研究表明IDH突变可能是神经胶质瘤的有力预后因素[2］．IDH1突变也被认为是恶性星形细胞瘤的预测生物标志物，可用于广泛的切除和放化疗，使患者受益[3.］．因此,IDH突变已被引入胶质瘤的分子分型和综合诊断[4,5］．几乎所有的IDH这些突变的目标是酶活性位点的一个氨基酸残基，即IDH1中的Arg132和IDH2中的Arg172和Arg140。肿瘤来源的IDH1和IDH2突变取消了它们将异柠檬酸盐转化为α-酮戊二酸(α-KG)的正常催化活性[2,6,7］．最显著的特征IDH突变是新形态的功能获得:依赖nadph的α-KG还原为正常微量代谢物2-羟戊二酸(2-HG)，现在通常被称为肿瘤代谢物[6,8］．

作为代谢的直接结果IDH在胶质瘤中，2-HG可累积至5-35μmol /gIDH突变(8］．利用2-HG异常富集，磁共振波谱(MRS) [9,10]以及质谱分析[11,12]已被报道用于检测2-HG并定义IDH胶质瘤组织的突变状态。MRS作为一种无创监测2-HG的方法，其敏感性会急剧降低，特别是在小肿瘤中[13］．虽然在高场MRS (7.0 Tesla)中准确率可以提高，但其临床应用尚未得到证实[14］．由于气相色谱质谱法(GC-MS)比MRS灵敏得多，因此可以很好地平衡灵敏度和可靠性，检测生物样品中的代谢物。气相色谱-质谱联用首次用于酸尿患者尿液样本中2-HG的检测[15]，随后在AML患者的血清样本中发现IDH1-R132H或IDH2-R140Q突变[16]以及培养的含有内源性的癌细胞株IDH突变(17］．在本研究中，我们用GC-MS对2-HG进行定性和定量的检测，结果提供了信息IDH1脑肿瘤的突变状态，敏感性和特异性为100%。进一步优化基于gc - ms的方法使我们能够在40分钟内确定2-HG。重要的是，利用2-HG/谷氨酸的比值来检测突变，因为野生型肿瘤中2-HG很少[18,19］．且比例能准确区分IDH1——这可能为胶质瘤的术中诊断和患者管理提供一种新的范式。

材料与方法

样本采集和统计分析

患者入组、样本采集、统计分析细节见补充信息．经华山医院当地伦理委员会批准后，所有患者均获得同意书。神经病理学家根据《2016年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类》对这些肿瘤样本进行临床分类和分级[20.］．详细介绍了测序和免疫组化的过程补充信息．

GC-MS-based 2-HG检测

通过添加150µL−80°C甲醇:水混合物(80%:20%;Cat#34860, Sigma-Aldrich)到脑组织(约25 mg)，然后在4°C下均质20 s (OSE-Y10, Tiangen)。这些冷冻的，甲醇萃取的均质组织，然后在14000转/分下离心6分钟，沉淀细胞和组织碎片，60µL清除的组织上清转移到螺旋盖v型玻璃底瓶(VAAP-31509-1232-100, CNW)，并在真空干燥设备(Concentrator Plus, Eppendorf)中在30°C下干燥10分钟。为了进行分析，将残渣与20µL n -叔丁基二甲基硅基- n -甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA, Cat#394882, Sigma-Aldrich)和35µL吡啶(Cat#270407, Sigma-Aldrich)在70°C下混合20分钟。将1微升衍生样品注入Aligent 7890a气相色谱- Agilent 5975C质谱联用。毛细管柱(Cat# 19091S-433, HP-5ms Intuvo, 30 m × 0.25 mm × 0.25μm;安捷伦科技公司(Agilent Technologies)采用氦气作为载气进行分离。气相色谱-质谱联用和数据处理的参数补充信息．

GC-MS-based 2-HG定量

D-2-HG (Sigma-Aldrich, Cat#94577)作为标准样品溶解于ddH中2O的浓度为10mm。将两倍稀释的样品与100µL−80°C甲醇:水混合物(80%:20%)混合，40µL混合物转移到螺旋盖v型玻璃底瓶中，按照上述方法在真空干燥装置中干燥，遵循标准GC-MS方法检测2-HG丰度。据此制作2-HG标准曲线进行定量。

