简介gydF4y2Ba

前列腺癌是欧洲和美国男性发病率最高的恶性肿瘤gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在中国，其发病率逐年上升。据估计，2015年中国有7.2万例前列腺癌新发病例，约3.7万例死亡gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．大多数患者在癌症转移后才被确诊。目前，内分泌治疗是晚期转移性前列腺癌患者的一线治疗方法gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．然而，在中位时间为18-24个月的内分泌治疗后，几乎所有患者都进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．一旦患者进入CRPC期，预后一般较差。多西他赛(DTX)治疗可有效延长CRPC患者的总生存期。然而，大多数患者最终对化疗产生耐药性，并经历肿瘤进展甚至死亡gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba．因此，探索CRPC-DTX耐药的分子机制显得尤为迫切。gydF4y2Ba

长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)，尤其是雄激素受体相关lncRNA在肿瘤进展、诊断和预后方面具有重要的临床应用价值，是前列腺癌的治疗靶点gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．LncRNA NEAT1通过miR-205-5p促进前列腺癌骨转移gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．CCAT1通过miR-490-3p/FRAT1轴促进肿瘤的发展和进展gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．越来越多的证据表明lncrna在前列腺癌的化疗耐药中起着关键作用gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．既往研究发现HOTTIP、PCBP1-AS1和HOTAIR分别增强前列腺癌对顺铂、enzalutamide和DTX的耐药gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba．在前列腺癌中，MALAT1在DTX耐药组织中高表达，并通过调节miR-145-5p/AKAP12轴促进DTX化疗耐药的增强gydF4y2Ba15gydF4y2Ba．此外，DANCR通过靶向miR-34a-5p/JAG1轴增强前列腺癌的DTX耐药gydF4y2Ba16gydF4y2Ba．然而，lncrna在前列腺癌DTX耐药中的作用仍然知之甚少。因此，迫切需要新的研究来阐明前列腺癌中DTX耐药的潜在机制。gydF4y2Ba

在本研究中，我们通过lncRNA测序揭示了DTX抗性对PC3细胞中lncRNA表达的影响。接下来，我们展示了LINC01963对前列腺癌DTX耐药的影响，以及LINC01963对这种耐药的潜在机制。本研究证实了LINC01963在前列腺癌中影响DTX耐药，为这些患者提供了潜在的治疗靶点。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

细胞培养和DTX处理gydF4y2Ba

人前列腺癌细胞系PC3在Dulbecco 's改良Eagle 's培养基(DMEM;Gibco, Grand Island, NY, USA)，添加10%胎牛血清(FBS)，并在含有5% CO的培养箱中保持gydF4y2Ba2gydF4y2Ba37°C。如前所述，用二甲基亚砜(Sigma, St. Louis, MO, USA)中悬浮的DTX处理细胞，在前列腺癌细胞PC3 (PC3- dr)中诱导DTX耐药gydF4y2Ba17gydF4y2Ba．简单地说，用4和8 nmol/L的DTX处理PC3细胞48小时，共5个周期。治疗后，将存活的细胞重新播种到新的DMEM中2-3周。PC3细胞分别用8 nmol/L和12 nmol/L DTX处理48 h，共12个周期。然后将存活的细胞重新播种到DMEM中2-3周。细胞在DTX中持续保持，处理从10 nmol/L开始，逐渐增加5 nmol/L，直到最终剂量为50 nmol/L。含DTX的DMEM每2-3天更换一次。PC3-DR细胞用40 nM DTX维持1个月。gydF4y2Ba

MTSgydF4y2Ba

使用MTS法(Promega, St. Louis, MO, USA)分析PC3和PC3- dr细胞的增殖情况。PC3和PC3- dr细胞在DTX补充的DMEM中培养。培养24、48、72 h后，加入10 μL CellTiter 96水溶液细胞增殖试验，孵育4 h。使用Multiskan Mk3微板阅读器(Thermo Fisher)在570 nm处测量OD值。一半最大抑制浓度(IC50)值是在实验条件下抑制细胞增殖50%的每种化合物的浓度，是8次重复实验的平均值。gydF4y2Ba

LncRNA测序gydF4y2Ba

使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从PC3和PC3- dr细胞中提取总RNA，每组有三个平行样本。使用Agilent生物分析仪2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)评估总RNA的纯度、浓度和完整性。采用Illumina HiSeqTM 4000测序仪进行LncRNA测序，并进行生物信息学分析gydF4y2Ba18gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)gydF4y2Ba

