母乳寡糖2 -fucosyllactose和6 -sialyllactose防止坏死性小肠结肠炎的发展通过抑制toll样受体4信号gydF4y2Ba

坏死性小肠结肠炎(NEC)是死亡的主要原因在早产儿胃肠道疾病,特点是突然小肠坏死,导致在许多情况下,压倒性的败血症和死亡。gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba患者的总体生存NEC自第一次描述了疾病并没有改善,gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba和总人数稳步上升的全球早产,gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba存在一个更大的紧迫性比以往任何时候都了解它的起源和发展一种新的策略,可以防治老年人的。我们gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}和其他人gydF4y2Ba^7gydF4y2BaNEC发展已经确定了分子的解释,NEC结果夸大了信号在肠道上皮细胞对脂多糖受体的激活toll样受体4 (TLR4),更高的过早与足月肠相比。gydF4y2Ba^8gydF4y2BaTLR4激活的细胞腔的脂多糖(LPS)导致肠道粘膜的破坏,gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba导致细菌易位到血液中,gydF4y2Ba^10gydF4y2BaTLR4的活化的内皮细胞导致血管收缩和特征NEC的肠道缺血。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba由于缺乏特定的治疗NEC,关注的焦点已经转移到预防战略,特别是在那些风险最大的婴儿疾病的发展。gydF4y2Ba

所有的相关策略与NEC保护婴儿,母乳是绝对最有效的管理。为了了解母乳的分子组件负责其防护效益,我们gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba和其他人gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}表明母乳寡糖(hmo),一个家庭的non-digestible碳水化合物存在于母乳,可以防止NEC在实验模型,通过机制是未知的。此外,还有争议关于hmo在生命早期的作用,正如先前的作者已经证明某些hmo不能防止小猪在生命早期NEC。gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba现在我们假设hmo防止NEC部分通过直接抑制TLR4信号在早产儿肠,我们寻求测试使用鼠标,小猪和人体组织模型的这种疾病。gydF4y2Ba

化学试剂gydF4y2Ba

(目录没有RNeasy®工具包。74106;试剂盒)和QuantiTect®逆转录(目录号205313;TUNEL试剂盒)(终端原位dUTP-fluorescein尼克结束标签)工具包(原位细胞死亡检测设备、荧光素、目录。11684795910;罗氏公司),3 '硝基酪氨酸(3 ' - nt)抗体(目录没有。ab61392;Abcam), NF-kBp65 (F-6)抗体(目录没有。sc - 8008; Santa Cruz Biotechnology), 4’,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (catalog no. D9542; Sigma), and LPS from大肠杆菌gydF4y2Ba0127:B8(σ;目录没有。L3129)。正向和反向引物是定制设计使用NCBI Primer-BLAST在线程序,命令从集成DNA技术和表中列出gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。从美国获得的小肠上皮细胞IEC-6类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。TUNEL来自罗氏生命科学。使用执行定量实时PCR引物在表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba所述。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba所有的人类肠道得到通过放弃从人体研究办公室同意,约翰霍普金斯大学(IRB00094036)和消除识别信息的方式收集。Galacto-oligosaccharide (GOS)从Biosynth Carbosynth(纽伯里,伯克希尔哈撒韦公司、英国)。gydF4y2Ba

