p21活化激酶2与转录因子SOX2结合并上调DEK，促进肺鳞状细胞癌的进展gydF4y2Ba

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．肺癌一般分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)两种，NSCLC又可分为大细胞肺癌、肺鳞状细胞癌(LSCC)和肺腺癌gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．在三种亚型中，LSCC约占NSCLC的30%，其特点是生存率低，复发率高gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．尽管对LSCC的治疗进行了大量的努力，但一些现有的治疗方案，包括一种新开发的靶向治疗，都未能取得令人满意的治疗效果，这可能与LSCC复杂的基因组模式有关gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba．因此，寻找新的靶点是发展LSCC治疗的迫切需要。gydF4y2Ba

SOX2是一种转录因子，作为多能干细胞的调节因子，已被确定为鳞状上皮的发育和维持的贡献者gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．在一系列鳞状细胞癌(SCCs)中已经报道了SOX2的扩增及其致癌性。gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}．更重要的是，之前的研究已经揭示了SOX2参与LSCCgydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．然而，SOX2参与LSCC进展的分子机制尚不清楚。我们的生物信息学分析最初确定p21活化激酶2 (PAK2)是一种与SOX2相互作用的蛋白，值得注意的是，SOX2与PAK2之间的相互作用在之前的系统分析中已被揭示gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．有趣的是，最近的一个病例表明PAK过表达与口腔SCC有关gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba而PAK2在LSCC中的潜在作用尚不清楚。因此，本研究旨在通过PAK2与SOX2的相互作用，探讨PAK2对LSCC的潜在影响。gydF4y2Ba

除了SOX2与PAK2的相互作用外，也有研究认为SOX2介导的缺陷核(defective kernel, DEK)上调有助于SOX2在LSCC中的调控作用gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．DEK是一种典型的致癌基因，参与了多种癌症的进展gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．此外，DEK在NSCLC中表达上调，DEK过表达参与了NSCLC的发病过程，刺激了NSCLC细胞的增殖和侵袭gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．在本研究中，我们假设PAK2通过与SOX2的正向相互作用和上调DEK的表达来诱导LSCC的发生和发展。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

以“肺鳞状细胞癌”为关键词，分别从GeneCards(相关性评分:前300个基因)、DisGeNET(筛选标准:评分≥0.1)和Phenolyzer数据库中检索lscc相关基因，然后使用jvenn工具进行交叉，以识别候选基因。通过生物信息学工具STRING(置信度0.4)进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，筛选关键靶点。采用Mann-Whitney U法检测TCGA数据库中LSCC与相邻正常样本候选基因的差异表达，格式为每百万reads转录本，然后进行log2转换。R(3.6.3版)“ggplot2”包用于绘制箱线图。从KMplot数据库中检索肺癌样本中HRAS和SOX2表达的Kaplan-Meier生存曲线，根据基因表达的中位数将患者分为两组，以gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01为阈值。gydF4y2Ba

随后，利用GeneCards和BioGRID数据库预测与SOX2互作的基因，并通过PPI网络分析鉴定关键上游PAK2。利用starBase工具对TCGA数据库中PAK2和SOX2进行共表达分析。通过JASPAR数据库(Organisms: homo sapiens)预测了两者之间的结合位点。gydF4y2Ba

伦理批准gydF4y2Ba

这项研究是根据gydF4y2Ba赫尔辛基宣言gydF4y2Ba经南昌大学第一附属医院伦理委员会批准。向所有患者解释详细的研究目标和计划的程序，随后向所有患者提供签署的知情同意文件。动物实验经南昌大学第一附属医院动物护理使用委员会批准，并按规定进行gydF4y2Ba《实验动物护理和使用指南》gydF4y2Ba由美国国立卫生研究院发表。gydF4y2Ba

组织收集和细胞培养gydF4y2Ba

收集2015年1月至2017年3月在南昌大学第一附属医院行首次手术的LSCC患者共83例LSCC组织及相邻正常组织。这些患者术前从未接受过化疗或放疗，术后按照2004年国家综合癌症网络(NCCN)肿瘤学临床实践指南:非小细胞肺癌接受了标准治疗。如果癌症复发，后续治疗方法由负责的医生决定。所有病例均按照世界卫生组织LSCC标准进行分类。gydF4y2Ba