对于胶质瘤样本中的2-HG定量，代谢物提取是通过向脑组织(约10 mg)中加入200µL−80°C甲醇:水的混合物(80%:20%)，然后进行90 s均质(tissuelyer -48，上海晶鑫)，并在4°C下以14000 rpm离心10分钟完成的。转移200微升上清液，30°C干燥1 h。将残渣与35 μ L含20 mg/mL盐酸甲氧基胺的吡啶(Sigma-Aldrich, Cat#226904)混合，然后在70°C下孵育0.5 h。在加入20 μ L MTBSTFA后，在70°C下衍生化40 min。将1微升衍生样品注入GC-MS进行2-HG检测定量。

方法验证

微型柱法根据美国fda为工业界制定的生物分析方法验证指南进行了验证[21］．评价了选择性、定量下限(LLOQ)、基质效应、回收率、精密度、准确度和稳定性。细节和结果显示在补充信息．

结果

回顾性评估IDH1通过pcr测序和免疫组化染色检测胶质瘤的突变

在220个胶质瘤样本中，169个是杂合的IDH1R132H突变经pcr测序鉴定(76.8%，WHO分级及位置见图。1b).我们发现的比例要高得多IDH1在低级别胶质瘤(LGG, WHO II & III级，92.3%)中，与gbm(7.7%)相比IDH1神经胶质瘤突变)。此外,IDH1——突变胶质瘤主要位于额叶(图。1)，这与以往的研究一致(关于该群体的特征，补充表S1) ［22］．

图1
图1

回顾性评估IDH1突变。一个患者群体的临床特征。圆圈代表人口规模，颜色对应位置。世卫组织的等级分布(下图)。每个部分的面积代表占总人口的百分比。共220例胶质瘤样本bPCR-sequencing和cIHC染色鉴定IDH1R132H突变。比例尺为100μm。根据测序数据，IHC染色方法的敏感性和特异性(d）

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接下来，我们评估了IDH1通过免疫组化(IHC)检测胶质瘤样本的突变状态IDH1R132H突变体(图;1 c)．169年IDH1阳性138例(81.7%)IDH1免疫组化导致R132H突变(图;1 d)．51例IDH1野生型胶质瘤标本中，抗体染色阴性47例(92.2%)IDH1R132H突变，4例出现IHC假阳性(图;1 d)．pcr测序和免疫组化染色均可用于肿瘤的诊断，具有较高的敏感性和特异性IDH胶质瘤术后突变状态。需要注意的是，这两种方法通常都需要1-2天的时间，阻碍了快速诊断的应用。

气相色谱-质谱法定量检测2-汞IDH1突变的神经胶质瘤

GC-MS技术提供了一种潜在的敏感和可靠的检测方法，不仅用于检测2-HG，而且还用于其定量。在GC-MS方法的样品制备过程中，手术解剖的胶质瘤样品(约10 mg)离心后用预冷甲醇均质，上清进行真空干燥、衍生化、GC-MS检测和定量。重建自适应的标准曲线，以覆盖左50%曲线内的最大响应值。58例胶质瘤样本杂合子IDH1通过测序鉴定出R132H突变，我们发现在49/58(84.5%)的测试样本中，2- hg水平低于2 mM/g组织(图4)。2)．在一些情况下，有避风港IDH1突变时，2-HG浓度可高达8.2 mM/g(图;2)．

图2
图2

气相色谱-质谱法定量检测2-汞IDH1突变的神经胶质瘤。一个混凝土2-HG浓度。b2-HG高蓄积主要发生在年轻患者(年龄< 35岁)、中年患者(35岁≤年龄≤60岁)和c“绿带运动”样本。d2-HG在IHC表观遗传调控中的剂量依赖性活性。具有代表性的IHC数据IDH1突变的胶质瘤组织(左两面;的2-HG高和2-HG低组)和WT肿瘤(右图)。比例尺为100μm。此外，这些表观遗传修饰强度的量化显示。均值±SEM, 2尾t -测试中,*P< 0.05， **P< 0.01， ***P< 0.001， ****P< 0.0001