动物研究gydF4y2Ba

所有实验中老鼠按照指南中建议进行实验动物保健和使用的美国国立卫生研究院,通过动物保健和使用委员会的约翰霍普金斯大学(协议号MO17M304 SW18M206),根据到达的指导方针“NC3R。”gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba实验NEC在7-8-day-old诱导(约3 g体重)新生儿老鼠幼崽如前所述和验证。gydF4y2Ba^17gydF4y2BaNEC是诱导后口服填喂法的公式是我们最近的一篇论文中描述gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba,由雅培Similac推进:在同等浓度Esbilac犬代乳品,补充与细菌股票已经从一个婴儿的粪便培养严重NEC(12.5μl凳子泥浆的1毫升的公式)。新生儿幼仔gavage-fed(50μl / g)每天五次与细菌泥浆配方补充使用24-French angiocatheter放在鼠标食道。小鼠缺氧暴露(5%啊gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,95% NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba为10分钟)室(Billups-Rothenberg Inc .)早上7点和1点后立即饲料4天。NEC公式是补充2》fl, 6“sl,乳糖(LAT)或非政府组织表示。同时,质询C57 / BL6小鼠随机分为六组:saline-control(我),(2)有限合伙人,有限合伙人(iii) + 2“fl,有限合伙人(iv) + 6”sl,有限合伙人(v) + 2“fl + 6”sl, (vi)有限合伙人+ LAT。表示,HMO,非政府组织或口服药物在200年10毫克/公斤μl /老鼠1 h之前注射LPS(5毫克/公斤,intraperitonially)。所有小鼠安乐死6 h后,样品小肠的收获。gydF4y2Ba

NEC在小猪决定的影响诱导2“fl和6”像我们描述了sl。gydF4y2Ba^19gydF4y2BaTimed-pregnant白约克郡(Yorkshire×长白猪)母猪从橡树山获得遗传学(尤因,IL),和小猪是提前交付通过剖腹产2 ~ 90%怀孕和管理“fl或6”sl(10毫克/毫升,每个单独或结合5毫克/毫升)。小猪不诱导开发NEC安乐死在出生和用作控制。gydF4y2Ba

评价2的分子对接的fl, 6“sl,并与TLR4-MD2 LATgydF4y2Ba

分子对接是用于分析的绑定效率2“fl, 6“sl,和消极的标准,LAT, LPS-binding TLR4-MD2复杂的口袋里。斯巴达18(波函数,Inc .,欧文,CA)被用来消除拮抗剂Eritoran从PDB代码2 z65,三元eritoran-TLR4-MD2复杂的晶体结构,gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba和准备结果TLR4-MD2脱辅基蛋白复杂的分子对接。生物相关的构象2“fl和6”sl,提取5 dux PDB代码gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba和4 en9,gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba分别被用于TLR4-MD2对接实验。Autodock维纳gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba结合PyRxgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba了优化对接复合物与对接的−5.6千卡/摩尔分数2 fl和−6.7千卡/摩尔6 sl。相比之下,对接提供的负控制LAT−4.8千卡/摩尔的对接得分较低。标准对接程序后,配体被定义一个网格停靠盒20×20×20在cup-sized LPS识别TLR4-MD2复杂的口袋里。PyMOLgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba(PyMOL分子图形系统,版本2.3.1薛定谔,LLC)是用于可视化。gydF4y2Ba

补充的婴儿配方奶粉2“fl和6”sl防止老鼠NEC剂量依赖性的方式gydF4y2Ba

我们第一次试图评估是否最丰富的中性HMO,即2的fl,最丰富的酸性HMO,即6 ' sl可以防止NEC,单独或组合,在NEC的完善的模型。如无花果所示。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba,小鼠的肠诱导开发NEC显示广泛水肿,壁变薄,肠内和空气墙(也称为gydF4y2Ba积气intestinalisgydF4y2Ba签名找到人类NEC),在dam-fed控制小鼠未见,肠道是粉红色和健康的出现(图。gydF4y2Ba1 (i, ii)gydF4y2Ba)。组织学检查NEC肠暴露出大量的绒毛脱落,黏膜下层分离,在粘膜下水肿和肌肉层(图。gydF4y2Ba1 b (i, ii)gydF4y2Ba)。NEC感应也导致重要的肠粘膜炎症的发生,所表示的促炎细胞因子的表达肿瘤坏死因子(TNF) -α和高NEC严重度评分评估使用有效的评分系统,gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba母乳喂养的控制相比,促炎细胞因子诱导和疾病严重程度评分都是最小的(图。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)。因为2“fl和6”sl源自牛奶碳水化合物纬度,我们评估纬度作为消极的控制,考虑到这是一个可以保持酶的消化碳水化合物,与hmo 2“fl和6”sl,因为它是这些hmo的骨干分子。gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba如无花果所示。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba的婴儿配方奶粉,政府补充LAT导致没有针对NEC的防护效益,以总出现肠(无花果。gydF4y2Ba1哎gydF4y2Ba),肠道组织学(无花果。gydF4y2Ba1 biiigydF4y2Ba),细胞因子诱导(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba),NEC严重性(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)和体重(无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。相比之下,婴儿配方奶粉的补充与2“fl或6”sl显著防止NEC开发,所表现的改善总出现肠(无花果。gydF4y2Ba1 aiv, cigydF4y2Ba),肠道组织学(无花果。gydF4y2Ba1 biv,迪gydF4y2Ba),细胞因子诱导(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba),NEC严重性(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)和体重(无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。2“fl和6”sl的结合在一起,在同一HMO用量为总碳水化合物仅产生任何额外的保护(无花果。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)。值得注意的是低剂量的2“fl或6”sl对NEC严重程度没有影响,特别是在较短的时间点(补充图。gydF4y2Bas1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