4株LSCC细胞系(LTEP-S, SK-MES-1, NCI-H2170, NCI-H520)， 1株正常肺上皮细胞系BEAS-2B和正常人胚胎肾HEK-293T细胞系购自国家细胞系资源基础设施。BEAS-2B和LTEP-S细胞在含10%胎牛血清(FBS, GIBCO)的高糖DMEM (GIBCO, Grand Island, NY)中培养。NCI-H2170和NCI-H520细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO)中培养。HEK-293T和SK-MES-1细胞在含10% fbs的MEM培养基(GIBCO)中培养。所有细胞在5% CO中培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba培养箱在37°C和95%饱和湿度。gydF4y2Ba

免疫组织化学(包含IHC)gydF4y2Ba

切片依次浸泡在二甲苯-无水乙醇-95%乙醇-70%乙醇中(每次5分钟)，然后用0.01 M柠檬酸钠缓冲液在95℃加热。然后在室温下用正常的山羊血清阻塞溶液阻塞切片。切片用相应的一抗(anti-SOX2, ab97959, 1:100;anti-PAK2, ab76293, 1:200;anti-DEK, ab249362, 1:100;Abcam，剑桥，英国)。然后用二抗在室温下孵育1 h。DAB显色后，切片用苏木精复染镜检。gydF4y2Ba

细胞转染gydF4y2Ba

将LSCC细胞株NCI-H2170和NCI-H520分为15组，分别用短发夹RNA (shRNA, sh)阴性对照(NC)、sh- sox2 -1、sh- sox2 -2 -2、sh- sox2 -3、过表达(oe)-NC、oe- sox2、oe- pak2 + sh-NC、oe- pak2 + sh- sox2、sh- pak2、sh- dek -1、sh- dek -2、sh- dek -3、sh-NC + oe-NC、sh- sox2 + oe-NC、sh- sox2 + oe- dek处理。过表达载体为pcDNA3.1, RNAi载体为pRNAT-U6.1/neo，均由GenePharma(中国上海)设计构建。转染按照Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)的协议进行。然后用G418 (400 ug/ml)培养细胞，筛选沉默DEK的稳定细胞。2周后，再次用G418 (200 ug/ml)培养细胞，筛选稳定转染的NCI-H2170和NCI-H520细胞，培养2个月。gydF4y2Ba

RNA提取及定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)gydF4y2Ba

用TRIzol试剂(15596026,Invitrogen)从组织中提取总RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit (RR047A, Takara, Shiga, Japan)的规程，将RNA反转录为cDNA。然后采用SYBR Premix EX Taq试剂盒(RR420A, Takara)和ABI7500 PCR系统(ABI, Foster City, CA)进行qRT-PCR检测。引物由上海生工生物技术有限公司(上海，中国)合成，详见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．每组重复3口井。此外，相对定量方法(2gydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCTgydF4y2Ba}方法)计算相对转录水平(归一化为β-actin)。gydF4y2Ba

Western blot检测gydF4y2Ba

利用含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白，然后使用BCA检测试剂盒(70-PQ0012, Multi Sciences，杭州，浙江，中国)测定蛋白浓度。然后用SDS-PAGE分离蛋白(50µg)，电转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉在室温下封堵1 h。然后用稀释后的兔一抗(抗dek (ab74975, 1:500, Abcam)、抗ki67 (ab16667, 1:100, Abcam)、抗sox2 (ab97959, 1:100, Abcam)、抗mmp -9 (ab137867, 1:100, Abcam)、抗e -cadherin (ab15148, 1:500, Abcam)、抗n -cadherin (ab18203, 1:100, Abcam)、抗-β-肌动蛋白(ab227387, 1:50, Abcam) 4℃孵育过夜。清洗后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗(ab97051, 1:2000, Abcam)进一步孵育1小时。然后使用增强型化学发光检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific, San Jose, PA)来可视化蛋白质带。此外，利用ECL荧光检测试剂盒(BB-3501, Amersham, Little Chalfont, UK)对印迹进行可视化，并使用Bio-Rad图像分析系统(Bio-Rad, Hercules, CA)对图像进行拍摄。蛋白条带灰度用Quantity One v4.6.2软件定量，归一化为β-actin。gydF4y2Ba