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2-HG水平在年轻人中较高IDH1-突变患者(< 35岁，n= 21, 1.525±2.30 mM/g)，以及中年患者(35岁≤年龄≤60岁，n= 34, 0.909±1.22 mM/g)，老年患者有降低趋势(> 60岁，n= 3,0.263±0.403 mM/g)(图2 b)．由于老年组样本量有限，故未发现统计学差异(图2)。2 b)．此外，我们还观察到GBM中2-HG浓度较高(n= 6,2.757±3.006 mM/g)，与LGG包括WHO二级(n= 29, 1.071±1.663 mM/g)和III级(n= 23, 0.701±0.988 mM/g，P< 0.05)。(无花果。2摄氏度）

总的来说，这些结果表明GC-MS可以提供一个可靠的策略来量化胶质瘤中的2-HGIDH1用少量的组织进行突变。

高浓度累积2-HG对组蛋白去甲基化的抑制作用IDH1突变的神经胶质瘤

IDH1R132突变仅在原发肿瘤组织中产生D-2-HG [8]， D-2-HG作为α-KG的拮抗剂，竞争性地抑制多种α-KG/Fe(II)依赖的双加氧酶，包括组蛋白酶和DNA去甲基化酶[23,24］．体外研究表明，D-2-HG具有最低的半最大抑制浓度(IC50)，范围为24 μM ~ 106 μM [23］．如图所示。22-HG(即D-2-HG)的浓度范围为5.4 μ M/g ~ 8.2 mM/gIDH1-突变胶质瘤样本，提示组蛋白去甲基酶可能在这些样本中被抑制。为了验证这一假设，我们分析了胶质瘤样本中的组蛋白H3赖氨酸79 (H3K79)和H3赖氨酸9 (H3K9)甲基化。二维)．我们的数据表明H3K79二甲基化在IDH12- hg水平高于2 mM/g肿瘤组织的突变病例(称为2- hg高,n= 9)，与野生型IDH1肿瘤(P< 0.0001,n= 6)。值得注意的是，H3K79二甲基化没有增加IDH1-突变胶质瘤样本，其中2-HG水平低于0.1 mM/g肿瘤组织(称为2-HG低,n与野生型IDH1肿瘤相比= 10)。2-HG组H3K79二甲基化显著升高高组比2-HG组高低集团(P< 0.0001)。H3K79的甲基化由DOT1L/KMT4催化，并在多种细胞途径中发挥作用，包括端粒沉默、细胞发育、细胞周期检查点、DNA修复和转录调控[25］．我们的研究结果表明，尚未确定的假定的H3K79去甲基酶的活性似乎对细胞中2-HG的浓度敏感，并且只有当2-HG积累到高水平时才能被抑制。

另一方面，H3K9二甲基化在2-HG中均显著升高高和2-HG低组窝藏IDH1与IDH1野生型组相比(P< 0.05和P分别< 0.0001)。H3K9二甲基化水平在2-HG之间未发现明显变化高和2-HG低组与IDH1突变。来自TCGA数据集的生物信息学分析表明，大多数H3K9二甲基化相关组蛋白去甲基酶基因[26,27]，例如Kdm1a, kdm3b, kdm4b, kdm4c, kdm4d, kdm5b,KDM7A的水平上调IDH1-突变胶质瘤与野生型肿瘤的比较(补充图。S1)．这些结果支持了这样一种观点IDH1突变和2-HG积累导致组蛋白去甲基酶活性受到抑制，而不是抑制其表达。