总RNA用TRIzol分离gydF4y2Ba®gydF4y2Ba并溶于15 μL depc处理过的水中。RNA浓度用M-MLV (Promega)反转录，42°C孵育60分钟。采用SYBR Green PCR Master Mix (TOYOBO)， ABI PRISM进行RT-qPCRgydF4y2Ba®gydF4y2Ba7500序列检测系统(福斯特城，CA，美国)。相对表达水平用2gydF4y2Ba−ΔΔctgydF4y2Ba方法gydF4y2Ba19gydF4y2Ba．GAPDH水平被用作lncrna和mRNAs的内部对照。U6水平被用作miRNAs的内部对照。gydF4y2Ba

构建稳定的细胞系gydF4y2Ba

3个定位于LINC01963 (sh-LINC01963)和LINC01963全长基因的短发夹rna(位于Chro2:216217045-216220192(+))被包装到一个慢病毒中，构建了表达sh-LINC01963或全长LINC01963的慢病毒，称为sh-LINC01963或ov-LINC01963慢病毒(Genepharma, Shanghai, China)。用sh-LINC01963和ov-LINC01963慢病毒和空对照慢病毒(NC)感染PC3和PC3- dr细胞，构建PC3和PC3- dr稳定细胞系。收集稳定的细胞株，重新悬吊以作进一步分析。gydF4y2Ba

细胞周期与凋亡分析gydF4y2Ba

DTX处理48 h后，分别使用细胞周期和凋亡检测试剂盒(Keygen，南京，中国)检测PC3和PC3- dr细胞的细胞周期和凋亡。使用BD Calibur流式细胞仪(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)分析样品。gydF4y2Ba

Transwell迁移/侵袭试验gydF4y2Ba

在迁移和侵袭实验中，使用了未涂有Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)或预涂有Matrigel的聚碳酸酯过滤器(8 μm孔径，Corning, Corning, NY, USA)。PC3和PC3- dr细胞(1 × 10gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)在含0.1%胎牛血清的300 μL培养基中培养，上室播种。然后在下腔中加入添加10% FBS的600 μL培养基。培养48小时后，迁移并粘附在下腔的细胞在4%多聚甲醛中固定20分钟，用苏木精染色，在直立显微镜下计数(每个腔5个野)。gydF4y2Ba

伤口愈合试验gydF4y2Ba

PC3和PC3- dr细胞(1 × 10gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba每孔细胞)接种到六孔板过夜。接下来，用移液管在细胞板上划一条垂直的线，取出分离的细胞。然后用DTX处理细胞48小时，观察并拍照。每个实验进行三次，得到平均值。gydF4y2Ba

异种肿瘤移植与肺转移gydF4y2Ba

动物实验经中南大学湘雅医学院附属海口医院批准。48只雄性BALB/c裸鼠来自广东医学实验动物中心(SCXK(Yue)2013-0002，广州，中国)，在SPF级条件(25°c, 12 h明暗循环)下饲养，所有动物在相同条件下饲养，以尽量减少潜在的混杂因素。使用MAC 1.6%异氟醚麻醉机麻醉小鼠。实验结束后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(140 mg/kg)，颈椎脱位处死大鼠。此外，如果小鼠体重迅速下降(>20%体重下降)，变得恶病质、自残、咬人、表现出攻击性、进食、饮水困难或自由活动，这些被认为是人道的杀死终点，则对其实施安乐死。所有小鼠都参与了这项研究。皮下肿瘤发生分析:5 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba6周龄BALB/c雌性裸鼠右侧皮下注射细胞。24只BALB/c裸鼠采用排序随机法分为4组(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6): PC3-DR PC3-DR + NC, PC3-DR + ov-LINC01963, PC3-DR + sh-LINC01963。注射后10天，DTX溶液(10 mg/kg)每5天静脉注射给每只小鼠。24只BALB/c裸鼠分为4组(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6):生物,生物+ NC,生物+ ov-LINC01963,生物+ sh-LINC01963。注射后10天，DTX溶液(1mg /kg)每5天静脉注射给每只小鼠。使用数字卡尺评估肿瘤大小。小鼠被安乐死，皮下肿瘤被切除。测量皮下肿瘤的长度和宽度，按体积=(长×宽)/2计算体积。所有的小鼠都被纳入了这项研究。肺转移试验:1 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba将细胞注入6周龄雌性BALB/c裸鼠的尾静脉。24只BALB/c裸鼠采用排序随机化方法分为4组(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6): PC3-DR PC3-DR + NC, PC3-DR + ov-LINC01963, PC3-DR + sh-LINC01963。注射后10天，DTX溶液(10 mg/kg)每5天静脉注射给每只小鼠。24只BALB/c裸鼠分为4组(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6): PC3, PC3 + NC, PC3 + ov-LINC01963, PC3 + sh-LINC01963组。注射后10天，DTX溶液(1mg /kg)每5天静脉注射给每只小鼠。注射后6周，使用体内成像系统评估所有小鼠的肺转移程度。所有的小鼠都被纳入了这项研究。除分组人员和注射细胞的实验室人员外，其他参与者不知道分组情况。gydF4y2Ba