免疫共沉淀(Co-IP)试验gydF4y2Ba

细胞用RIPA缓冲液(赛默飞世尔科学公司)裂解，超声30分钟，13000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置30分钟。特异性抗体和上清液在4℃下混合过夜，然后用Pierce protein A/G磁珠(Thermo, 88803)孵育4小时。离心收集珠粒，与负载缓冲液混合，SDS-PAGE和Western blot检测。gydF4y2Ba

谷胱甘肽- s -转移酶(GST)下拉试验gydF4y2Ba

从NCBI参考序列NM_002577.4中获得PAK2的CDS序列，由北京ABXBio构建到Pgex-4T-3质粒中，形成GST-PAK2重组表达载体，并转化到e.c oli Rosetta中。阳性克隆后，IPTG诱导原核表达，谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化GST-PAK2蛋白。纯化的GST-PAK2蛋白和gst标记蛋白与GST-Beads(固定化谷胱甘肽)在EP管中混合，在色谱柜中4°C旋转1 h。收集转染过表达SOX2质粒的细胞，充分裂解，取20%的裂解液作为输入(阳性对照)。然后将剩余的裂解液添加到EP管中，在色谱柜中以4°C旋转4小时。然后用SOX2抗体Western blot对GST-Beads进行洗涤和分析。此外，在洗涤前取2%体积的混合物进行Western blot分析。gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀(ChIP)试验gydF4y2Ba

将各组NCI-H2170和NCI-H520细胞用甲醛固定10 min，产生dna -蛋白质交联，用超声干扰器裂解(每个超声10 s，间隔10 s, 15个周期)，将染色质裂解成200-500 bp片段。然后，设置细胞裂解液的10%作为输入。剩下的裂解液在4°C, 12000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟收集上清液，然后分成两管，分别与NC兔IgG (ab109489, 1:300, Abcam)和抗sox2抗体(Upstate Biotech, Lake Placid, NY)在4℃下孵育过夜。然后，dna -蛋白质复合物用Pierce蛋白A/G磁珠(88803，赛默飞世尔科学公司)沉淀，去交联，用苯酚/氯仿提取。用qRT-PCR法检测纯化的DNA片段。gydF4y2Ba

PAK2敲除后，取含有纯化DNA片段的样品，以sh-NC组样品为对照，进行ChIP检测(步骤同上)。用于检测DEK启动子片段富集的引物为:Forward 5 ' -GATCTTTTTCCTTTCGGTG-3 '和Reverse 5 ' -TGCGTGTTTATTGTTTCCA-3 '。gydF4y2Ba

免疫荧光显微镜gydF4y2Ba

转染后的NCI-H2170和NCI-H520细胞用4%聚亚甲基甲醛固定，0.3% Triton-X100渗透15min, 5% BSA阻断，抗sox2抗体(1:400;Cell Signaling Tech, Danvers, MA)， 4°C，然后用Alexa Fluor 488 (Beyotime，北京，中国)标记的抗兔免疫球蛋白G二抗孵育。然后用DAPI (Sigma, St. Louis, MO)对细胞进行染色，然后使用CFD激光扫描显微镜(DFC420C, LEICA, Wetzlar, Germany)对细胞进行免疫荧光显微镜观察。gydF4y2Ba

磷酸化检测gydF4y2Ba

用蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Sigma)进行裂解处理细胞，然后用碱性磷酸酶(FastAP, Thermo Fisher Scientific)将去磷酸化的样品孵育1小时，然后利用Mn分离蛋白质gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-Phos-TaggydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba如上所述的SDS-PAGEgydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)测定gydF4y2Ba

细胞增殖检测采用Cell Counting kit -8试剂盒(Dojindo, Kumamoto, Japan)。简言之，将NCI-H2170和NCI-H520细胞接种到96孔板中。转染后24、48、72、96 h，每孔分别加入10 μl CCK-8试剂孵育1 h。然后，利用微孔板阅读器评估450 nm处的吸光度。gydF4y2Ba

Transwell化验gydF4y2Ba

迁移实验:将LSCC细胞悬液加入Transwell系统的上腔，将预冷的含10% FBS的DMEM加入下腔。腔室在5% CO中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37℃保温24小时。下腔细胞用甲醇固定30min, 0.1%结晶紫试剂染色20min，倒置干燥。在倒置显微镜下随机选取5个视场，计算穿透膜的细胞数量。gydF4y2Ba