高浓度累积2-HG对DNA羟甲基化的抑制作用IDH1突变的神经胶质瘤

除α- kg依赖性组蛋白去甲基酶外，2-HG还抑制TET1和TET2在体外和体内的催化活性IDH突变细胞[24,28］．的协议,IDH胶质瘤突变与CpG岛甲基化表型(G-CIMP)相关[29]，在原代星形胶质细胞中异位表达时，可单独建立G-CIMP [30.］．我们发现5-甲基胞嘧啶(5mC)的平均相对强度在2-HG之间没有明显差异高（n= 9)， 2-hg低（n= 10)，野生型组(n= 6)(图二维)．5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的平均相对强度在2-HG有降低的趋势高与IDH1野生型组相比。然而，在2-HG中未观察到降低5hmC的趋势低与IDH1野生型组相比。值得注意的是，2-HG组的5hmC水平显著降低高组比2-HG组高低集团(P< 0.05)。来自TCGA的基因表达数据证实了这一点春节基因表达显著上调IDH1-突变胶质瘤与IDH1野生型肿瘤的比较(补充图。S2)，支持这一观点IDH1突变和2-HG导致胶质瘤中TET活性的抑制，而不是抑制其表达。此外，这些结果也表明，只有当2-HG积累到较高水平时，TET酶的催化活性才会被抑制IDH突变的神经胶质瘤。

压缩GC-MS快速检测2-HG

pcr测序和IHC染色均需1天以上才能完成，不适用于快速诊断IDH临床实践中的突变。气相方法的标准程序包括均质化、离心、真空干燥、肟化由methoxyamine盐酸(氧化物)和衍生N-tert-Butyldimethylsilyl-N - methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA),通常需要大约3 h(即165±8分钟)(图3)．值得注意的是，2-HG是一种不含羰基的小分子代谢物，因此不能与MOX反应[31］．考虑到2-HG含有3个羟基，因此可以与MTBSTFA反应(图。3)，我们开发了一种压缩GC-MS程序，目的是快速检测2-HG。为了加速GC-MS过程，我们测试了各种条件以缩短GC-MS每一步及其组合的时间周期。我们确定离心时间可缩短至6 min，真空干燥时间可缩短至10 min，可省去盐酸甲氧胺肟化步骤，MTBSTFA反应时间可缩短至20 min，且不丢失2-HG峰的检测(图2-HG峰)。3， b).因此，压缩GC-MS过程可以在不到1小时(55±2分钟)内完成从组织样本制备到2- hg检测。

图3
图3

压缩GC-MS快速检测2-HG的方法。一个显示标准方法和压缩方法的图表。b代谢产物分析IDH1-突变的胶质瘤样本。箭头指向2-HG峰。当真空干燥时间缩短至8 min或MTBSTFA反应时间缩短至15 min时，GC-MS无法检测到2-HG峰。c比较标准法和压缩法测定的代谢物谱。的AUCd2-HG和el谷氨酸在IDH1-突变胶质瘤样本(n= 58)，由标准和压缩GC-MS方法测定

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接下来，我们在87例胶质瘤患者队列中测试了这种基于压缩GC-MS的2-HG检测方法的临床应用潜力(关于该人群的特征，补充表)S2)．手术流程从术前MRI诊断开始，到回顾性评估结束IDH1pcr测序和免疫组化染色。手术解剖的胶质瘤样本直接使用基于GC-MS的方法进行代谢物分析(补充图)。S3)．压缩GC-MS方法省略了MOX肟化步骤，干扰了含羰基代谢物的检测。事实上，含有羰基的代谢物的AUC(曲线下面积)，如6-氮杂嘌呤和次黄嘌呤(图2)。3 c)，压缩GC-MS法测定的含量明显小于标准GC-MS法测定的含量。既不是2-HG也不是l-谷氨酸，通常用于2-HG标准化[32,33]，有羰基。因此，2-HG或l-谷氨酸经压缩GC-MS法测定，与标准方法(n= 58，成对t以及;无花果。3 d, e)。