结合位点测定gydF4y2Ba

使用StarBase v3预测linc01963结合的mirnagydF4y2Ba20.gydF4y2Ba和LncBasegydF4y2Ba21gydF4y2Ba．使用StarBase v3分析前列腺癌中miRNA的表达gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba．使用TargetScan 7.2预测miR-216b-5p结合靶基因gydF4y2Ba22gydF4y2Ba和miRWalkgydF4y2Ba23gydF4y2Ba．由GENEWIZ(中国苏州)合成野生型(WT)或突变型(MUT) LINC01963和NFAT5的3 ' -UTR，并克隆到pmirGLO载体(命名为WT-LINC01963, MUT-LINC01963, WT-NFAT5, MUT-NFAT5)的萤火虫荧光素酶基因3 '端。然后，将30 ng质粒与50 nM miR-216b-5p模拟物共转染到PC3-DR细胞中。48小时后，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。Renilla荧光素酶活性归一化为firefly荧光素酶活性。采用RNA免疫沉淀试剂盒(GENESEED, Guangzhou, China)进行RIPA。RT-qPCR分析纯化RNA，检测LINC01963和miR-216b-5p的表达。下拉实验使用PureBinding RNA-Protein pull-down Kit (GENESEED)进行。用生物素化的LINC01963探针(Bio-LINC01963)或阴性对照探针(Bio-NC)转染PC3-DR细胞，并在48小时收获，通过RT-qPCR检测LINC01963和miR-216b-5p的表达。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

收集细胞，裂解，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分解的蛋白质被转移到聚偏氟乙烯膜上。用抗trkb (cat: ab134155, 92 kDa 1:1000 [v/v];Abcam, Cambridge, MA, USA)和anti-GAPDH (cat: ab181602, 1:10 000 [v/v];Abcam)。25°C冲洗4 h，用辣根过氧化物酶偶联二抗(1:2000 (v/v);Abcam)在25°C下放置2小时。蛋白质条带检测使用化学发光过氧化物酶底物(ECL;Amersham，北京，中国)。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

实验数据采用SPSS 19.0统计软件(IBM, Inc.)进行分析。数据以均数±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析分析三组以上的统计学差异，然后采用Tukey事后检验。一个gydF4y2BatgydF4y2Ba-test分析两组间的统计学差异。统计显著性设为gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

LINC01963在PC3-DR细胞中表达上调gydF4y2Ba

DTX处理48 h后，PC3细胞的IC50为16.23 nmol/L, PC3- dr细胞的IC50为337.1 nmol/L。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba1gydF4y2BabgydF4y2Ba)．这一结果表明PC3- dr细胞比PC3细胞具有更高的DTX抗性(20.73倍变化)。lncRNA测序结果显示，与PC细胞相比，PC3-DR细胞中有10,685个lncRNA上调，19,949个lncRNA下调(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2BacgydF4y2Ba，补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．所有lncRNA测序数据均上传到GEO (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE190648gydF4y2Ba)．此外，我们选择了4个大基因间非编码rna (LINC01963、LINC01934、LINC00595和LINC00235)来验证测序结果(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．结果显示，与PC3细胞相比，PC3- dr细胞中LINC01963表达上调，LINC01934、LINC00595、LINC00235表达下调，与lncRNA测序结果相似。LINC01963的差异表达量大于其他3种lncRNAs;因此选择LINC01963作为后续研究对象。gydF4y2Ba