侵袭法:在上腔聚碳酸酯膜上加入稀释的基质。以下步骤与迁移试验相同。gydF4y2Ba

体内实验gydF4y2Ba

24周龄BALB/C裸鼠60只，购自南昌大学第一附属医院动物中心，随机分为6组(每组10只)。将sh-DEK-1、sh-DEK-2、sh-NC处理的NCI-H2170或NCI-H520细胞皮下注射于相应组小鼠大腿。然后，每周检查移植瘤的大小，按公式(a*b .)计算体积gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)/2 (a:肿瘤最长直径;B:肿瘤最短直径)并记录。注射六周后，裸鼠被安乐死。肿瘤被切除并称重。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

本研究的数据采用SPSS v.22.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL)软件进行处理。测量数据汇总为均数±标准差。配对gydF4y2BatgydF4y2Ba-test用于LSCC组织与相邻正常组织的比较，未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba两组数据比较采用-test。多组数据间比较采用单因素方差分析(ANOVA)， Tukey事后检验。组间肿瘤体积比较采用双向方差分析或Tukey事后检验重复测量方差分析。LSCC组织中各因子表达相关性采用Pearson相关分析。采用Kaplan-Meier方法计算LSCC患者的总生存(OS)曲线，log-rank分析患者之间的生存差异。应用Cox回归分析LSCC的预后相关因素。此外,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为差异有统计学意义。gydF4y2Ba

SOX2在LSCC组织中高表达，与LSCC预后不良相关gydF4y2Ba

从GeneCards(前300名)、DisGeNET(得分≥0.1的)和Phenolyzer数据库中检索lscc相关基因，然后将结果交叉得到19个候选基因(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．19个基因在LSCC中的表达(gydF4y2BangydF4y2Ba= 502)和正常样本(gydF4y2BangydF4y2Ba= 49)， HRAS和SOX2在LSCC肿瘤样本中均有高表达gydF4y2BapgydF4y2Ba值最小(图;gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．PPI网络分析结果进一步显示，HRAS和SOX2处于网络的核心位置(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．KMplot数据显示，仅SOX2与肺癌患者预后不良相关，且SOX2高表达的肺癌患者生存率较低(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．选择SOX2作为候选基因。gydF4y2Ba

为了验证这些结果，我们用qRT-PCR检测了83例LSCC患者的LSCC组织及邻近正常组织中SOX2的表达。与邻近组织相比，LSCC组织中SOX2的表达升高(图2)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)，且LSCC分期越高，SOX2表达越高(图2)。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．我们进一步评估了83例患者中SOX2表达与临床病理因素的关系(补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)， SOX2表达与LSCC TNM分期(及淋巴结转移)呈正相关。SOX2表达与其他临床病理因素无相关性。Kaplan-Meier曲线分析显示，SOX2表达较高的LSCC患者OS和无病生存期(DFS)更短(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

免疫组化结果也证实了SOX2在代表性LSCC组织中相对于邻近正常组织表达上调(图2)。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外，通过单因素分析，我们进一步发现SOX2表达、T分期、TNM分期和淋巴结转移与OS显著相关，而多因素分析认为它们是LSCC患者的独立预后因素(补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．此外，我们通过qRT-PCR和Western blot检测了SOX2在四种LSCC细胞系(LTEP-S、SK-MES-1、NCI-H2170和NCI-H520)和正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中的表达(图2)。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．结果显示，SOX2在LSCC细胞中的表达较BEAS-2B细胞有所增加，且在NCI-H2170和NCI-H520细胞中表达最高，因此选择这两个细胞进行后续实验。gydF4y2Ba

SOX2的下调抑制LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭潜能gydF4y2Ba

在鉴定了SOX2在LSCC组织和细胞中的上调表达后，我们进一步探讨了SOX2失调对LSCC细胞的影响。构建3个靶向SOX2的shrna，转染到NCI-H2170和NCI-H520细胞中，利用qRT-PCR和Western blot技术鉴定sh-SOX2-2 -2和sh-SOX2-2是两个SOX2沉默效率最好或次好的sh- rna(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．我们选择sh-SOX2-1和sh-SOX2-2转染LSCC细胞(NCI-H2170和NCI-H520)。gydF4y2Ba