在这87个案例中，58个样本被确定为窝藏IDH1pcr测序突变(补充表S2)．采用压缩GC-MS法，58例均检测到2-HG累积IDH1-突变样本(图;4 a、b， c).经pcr -测序鉴定为野生型IDH1的29份样本中，压缩GC-MS法分析均未发现2-HG累积(图2-HG累积)。4 b)．因此，这些发现表明压缩GC-MS方法在识别中的准确率为100%IDH-突变的胶质瘤样本。与我们之前的发现一致(图。1)，我们发现IDH1-突变/2- hg阳性的病例在WHO级和III级胶质瘤中富集，压缩法主要位于额叶(图。4)．的AUCl-谷氨酸经压缩GC-MS测定之间保持不变IDH1-突变型和野生型肿瘤(图;4 d)．这与紧密的保留时间一起l-谷氨酸(GLU, 18.72 min)和2-HG (18.12 min)，为快速GC-MS程序提供了方便的半定量内控。我们发现2-HG/GLU比值在所有病例中均显著增加IDH1-突变病例(1.685±2.367，n= 58;P< 0.0001)，而IDH1野生型(0.0096±0.0078，n= 29，图4 d, e， f).因此，2-HG/GLU的比值是一种更准确的区分方法IDH1突变型和野生型胶质瘤:2-HG/GLU比值低于0.04表示野生型IDH状态，而高于0.1的比值仅在突变型和野生型胶质瘤中发现IDH1在分析样本的两个队列中未见0.04 ~ 0.1范围内的比值(图2)。4 f)．

图4
图4

压缩法具有较好的预测效果IDH1突变状态。一个患者群体的临床特征。圆圈代表人口规模，颜色对应位置。世卫组织的等级分布(下图)。b代谢产物分析IDH1-突变或WT胶质瘤样本。c方法的敏感性和特异性。的AUCdl-谷氨酸和e2-HG在IDH1-突变或WT胶质瘤样品采用压缩法测定。对于2-HG标准化，f2-HG/的比值l-谷氨酸的计算和显示

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一种快速定性的GC-MS程序用于2-HG检测和快速诊断IDH1突变的神经胶质瘤

快速诊断IDH突变后，气相色谱机毛细管柱由30米缩短至5米(小柱法)。结果，GC运行时间从32分钟(标准方法)显著缩短到4.2分钟(迷你列方法)。在GC运行过程中，标准柱法和小柱法分别在18.1 min和3.3 min出现2-HG峰。总检测时间(小柱法)为39±2 min，压缩法为55±2 min (P< 0.0001，图;5)(补充表格S3)．5米柱法分离效率和峰明显降低，但2-HG峰在标准柱上出现于3.3 min，而在标准柱上为18.1 min，仍能充分分离并被质谱清晰识别。5 b)．

图5
图5

一种快速诊断的小柱法。一个减少气相色谱毛细管柱，GC- ms运行时间显著缩短，总检测时间在40 min以内。b代谢产物分析IDH1-突变的胶质瘤样本。的AUCcl氨基戊二酸d2-HG,e2-HG/ l -谷氨酸比值24例IDH1-突变胶质瘤样品采用压缩法和小柱法测定

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目的评价小柱法在2-HG检测和鉴别中的准确性和临床应用价值IDH采用压缩法和小柱法对43例手术切除胶质瘤进行2-HG检测。在这43个样本中，有24个港湾IDH124份样品经压缩柱GC-MS法或小柱GC-MS法均为2-HG阳性。的AUCl-谷氨酸或2-HG在小柱法上显著小于(P< 0.001，成对t以及;无花果。5度， d).然而，小柱法测定的2-HG/GLU与压缩GC-MS法测定的2-HG/GLU比值相似(P= 0.26，成对t以及;无花果。5 e)．24个样品中2-HG/GLU的比值普遍在0.1以上IDH1在19份野生型样品中，2-HG/GLU比值< 0.04，表明2-HG/GLU比值可作为判断该突变的可靠指标IDH临床病例的突变状态(补充图。S4)．综上所述，这些结果表明，小柱法虽然不适合定量，但可以可靠、快速地识别2-HG，从而IDH1手术解剖胶质瘤样本的突变状态，为快速诊断胶质瘤提供了一种潜在的广泛临床应用的新方法IDH突变。

讨论

IDH突变定义了异质性胶质瘤的不同亚型[34,35]，而这些亚组表现出独特的临床特征和对治疗的反应[3.,36,37］．精准诊断IDH突变对胶质瘤患者的护理管理至关重要。近年来，质谱技术的发展取得了迅速的进展，其中包括小代谢物的鉴定。发现突变体产生D-2-HGIDH提供了一个极好的例子来说明基于质谱技术的前景[8］．