图1:四种lncrna在PC3和PC3- dr细胞中的表达。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

在这些研究中，PC3和PC3- dr细胞未被DTX处理。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba根据lncRNA测序结果，在PC3和PC3- dr细胞中显示了四种lncRNA的表达。gydF4y2BabgydF4y2Ba采用qRT-PCR检测4种lncrna在PC3和PC3- dr细胞中的表达。数据以三次技术重复的平均值±标准差表示。＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

沉默的LINC01963减少了PC3-DR细胞的增殖和转移，并增强了PC3-DR对多西他赛的体外/体内模型的化学敏感性gydF4y2Ba

体外实验采用v- linc01963和sh-LINC01963-2慢病毒感染PC3-DR细胞，然后用40 nM DTX处理。与NC组相比，感染ov-LINC01963慢病毒后，PC3-DR细胞中LINC01963的表达明显上调，而感染sh-LINC01963-2慢病毒后，LINC01963的表达明显下调。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．此外，与NC组相比，ov-LINC01963组PC3-DR细胞的增殖率和迁移侵袭细胞明显增加，而sh-LINC01963-2组PC3-DR细胞的增殖率和迁移侵袭细胞明显降低(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与NC组相比，ov-LINC01963组PC3-DR细胞G1期细胞百分比和凋亡率明显降低，而sh-LINC01963-2组PC3-DR细胞G1期细胞百分比和凋亡率明显升高(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．在体内研究中，ov-LINC01963组与NC组相比，40 nmol/L DTX处理后，sh-LINC01963-2组肿瘤体积、重量和肺转移明显增加，而sh-LINC01963-2组肿瘤体积和重量明显下降(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．体外和体内实验结果表明，对LINC01963的干扰增强了PC3-DR对DTX的化学敏感性。LINC01963过表达则有相反的效果。gydF4y2Ba

图2:在PC3细胞和PC3- dr稳定细胞系中分析LINC01963的表达。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

在这些研究中，PC3和PC3- dr细胞未被DTX处理。采用qRT-PCR检测LINC01963在PC3- dr和PC3稳定细胞系中的表达。数据以三次技术重复的平均值±标准差表示。shRNA:短发夹RNA, ov:卵泡表达，NC:空对照慢病毒。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与NC组比较< 0.001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba
图3:沉默LINC01963降低了PC3-DR细胞的存活率，而过表达LINC01963则增加了PC3-DR细胞的存活率。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

在这些研究中，PC3-DR细胞用40 nmol/L DTX处理。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaMTS检测PC3-DR细胞增殖情况。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba流式细胞术检测PC3-DR细胞凋亡情况。细胞凋亡表示为平均值±SD (gydF4y2BabgydF4y2Ba)，显示细胞凋亡的代表性图像(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba流式细胞术分析PC3-DR的细胞周期。G1期分布为三个技术重复的均值±标准差(gydF4y2BacgydF4y2Ba)，并显示细胞周期的代表性图像(gydF4y2BaegydF4y2Ba)．gydF4y2BafgydF4y2Ba裸鼠肿瘤组织在异种移植研究后30天切除并拍照。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba检测肿瘤体积和重量。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba用体内成像系统评估裸鼠肺转移的程度。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与NC组比较< 0.001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

LINC01963过表达增加了PC3细胞的增殖和转移，增强了PC3细胞对多西他赛的体外/体内耐药能力gydF4y2Ba

接下来进行体外研究，用v- linc01963和sh-LINC01963-2慢病毒感染PC3细胞，然后用4 nmol/L DTX处理PC3- dr细胞。与NC组相比，ov-LINC01963慢病毒感染后PC3细胞中LINC01963的表达明显上调，而sh-LINC01963-2慢病毒感染后PC3细胞中LINC01963的表达明显下调。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与NC组相比，ov-LINC01963组PC3细胞增殖率及迁移侵袭细胞明显增加，sh-LINC01963-2组PC3细胞增殖率及迁移侵袭细胞明显减少(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与NC组相比，ov-LINC01963组PC3细胞G1期细胞百分比和凋亡率明显降低，而sh-LINC01963-2组PC3细胞G1期细胞百分比和凋亡率明显升高(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．在体内研究中，与NC组相比，ov-LINC01963组的肿瘤体积、重量和肺转移明显增加，而sh-LINC01963-2组的肿瘤体积和重量在4 nmol/L DTX处理后明显减少(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．体外和体内实验结果表明，过表达LINC01963增强了PC3细胞对DTX的耐药性。对LINC01963的干扰产生了相反的效果。gydF4y2Ba