转染成功后，我们采用CCK-8法检测转染后NCI-H2170和NCI-H520细胞的活力(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．结果表明，无论是sh-SOX2-1还是sh-SOX2-2诱导的SOX2敲除均能明显抑制LSCC细胞的活力。然后，通过Transwell实验，我们证实了SOX2的下调可以抑制LSCC细胞的迁移和侵袭能力(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．此外，我们通过Western blot检测了增殖相关蛋白Ki67和迁移相关蛋白(MMP-9、E-cadherin和N-cadherin)的水平。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，结果表明沉默SOX2减弱了LSCC细胞的侵袭和迁移。综上所述，SOX2的下调能够抑制LSCC细胞的生存能力以及迁移和侵袭潜能。gydF4y2Ba

SOX2直接与PAK2相互作用gydF4y2Ba

上述实验证实了SOX2对LSCC细胞生物学活性的调节作用，但其机制尚不清楚。在这个意义上，我们通过GeneCards和BioGRID数据库(筛选评分≥0.9)搜索sox2相互作用蛋白，得到12个蛋白(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．然后对这些蛋白进行PPI网络分析，其中PAK2、PAK1、OXSM、DDAH2和PRTEDC1相互作用密切(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．此外，从TCGA数据库中，GEPI2分析显示PAK2在LSCC组织中表达上调(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．此外，从TCGA数据库中，starBase分析显示PAK2和SOX2在LSCC组织中表达呈正相关(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了进一步验证两者的相互作用，我们对84例LSCC中PAK2和SOX2的表达进行Pearson相关分析，发现PAK2和SOX2在LSCC中的表达呈正相关(图2)。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．此外，IHC检测显示PAK2在LSCC组织中高表达(图2)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．此外，我们将外源性PAK2和SOX2转入HEK293T细胞，并进行Co-IP实验。结果表明，PAK2与SOX2相互作用(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．接下来，我们在NCI-H2170和NCI-H520细胞中进行了PAK2和SOX2的Co-IP检测，发现内源性PAK2也与SOX2相互作用(图2)。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)．随后，GST下拉试验(图;gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)证实了PAK2与SOX2的直接相互作用。此外，沉默PAK2导致NCI-H2170和NCI-H520细胞中磷酸化的SOX2水平降低(图2)。gydF4y2Ba3 jgydF4y2Ba)．免疫荧光结果一致地显示，SOX2的表达因PAK2敲低而减弱，而在PAK2过表达时上调(图2)。gydF4y2Ba3 kgydF4y2Ba)．综上所述，这些结果表明SOX2与PAK2相互作用。gydF4y2Ba

SOX2参与PAK2对LSCC细胞恶性表型的刺激作用gydF4y2Ba

在鉴定出PAK2和SOX2之间的直接相互作用后，我们接着探讨了这种相互作用在LSCC细胞生物学特性中的作用。为此，我们建立了PAK2过表达和PAK2过表达+ SOX2敲除的NCI-H2170和NCI-H520细胞模型，并通过qRT-PCR和Western blot实验对模型进行验证(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．接下来，CCK-8和Transwell检测结果显示，单独过表达PAK2的LSCC细胞增殖、迁移和侵袭增强(在oes -PAK2 + sh-NC组和oes - nc + sh-NC组中显示)，而其与SOX2下调组合的结果相反，这反映在oes -PAK2 + sh-SOX2组相对于oes -PAK2 + sh-NC组功能减弱(图2)。gydF4y2Ba4 b, CgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．Western blot检测LSCC细胞中增殖相关蛋白Ki67和迁移相关蛋白(MMP-9、E-cadherin和N-cadherin)的表达水平。结果表明，PAK2过表达导致Ki67、MMP-9和N-cadherin水平上调，E-cadherin水平下调，而PAK2过表达和SOX2下调组合则相反(图2)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．综上所述，PAK2只有在SOX存在的情况下才能刺激LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。gydF4y2Ba