进一步评估的程度2“fl和6”sl可以防止NEC,两个额外的测量积分为NEC的发病机制进行:活性氧species-mediated粘膜损伤,所显示的表达3 ' - nt的肠道粘膜,gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba和肠上皮细胞凋亡,以TUNEL染色。如无花果所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,3 ' - nt和TUNEL染色都强烈表达小鼠肠上皮细胞内与NEC(无花果。gydF4y2Ba2 (2,2)、b (ii,二世)gydF4y2Ba控制),而母乳喂养的老鼠显示最少的表达式(图。gydF4y2Ba2 a(我),(我的)gydF4y2Ba),符合我们之前的报告。gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}重要的是,两个3 ' - nt和TUNEL染色在肠道粘膜显著降低小鼠与NEC的婴幼儿配方奶粉也补充了2》fl或6的sl(无花果。gydF4y2Ba2 (iii, iv, iii, iv)、b (iii, iv, iii, iv)gydF4y2Ba(图)或它们的组合。gydF4y2Ba2 (v, v)、b (v, v)gydF4y2Ba),在图中看到量化。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba。综上所述,这些研究结果表明,政府2“fl和6”sl,单独或结合,防止NEC在老鼠模型中。评估潜在的转化这些发现的意义,我们下一个评估疾病的一个有效的小猪模型。gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba

补充的营养配方2“fl和6”sl防止NEC NEC的小猪模型的发展gydF4y2Ba

比小猪管理控制公式没有添加hmo,公式的补充与2的fl(10毫克/公斤)或6的sl(10毫克/公斤)或其组合10毫克/公斤,显著降低NEC严重性(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),揭示了改善毛形态外观(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),完整的组织架构(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba),正常水平的促炎细胞因子TNF-α和interleukin-1β(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba),并显著降低平均NEC分数(图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。此外,3 ' - nt表达式和粘膜上皮细胞凋亡均丰富的仔猪肠粘膜的NEC(无花果。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba),这些研究结果都显著降低的水平表达的控制小猪(无花果。gydF4y2Ba3 e(我),f(我)gydF4y2Ba),仅在NEC小猪补充2“fl(无花果。gydF4y2Ba3 e(三世,三世),f(三世,三世)gydF4y2Ba),仅6 ' sl(无花果。gydF4y2Ba3 e (iv, iv), f (iv, iv)gydF4y2Ba),或两个hmo结合(无花果。gydF4y2Ba3 e (v, v), F (v, v)gydF4y2Ba3 ' - nt,荧光定量和TUNEL染色图所示。gydF4y2Ba3 g hgydF4y2Ba。总的来说,这些发现表明,2“fl和6”sl防止NEC开发在这两个小型和大型动物模型。我们试图调查机制,所以我们下决定是否这些hmo可以抑制TLR4信号。gydF4y2Ba