图4:过表达LINC01963增加了PC3细胞的存活率，而沉默LINC01963则降低了PC3细胞的存活率。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

在这些研究中，用4 nmol/L DTX处理PC3细胞。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaMTS检测PC3细胞增殖情况。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba流式细胞术检测PC3细胞凋亡情况。细胞凋亡以三个技术重复的平均值±标准差表示(gydF4y2BabgydF4y2Ba)，显示细胞凋亡的代表性图像(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba流式细胞术分析PC3的细胞周期。G1期分布为均值±SD (gydF4y2BacgydF4y2Ba)，并显示细胞周期的代表性图像(gydF4y2BaegydF4y2Ba)．gydF4y2BafgydF4y2Ba裸鼠肿瘤组织在异种移植研究后30天切除并拍照。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba检测肿瘤体积和重量。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba用体内成像系统评估裸鼠肺转移的程度。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与NC组比较< 0.001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

LINC01963可与miR-216b-5p结合gydF4y2Ba

StarBase 3.0和LncBase 2.0揭示了11个miRNAs与LINC01963有良好的结合位点(图3)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．此外，StarBase v3分析显示，11个miRNAs中有4个高表达，因此被排除在外。在其余7种miRNAs中，只有miR-216b-5p、miR-3163、miR-130a-5p和miR-1197在PC3- dr细胞中的表达明显低于PC3细胞，其中miR-216b-5p表达明显低于PC3细胞。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．选择miR-216b-5p进行进一步研究。DTX处理后，PC3和PC3- dr细胞中，NC组、ov-LINC01963组和sh-LINC01963组之间miR-216b-5p表达无明显差异(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)，表明LINC01963对miR-216b-5p的表达没有影响。LINC01963与miR-216b-5p的结合位点如图所示。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba．双荧光素酶实验结果表明，miR-216b-5p模拟物显著抑制WT-LINC01963的荧光素酶活性，但不影响Mut-LINC01963的荧光素酶活性(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．此外，RIPA结果显示，LINC01963和miR-216b-5p在抗ago2组的表达高于抗igg组(图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)．此外，与Bio-NC组相比，Bio-LINC01963组中LINC01963和miR-216b-5p的表达明显增强(图2)。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)．这些发现证明miR-216b-5p是PC3-DR细胞中LINC01963的一个靶点。gydF4y2Ba

图5:miR-216b-5p被LINC01963结合。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaStarBase 3.0和LncBase 2.0分析发现，11个常见miRNAs与LINC01963有很好的结合位点。gydF4y2BabgydF4y2Ba通过qRT-PCR检测PC3和PC3- dr细胞中miRNA的表达。在这些研究中，PC3和PC3- dr细胞未被DTX处理。gydF4y2BacgydF4y2Ba在PC3和PC3- dr细胞中通过qRT-PCR检测miR-216b-5p在空白组、NC组、ov-LINC01963组、sh-LINC01963组中的表达。PC3细胞用4 nmol/L DTX处理，PC3- dr细胞用40 nmol/L DTX处理。gydF4y2BadgydF4y2BaLINC01963和miR-216b-5p的结合位点如图所示。gydF4y2BaegydF4y2Ba使用双荧光素酶法测定LINC01963和miR-216b-5p之间的结合位点。gydF4y2BafgydF4y2Ba使用AGO-RIPA法测定LINC01963和miR-216b-5p之间的结合位点。gydF4y2BaggydF4y2BaLINC01963和miR-216b-5p之间的结合位点采用下拉法测定。数据以三次技术重复的平均值±标准差表示。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

沉默的miR-216b-5p增强了前列腺癌对DTX的耐药性，并逆转了对LINC01963的干扰作用gydF4y2Ba

接下来，我们发现，与NC组相比，转染miR-216b-5p mimic和inhibitor后，PC3-DR细胞中miR-216b-5p的表达分别显著上调和下调(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．然后用40 nmol/L DTX处理PC3-DR细胞。与NC组相比，miR-216b-5p模拟组的增殖率、迁移率和侵袭率明显降低，而miR-216b-5p抑制剂组的增殖率、迁移率和侵袭率明显升高(图2)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．此外，与NC组相比，miR-216b-5p模拟组G1期细胞百分比和凋亡率明显升高，而miR-216b-5p抑制剂组G1期细胞百分比和凋亡率明显降低(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．上述结果表明，miR-216b-5p过表达降低了PC3-DR细胞对DTX的抗性。miR-216b-5p沉默具有相反的效果。gydF4y2Ba