PAK2和SOX2共同调控下游DEK基因gydF4y2Ba

最近的研究表明，SOX2在SCC中有一定的作用gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba上调DEK、ETV4、HRAS、SRSF2、JUN、YAP1、SOX2OT、CDH1等基因的表达gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}．在此，我们对这些基因进行了定量分析。结果显示，与正常肺上皮细胞株BEAS-2B相比，DEK在LSCC细胞(LTEP-S, SK-MES-1, NCI-H2170, NCI-H520)中表达上调最为明显(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．免疫组化结果也显示DEK在LSCC组织中的表达升高(图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba，补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．然后利用JASPAR数据库预测SOX2和DEK的结合位点(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，我们在NCI-H2170和NCI-H520细胞中进行了ChIP检测，发现SOX2可以结合DEK的启动子区域(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．根据已发表的SOX2基因组结合图gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}，我们选择SOX1启动子作为NC，分别在NCI-H2170和NCI-H520细胞中通过ChIP法检测SOX2与SOX1启动子的结合。结果显示，SOX2抗体组富集的SOX1启动子片段数量与IgG抗体富集的SOX1启动子片段数量无明显差异(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)，说明SOX2不能与SOX1启动子区结合。接下来，qRT-PCR结果显示，SOX2过表达可导致NCI-H2170和NCI-H520细胞DEK表达升高(图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．随后，通过qRT-PCR检测了PAK2过表达和PAK2过表达+ SOX2敲除的NCI-H2170和NCI-H520细胞模型中DEK的表达(图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．结果表明，单纯过表达PAK2会导致DEK表达升高，而过表达PAK2和敲除SOX2会导致DEK表达降低。gydF4y2Ba

进一步，我们用sh-PAK2处理NCI-H2170和NCI-H520细胞，通过qRT-PCR和Western blot检测，成功地抑制了PAK2在这些细胞中的表达;然后观察到PAK2敲低导致DEK表达降低(图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．然后我们用ChIP方法研究了SOX2和DEK启动子区域的结合。结果，SOX2抗体富集的DEK启动子区域片段在PAK2敲低时明显减少，在PAK2过表达时增加(图2)。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)，表明PAK2敲除抑制了SOX2与DEK启动子区域的结合。然后，通过GEPIA2分析，我们进一步从TCGA数据库验证了DEK在LSCC组织中的表达与SOX2和PAK2的表达呈正相关(图。gydF4y2Ba5 h,我gydF4y2Ba)．PAK2和SOX2共同调控DEK。gydF4y2Ba

DEK敲除抑制LSCC细胞的恶性表型gydF4y2Ba

前期实验揭示了SOX2和PAK2对LSCC细胞生物学活性的影响，并确定DEK为SOX2和PAK2的靶基因。我们推测DEK可能对LSCC细胞也有调节作用。为了验证这一假设，我们设计并构建了三个靶向DEK的shrna，并将其转染到NCI-H2170和NCI-H520细胞中。然后，通过qRT-PCR和Western blot鉴定出沉默效率最好和次好的sh-DEK-1和sh-DEK-2(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)，并选择它们转染LSCC细胞(NCI-H2170和NCI-H520细胞)。gydF4y2Ba

用CCK-8和Transwell试验评估sh-DEK-1或sh-DEK-2转染细胞的生存能力、迁移和侵袭潜力(图2)。gydF4y2Ba6 b, CgydF4y2Ba)，结果表明DEK的下调可以明显抑制LSCC细胞的恶性表型。此外，我们通过Western blot检测NCI-H2170和NCI-H520细胞中增殖相关蛋白Ki67和迁移相关蛋白(MMP-9、E-cadherin和N-cadherin)的表达水平，结果显示沉默DEK抑制Ki67、MMP-9和N-cadherin的表达，促进抗迁移E-cadherin的表达(图2)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)．此外，我们的数据表明，在NCI-H2170和NCI-H520细胞中，SOX2的下调降低了细胞活力，减弱了细胞的迁移和侵袭，下调了Ki67、MMP-9和N-cadherin的表达，上调了E-cadherin的表达;而额外的DEK过表达可以逆转单独敲低SOX2的上述作用(补充图。gydF4y2Ba4a b cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了进一步探索DEK在体内对LSCC发生肿瘤的影响，我们建立了沉默DEK的NCI-H2170和NCI-H520细胞，并注射到裸鼠体内。然后，我们通过qRT-PCR和Western blot检测DEK的表达，结果发现sh-DEK处理后，DEK在异种移植瘤中的表达降低(图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．进一步，如补充图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba6 f, GgydF4y2Ba， DEK下调导致移植瘤体积和重量减小。Western blot结果显示，DEK下调后，移植瘤组织中Ki67、MMP-9、N-cadherin水平下调，E-cadherin水平上调(图2)。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba)．综上所述，无论在体内还是体外，DEK的下调都能抑制LSCC细胞的活力、迁移和侵袭潜能。gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现PAK2通过与SOX2的正向相互作用以及上调致癌DEK的表达来促进LSCC的发展(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