2“fl和6”sl抑制TLR4信号IEC-6肠上皮细胞gydF4y2Ba

鉴于TLR信号的重要性在NEC的发病机制,gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}我们接下来试图确定2“fl和6”sl可以通过TLR4抑制防止NEC开发。确定2“fl或6”sl可以阻止TLR4信号,我们第一次测量的影响这些hmo LPS-induced核转录因子kappa轻链增强剂激活B细胞(NF-kB)易位的细胞质细胞核(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在TLR4-induced)和肠上皮细胞凋亡通路,是中央粘膜炎症导致NEC归纳。这些研究进行细胞系IEC-6使用模型,这是一个非转换地穴细胞系表达TLR4丰富和响应有限合伙人,gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba从而允许HMO-TLR4交互的直接研究没有循环因素的潜在影响。如无花果所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,而控制细胞的p65单元NF-kB细胞质中的本地化(无花果。gydF4y2Ba4(我的)gydF4y2Ba),LPS诱导细胞核(图的易位。gydF4y2Ba4 (2,2’)gydF4y2Ba,量化在无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。尽管预处理LAT没有影响的程度LPS-induced NF-kB易位(无花果。gydF4y2Ba4(三世,三世),bgydF4y2Ba),治疗的IEC 2“fl或6”sl,单独或组合,明显阻塞LPS-induced NF-kB信号(图。gydF4y2Ba4 (iv-vi iv vi), bgydF4y2Ba)。在平行,LPS诱导显著的细胞凋亡(图。gydF4y2Ba4 c (2, 2), dgydF4y2Ba)IEC-6细胞,细胞凋亡的程度并不是减少纬度(图。gydF4y2Ba4 c(三世,三世),dgydF4y2Ba),但明显下降了2“fl和6”sl,单独或组合(无花果。gydF4y2Ba4 c (iv-vi iv vi)gydF4y2Ba)。总的来说,这些发现表明,2“fl和6”sl防止体外TLR4信号,提供一种机制,通过这种机制降低NEC严重性。我们下一个试图确定对TLR4信号在人类和小鼠的影响外植体。gydF4y2Ba

2“fl和6”sl抑制TLR4信号在NEC和人类和小鼠肠道外植体gydF4y2Ba

我们下一个评估的潜在影响2“fl和6”sl LPS-TLR4信号体内。如无花果所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaNEC的感应在小鼠和小猪TLR4的表达增加导致肠道controls-consistent相比增加后TLR4信号和下调2“fl和6”sl管理局(无花果。gydF4y2Ba5 (i, ii)gydF4y2Ba)。直接评估2是否“fl或6”sl可以抑制体内LPS-TLR4信号,新生小鼠接种一剂2 fl或6的sl的口头填喂法1 h LPS腹腔内注射前,和TLR4表达和TLR4-induced肠道上皮细胞因子表达进行了评估。如无花果所示。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba,注射LPS显著调节TLR4和TNF-α(无花果。gydF4y2Ba5 b (i, ii)gydF4y2Ba),这些都是减少2》fl, 6“sl,或它们的组合(图。gydF4y2Ba5 b (i, ii)gydF4y2Ba)。进一步的治疗肠道外植体从小鼠胚胎或过早人类婴儿(气孔关闭手术期间获得)与有限合伙人同样导致增加TLR4和TNF的表达,也都减少了治疗2“fl或6”sl(无花果。gydF4y2Ba5 c (i, ii)、d (i, ii)gydF4y2Ba)。在额外的消极控制实验中,我们测试了非政府组织的影响在TLR4信号在体外和体内,鉴于Autran NEC等人表明,神仙不影响严重性。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba如补充图所示。gydF4y2Bas2gydF4y2Ba,GOS补充公式不会降低NEC反映在总小肠的形态学和组织学形态,这仍然是典型的NEC。GOS治疗也未能减轻LPS信号在IEC-6 7-day-old小鼠的肠道粘膜或肠上皮细胞(补充图。gydF4y2Bas3gydF4y2Ba),没有减少LPS-induced NF-kB易位(补充图。gydF4y2Bas4i-iii,七世gydF4y2Ba)或细胞凋亡(补充图。gydF4y2Bas4iv-vi,八世gydF4y2Ba在IEC-6细胞)。总的来说,这些发现表明,hmo 2“fl和6”sl可以抑制TLR4信号,在体外和体内。我们接下来试图评估底层机制和关注的可能性2“fl和6”sl可以直接绑定到TLR4有限合伙人,从而干扰信号,如下评估。gydF4y2Ba