图6:miR-216b-5p降低了前列腺癌的DTX耐药，逆转了LINC01963对细胞增殖的作用。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba采用qRT-PCR检测miR-216b-5p在PC3-DR细胞中的表达。PC3-DR细胞未接受DTX处理。gydF4y2BabgydF4y2Ba用40 nmol/L DTX处理转染的pc3 - dr细胞后，MTS检测细胞增殖情况。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba细胞凋亡(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和G1相分布(gydF4y2BadgydF4y2Ba40 nmol/L DTX处理后的pc3 - dr细胞。结果显示为平均值±标准差。gydF4y2BaegydF4y2Ba流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期，显示凋亡和细胞周期的代表性图像。数据以三次技术重复的平均值±标准差表示。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与空白组相比< 0.001。gydF4y2Ba# # #gydF4y2BaPgydF4y2Ba与sh-LINC01963-2+NC抑制剂组比较< 0.001。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

此外，与sh-LINC01963-2+NC抑制剂组相比，sh-LINC01963-2+ miR-216b-5p抑制剂组在PC3-DR细胞中miR-216b-5p表达明显下调(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．进一步研究发现，与sh-LINC01963-2+NC抑制剂组相比，sh-LINC01963-2+ miR-216b-5p抑制剂组的细胞增殖率、迁移率、侵袭率明显升高，而G1期细胞百分比和凋亡率明显降低(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这些结果表明miR-216b-5p沉默可以逆转LINC01963干扰对DTX耐药性的影响。gydF4y2Ba

NTRK2是miR-216b-5p的靶基因gydF4y2Ba

Targetscan 7.2和miRWalk发现，编码TrkB蛋白的NTRK2是miR-216b-5p的下游靶基因。NTRK2的3 ' -UTR与miR-216b-5p的结合位点如图所示。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba．双荧光素酶实验结果表明，miR-216b-5p模拟物显著抑制WT-3-UTR NTRK2的荧光素酶活性，但不影响Mut-3 NTRK2的荧光素酶活性(图2)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．然后分别在40 nmol/L DTX处理的PC3- dr细胞和4 nmol/L DTX处理的PC3细胞中检测TrkB mRNA的表达和蛋白水平。与空白组比较，NC组PC3- dr或PC3细胞中TrkB蛋白水平无明显差异。与NC组相比，ov-LINC01963组PC3- dr和PC3细胞中TrkB蛋白水平明显升高，而sh-LINC01963组TrkB蛋白水平明显降低(图2)。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．此外，与NC组相比，PC3-DR细胞中miR-216b-5p模拟组的TrkB蛋白水平显著降低，而miR-216b-5p抑制剂组的TrkB蛋白水平显著升高(图2)。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)．然而，在PC3和PC3- dr细胞中，NTRK2在各组中的表达均无明显变化(图2)。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)．这些结果表明，NTRK2在PC3-DR细胞中是miR-216b-5p的靶点，miR-216b-5p在转录后调控中调控TrkB蛋白水平。gydF4y2Ba

图7:NTRK2是miR-216b-5p的靶基因。gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba

PC3- dr细胞用40 nmol/L DTX处理，PC3细胞用4 nmol/L DTX处理。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba通过Targetscan 7.2和miRWalk分析NTRK2的3 ' -UTR与miR-216b-5p之间的结合位点。gydF4y2BabgydF4y2Ba使用双荧光素酶法测定NTRK2的3 ' -UTR与miR-216b-5p之间的结合位点。gydF4y2BacgydF4y2Bawestern blot检测4 nmol/L DTX处理的PC3细胞和40 nmol/L DTX处理的PC3- dr细胞中TrkB蛋白水平。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与空白组相比< 0.001。gydF4y2BadgydF4y2Bawestern blot检测40 nmol/L DTX处理的PC3-DR细胞中TrkB蛋白水平。＊＊＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba与空白组相比< 0.001。gydF4y2BaegydF4y2Ba采用qRT-PCR方法检测4 nmol/L DTX处理的PC3细胞和40 nmol/L DTX处理的PC3- dr细胞中NTRK2 mRNA的表达。数据以三次技术重复的平均值±标准差表示。gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