SOX2是一种调节多能干细胞的转录因子，在包括食管鳞状细胞癌在内的一系列鳞状细胞癌中均有SOX2扩增的报道gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba头颈部皮肤鳞状细胞癌gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．更重要的是，越来越多的数据显示SOX2失调参与了LSCC的形成gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．与这些报道一致，我们的生物信息学分析确定了SOX2在LSCC组织中的过表达，并将其与LSCC的不良预后联系起来。此外，通过一系列功能检测，我们证实了SOX2的下调能够抑制LSCC细胞的生存能力以及迁移和侵袭潜能。正如之前的研究所描述的那样，这种对细胞功能的调节作用可能归因于SOX2作为LSCC中反复出现的3q26.33 (SCC中最常扩增的基因组位点之一)扩增的驱动基因gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．在本研究中，我们进一步探索了PAK2的下游分子机制，并鉴定PAK2是一个与sox2互作的基因。这一发现证实了之前的一项研究，即PAK2与SOX2相互作用gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．此外，我们的数据显示PAK2直接与SOX2结合。因此，我们有理由假设PAK2在LSCC的发生过程中发挥了一定的作用。gydF4y2Ba

转录因子SOX2参与多种生物学过程，包括胚胎和成体干细胞的维持、支气管和肺分化、肿瘤发生和细胞存活gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}．最近的数据表明，SOX2在LUSC肿瘤干细胞表型中起着重要作用gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．事实上，SOX2的扩增与其过表达一致，是TCGA队列LUSC中常见的基因组改变gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba．之前的一项研究证实了这一发现，该研究表明中国约75%的LUSC患者携带SOX2扩增gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．我们的工作还发现SOX2过表达发生在LSCC中。然而，在之前的一项研究中，也应该注意SOX2与LSCC预后较好的指标之间的关系，SOX2的增加可能延长LSCC患者的生存期gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．此外，LugydF4y2Ba等gydF4y2Ba．发现SOX2高表达患者的预后可能比SOX2低表达患者更令人满意gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba但这一点不能用密歇根鳞状细胞癌样本重复。此外，有研究者发现SOX2高表达患者的预后优于SOX2低表达患者，但也指出SOX2表达与癌症的病理类型有明显的相关性gydF4y2Ba^{34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}．既往研究提示SOX2高表达的LSCC患者可能预后较好。然而，我们的研究结果表明，SOX2在肺癌发展过程中可能具有致癌性，这可能是由于不同实验室采用的方法不同，例如检测SOX2拷贝数状态的分子方法，或区分不同扩增水平的阈值设置。另一个需要考虑的因素是队列和肿瘤异质性之间的差异。gydF4y2Ba

PAKs属于非受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，已被很好地研究定位在几个信号通路的交叉点，介导多种细胞过程和参与癌症发展gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．本研究发现PAK2在LSCC组织中表达上调，证实PAK2可引发LSCC细胞的恶性行为。此外，通过一系列功能的增益和损失实验，我们发现SOX2的存在是PAK2对LSCC细胞起调节作用的前提条件。也就是说，PAK2通过与SOX2相互作用调节LSCC的形成。随后，我们探索了其下游机制，发现PAK2和SOX2共同调控DEK基因。DEK作为一种典型的癌基因，在多种癌症中均有上调的报道gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．此外，越来越多的证据表明DEK在NSCLC中的过表达参与了NSCLC的发病机制gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba刺激NSCLC细胞的增殖和侵袭gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．与这些报道一致，我们的数据证实了DEK的敲除可以抑制LSCC细胞的恶性表型。我们的体内实验进一步验证了DEK敲除对lscc的抑制作用。鉴于DEK由SOX2和PAK2共同调控，本研究确定了PAK2/SOX2/DEK轴参与LSCC的发病机制。gydF4y2Ba

综上所述，PAK2与转录因子SOX2结合，从而激活DEK的表达，从而促进LSCC细胞的恶性行为和肿瘤生长。过表达PAK2可增强LSCC细胞的生存能力和迁移侵袭能力，而下调SOX2或DEK可逆转PAK2过表达的促进作用。本研究为深入了解LSCC的发病机制奠定了理论基础。更重要的是，我们的发现为加强LSCC的靶向治疗提供了新的治疗靶点和有见地的信息。gydF4y2Ba