2“fl和6”sl但不是LAT码头到LPS-binding TLR4的口袋里gydF4y2Ba

在最后的一系列研究,我们认为2“fl和6”sl能否码头LPS-binding口袋的TLR4的解释能力抑制TLR4信号,防止NEC。直接评估这种可能性,我们执行分子建模的研究使用七弦琴Autodock绑定gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba在PyRxgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba。如无花果所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,2“fl和6”sl发现码头的相对亲和力−−5.6和6.7千卡/摩尔,分别进入狭窄,深的口袋TLR4-MD2复杂(图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)。这个口袋被认为使有限合伙人通过内部疏水残基的结合和带正电的残留物衬腔的边缘。重要的是,相比之下,LAT被发现是一个贫穷(图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba),它的对接分数到相同的腔只有−4.8千卡/摩尔,这是符合纬度的缺乏保护性活动对TLR4信号或NEC在无花果。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。总的来说,这些发现表明,2“fl和6”sl抑制TLR4信号通过直接绑定,提供一个直接的机制来解释他们抵御NEC在小鼠和小猪的发展。gydF4y2Ba

我们现在证明hmo 2“fl和6”sl扮演重要角色在预防NEC在老鼠和小猪的发展模式。在定义他们的行动的机制,我们表明,2“fl和6”sl,但不是控制乳糖骨干,抑制TLR4信号在培养肠上皮细胞,以及肠道外植体在小鼠和人类的影响,通过计算分析了涉及直接绑定有限合伙人对接的口袋里。鉴于TLR4的关键作用在NEC的发病机制,gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba这些发现提供了一种解释如何hmo也可以防止NEC和解释他们的保护对肠上皮细胞凋亡和黏膜屏障损伤的影响。或许最重要的是,这些发现表明hmo的可能性可能很快会全部设备的一部分工具可以管理新生儿NEC的危险,希望预防或治疗这种毁灭性的疾病。此外,我们的研究首次评估两个2“fl和6”sl单独或结合,评估他们的角色在鼠标,小猪和人体组织,将组织TLR4信号的抑制效果。gydF4y2Ba

虽然我们现在表明,hmo 2“fl和6”sl发挥他们的NEC通过TLR4抑制保护作用,描述了其他保护机制,几乎肯定会发挥贡献作用。具体地说,之前作者表明,fl和disialyl-lacto - 2”gydF4y2BaNgydF4y2Ba-tetraose作为益生元与假定的影响细菌绑定到结肠上皮细胞的能力。gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba此外,hmo被认为鼓励的增长gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba与非炎症状态相关联在肠道粘膜,暗示可能的保护机制。gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}虽然当然合理,但还不清楚这些各种低聚糖将接口与含有黏液层的丰富的低聚糖,对微生物群落本身具有重要的影响,这将看似被赋予低聚糖在更大的浓度比任何体内分子提供。最近,Pierro和他的同事们发现hmo的转录资料可以修改肠道上皮细胞,导致转向杯状细胞,随后的保护作用在肠粘膜屏障损伤和保护。gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba我们组展示了使用培养的内皮细胞的HMO会导致血管扩张性酶的诱导内皮一氧化氮合酶(以挪士),导致观察在HMO-fed小鼠肠系膜灌注明显升高,而以挪士抑制剂可以为NEC反向HMO的积极影响。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba考虑到各种不同的提议还演示了个人hmo的作用机制,需要进一步的研究,以评估他们的角色作为专门为婴儿的风险预防策略NEC的发展。gydF4y2Ba

总之,我们已经表明2 fl和6 -SL-two HMOs-act防止NEC在小鼠和小猪模型和我们对接的研究预测,这些分子与TLR4的LPS-binding站点交互,提供的作用机制。综上所述,我们建议增加2“fl和6”sl,单独或组合,可以起到anti-NEC作用,可能为这种毁灭性疾病的预防提供新的方法。gydF4y2Ba