TrkB增强前列腺癌的DTX耐药，逆转LINC01963沉默和miR-216b-5p过表达的作用gydF4y2Ba

此外，与ov-NC组相比，NTRK2- pcdna3.1 (ov-NTRK2)和sh-LINC01963慢病毒或miR-216b-5p mimic共转染PC3-DR细胞后，NTRK2 mRNA表达和TrkB水平显著上调。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．40 nmol/L DTX处理后，ov-NTRK2组的增殖率、迁移率和侵袭率均显著高于ov-NC组(补充图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．这些结果表明，在用40 nmol/L DTX处理的PC3-DR细胞中，TrkB增强了前列腺癌对DTX的耐药性，并逆转了LINC01963沉默和miR-216b-5p过表达的作用。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

大多数前列腺癌患者最终会产生DTX耐药性，导致肿瘤进展或死亡。许多lncrna影响DTX的化学敏感性，这表明lncrna可以作为前列腺癌进展中耐药的靶点gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba．在本研究中，根据我们的lncRNA测序和qRT-PCR结果，我们发现LINC01963在DTX耐药PC3细胞中过表达，提示它可能是前列腺癌DTX反应的潜在调节基因。gydF4y2Ba

既往研究表明，LINC01963在胰腺癌和口腔及口咽鳞癌组织中表达较低，具有致癌作用，是预后不良的标志gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba．我们发现LINC01963沉默增强了PC3-DR细胞对DTX的化学敏感性，这表明LINC01963是治疗DTX耐药前列腺癌患者的潜在治疗靶点。既往研究表明过表达LINC01963可抑制胰腺癌的生长和转移gydF4y2Ba26gydF4y2Ba在本研究中，我们发现LINC01963过表达促进前列腺癌化疗耐药，提示LINC01963在不同肿瘤中发挥不同作用。gydF4y2Ba

miRNAs在前列腺癌的DTX耐药中也起着重要作用gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba．在本研究中，miR-216b-5p在PC3- dr细胞中的表达明显低于PC3细胞。先前的研究发现miR-216b-5p在胰腺癌和肝细胞癌中起抗癌基因的作用gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba．miR-216b-5p是增强卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的关键基因gydF4y2Ba31gydF4y2Ba．此外，miR-216b-5p过表达抑制前列腺癌细胞增殖和迁移，增强前列腺癌细胞对紫杉醇的化学敏感性gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba．这些研究表明miR-216b-5p可以抑制前列腺癌的发展和紫杉醇耐药。与这些先前的结果类似，miR-216b-5p在前列腺癌中抑制进展并改善DTX耐药性。同时，miR-216b-5p被SNHG1和LINC00518结合，而LINC00518已被证明可以调节癌细胞的化疗耐药性gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba．在本研究中，我们发现沉默LINC01963通过与miR-216b-5p结合增强了PC3-DR对DTX的化学敏感性。gydF4y2Ba

接下来，我们发现miR-216b-5p可以结合NTRK2的3 ' -UTR并抑制TrkB蛋白水平。TrkB刺激肿瘤细胞存活和血管生成，促进化疗耐药和肿瘤发生，提示TrkB是改善化疗耐药和肿瘤发生的新靶点gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba．据报道，TrkB蛋白水平在前列腺癌组织中过表达，TrkB表达的增强促进了肿瘤的生长和转移gydF4y2Ba36gydF4y2Ba．在这项研究中，我们发现TrkB增强了前列腺癌中的DTX耐药，并逆转了LINC01963沉默和miR-216b-5p过表达的作用。与先前的结果一致，本研究表明TrkB有助于化疗耐药、肿瘤发生和转移gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba．这些发现也表明，LINC01963沉默抑制TrkB蛋白水平，通过与miR-216b-5p结合，增强PC3-DR细胞对DTX的化学敏感性。gydF4y2Ba

综上所述，沉默LINC01963/miR-216b-5p/TrkB轴可以增强PC3-DR细胞对DTX的化学敏感性。这些结果说明了前列腺癌DTX耐药的机制，提示LINC01963是治疗DTX耐药前列腺癌患者的一种新的治疗靶点。gydF4y2Ba