在本研究中，我们开发了基于GC-MS的2-HG检测和定量方法。我们的数据表明，D-2-HG浓度在IDH1——突变胶质瘤，范围从5.4 μ M/g到8.2 mM/g肿瘤组织。2-HG在其碳主链中携带一个不对称碳原子，导致形成两种对映体:D-2-HG和L-2-HG。2-HG的两种对映体都是正常的内源性代谢产物，但在结合和抑制α- kg依赖性双加氧酶活性方面可能存在差异。D-2-HG抑制α- kg依赖的双加氧酶(包括组蛋白和DNA去甲基化酶)的活性已被广泛认识。全面的体外研究报道，D-2-HG抑制α- kg依赖性双加氧酶家族成员的活性差异很大，组蛋白去甲基酶KDM4A/JMJD2A和KDM4C/JMJD2C是最敏感的(IC50= 24µM和79µM)，脯氨酸羟化酶结构域蛋白2 (PHD2)和γ-丁基甜菜碱羟化酶(BBOX)非常耐药(IC50=分别为7.3毫米及13.2毫米)[23］．此外，D-2-HG还在体外抑制小鼠Tet1和Tet2 (IC50分别为4毫米及5毫米)[28,38］．因此，D-2-HG可以不同程度地抑制胶质瘤中α- kg依赖的双加氧酶IDH突变和IC最低的50D-2-HG的值优先被抑制。为了支持这一观点，我们在本研究中表明，2-HG在2-HG中都有积累低和2-HG高均可抑制α- kg依赖性的KDM4A/JMJD2A和KDM4C/JMJD2C，而KDM4C/JMJD2C对2-HG的抑制非常敏感[23］．另一方面，2-HG在2-HG中积累低而2-HG的累积量较高(如4 ~ 5 mM) [38]将被用于催化抑制TET。总的来说，这些结果提供了体内证据，再次肯定了高积累的2-HG对α- kg依赖性组蛋白和DNA去甲基酶的抑制作用IDH1突变的神经胶质瘤。观察到的不同α- kg依赖性双加氧酶的差异抑制的临床意义需要进一步研究。

快速诊断IDH突变迫切需要帮助神经外科医生设计治疗脑肿瘤的策略，原因有几个。首先,IDH突变可以将LGG与胶质细胞增生和正常脑组织区分开来。第二，胶质瘤边缘2-HG浓度通常急剧下降[12]，对肿瘤边界的识别有很大帮助。三是快速诊断IDH突变对决定切除范围具有潜在的重要意义。如果肿瘤位于大脑的非功能区，全切除或最大限度的手术切除一定会有利于隐匿的患者IDH1突变。如果IDH-突变的肿瘤毗邻或位于大脑功能区域，这些肿瘤应保留重要的神经功能，并应对放化疗高度敏感[36］．在目前的研究中，我们开发了一种新的基于压缩gc - ms的方法，可以准确、快速地识别IDH2-HG监测脑肿瘤突变状态。经过进一步改进，GC运行时间已成功缩短至4.2 min，使我们能够在术后40 min内检测到少量胶质瘤样本中的2-HG。最近，据报道，解吸电喷雾电离质谱(DESI-MS)可以在冷冻组织涂片中识别2-HG(约3分钟，与样品制备时间无关)，并有助于快速的分子诊断IDH胶质瘤的突变[39］．DESI-MS和GC-MS都便于2-HG的检测，因为DESI-MS不需要参考库，而GC-MS拥有标准的Mass Database，可以广泛应用于建立包括2-HG在内的代谢产物和任何其他肿瘤代谢产物的标准检测方案[40］．需要注意的是，在进行DESI-MS测定肿瘤细胞百分比(TCP)之前，需要建立参考库[41］．建立了液相色谱/电喷雾电离串联质谱(LC/ ESI-MS /MS)方法准确检测2-HG [42]，但不能完全区分突变型和野生型。由于野生型肿瘤中2-HG较少，单纯依靠2-HG不能作出准确诊断。我们相信环境电离法和基于gc - ms的方法都将有助于术中诊断，具有广泛的临床应用价值IDH突变状态，加快临床决策，并在不久的将来改善神经肿瘤患者的护理和治疗。