S100A7通过增强肺鳞状细胞癌的免疫抑制肿瘤微环境来减弱免疫治疗gydF4y2Ba

亲爱的编辑器gydF4y2Ba,gydF4y2Ba

近年来，免疫疗法的快速发展为肺鳞状细胞癌(LUSC)患者带来了生存益处，这些患者的治疗选择很少。然而，仍有部分患者存在免疫治疗耐药，这是整体人群获益率低和疾病进展的根本原因，是亟待解决的问题。除肿瘤突变负荷外，肿瘤免疫微环境(TIME)以CD8浸润为特征gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和PD-L1表达与免疫检查点抑制剂(ICIs)的疗效相关。在我们之前的研究中，我们已经证明了银屑病素，也被称为S100钙结合蛋白A7 (S100A7)，不仅通过激活LUSC中的p-Erk途径和食管鳞状细胞癌(ESCC)中的p-Erk和p-FAK途径加速肿瘤进展，而且还通过促进ESCC中的血管生成和M2巨噬细胞浸润来重塑肿瘤微环境。gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}然而，S100A7在LUSC的TIME和免疫治疗疗效中的作用尚不明确。gydF4y2Ba

本研究收集了来自中国医学科学院肿瘤医院和研究所的102例LUSC切除标本，基于CD8确定S100A7表达与TIME的相关性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTILs浸润和PD-L1的免疫组化表达。结果表明，S100A7的表达与PD-L1的表达(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.25,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.010;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTILs渗透(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.31,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.002;无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．一些趋化因子包括CCL5, CXCL9, CXCL10和CXCL11已被证明驱动CD8的浸润gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba尖。gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}考虑到这一点，我们利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库中LUSC样本的转录组数据研究了S100A7的表达与这些趋化因子之间的关系。S100A7与CXCL9表达呈负相关(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.14,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.002;无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba印地gydF4y2Ba)．基于LUSC样本的转录组数据，应用CIBERSORT计算了22个免疫细胞的个体分数，并分析了它们与S100A7表达的关系。除了与CD8有关gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.21,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)， S100A7表达与M1巨噬细胞浸润呈负相关(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.17,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)(补充图。gydF4y2Ba就是S1cgydF4y2Ba)．随后的免疫组化研究进一步证实了S100A7表达与CXCL9表达(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.45,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)和CD68gydF4y2Ba^+gydF4y2BaM1巨噬细胞浸润(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.27,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.006;无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。接下来，我们通过RT-qPCR检测在存在或不存在S100A7蛋白的情况下，IFN-γ和LPS诱导的pma活化的THP1细胞中M1巨噬细胞特异性标记物(CD68)的表达，我们的分析显示，在添加S100A7蛋白的巨噬细胞中，CD68的表达显著降低(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．以上结果提示S100A7抑制M1巨噬细胞极化。有趣的是，许多研究已经确定了CD68gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞是CXCL9的主要来源。gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}

S100A7对LUSC TIME特征及免疫治疗疗效的影响。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba免疫组化分析S100A7和gydF4y2Ba一个gydF4y2BaPD-L1表达式,gydF4y2BabgydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba直到渗透,gydF4y2BadgydF4y2BaCXCL9表达式，和gydF4y2BaegydF4y2BaLUSC患者肿瘤标本中M1巨噬细胞浸润。gydF4y2BacgydF4y2Ba基于皮尔逊的交叉相关图gydF4y2BargydF4y2BaTCGA数据集的LUSC样本中S100A7、CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达值。gydF4y2BafgydF4y2Ba在S100A7蛋白存在或不存在的情况下，IFN-γ和LPS诱导pma活化的THP1细胞CD68表达。NC组:PMA + IFN-γ + LPS;S100A7组:PMA + IFN-γ + LPS + S100A7。gydF4y2BaggydF4y2Ba而且gydF4y2BahgydF4y2BaWestern blot分析不同处理H226细胞S100A7、PD-L1和CXCL9的表达及激酶信号通路。以GAPDH表达作为加载对照。S-VEC:对照H226细胞;S-OE:过表达s100a7的H226细胞。FPS: RAGE-specific inhibitor (FPS- zm1);S100A7:重组人S100A7蛋白;AKTi: akt特异性抑制剂(MK-2206 2HCL)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba小鼠承载控制(VEC)、s100a7a敲低(Sh1和Sh2)和s100a7a过表达(OE) KLN205细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)用同型对照或抗pd - l1单克隆抗体(抗pd - l1单抗)治疗。同种型对照组小鼠由于肿瘤结节太大，在第20天用二氧化碳窒息法处死以获取肿瘤进行免疫组化分析。gydF4y2BajgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba米gydF4y2Ba免疫组化分析gydF4y2BajgydF4y2BaPD-L1表达式,gydF4y2BakgydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞浸润，gydF4y2BalgydF4y2BaCXCL9表达式，和gydF4y2Ba米gydF4y2BaCD68gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba各组巨噬细胞浸润情况。gydF4y2BangydF4y2Ba进展性疾病(PD)患者与非PD患者血浆S100A7基线水平的分布。gydF4y2BaogydF4y2Ba接受抗pd -1免疫治疗的LUSC患者无进展生存(PFS)基线血浆S100A7水平的ROC分析。gydF4y2BapgydF4y2Ba基于基线血浆S100A7水平的抗pd -1免疫治疗的LUSC患者PFS Kaplan-Meier生存曲线gydF4y2Ba问gydF4y2Ba研究的图形摘要。图形摘要是由BioRender.com创建的。ns:gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05gydF4y2Ba^；gydF4y2Ba**gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01;＊＊＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

鉴于CXCL9在肿瘤细胞中也被发现(补充图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)，通过RT-qPCR和western blotting检测CXCL9在对照组和过表达s100a7的LUSC细胞中的表达。结果显示，S100A7，无论是内源性产生的还是外源性添加到H226细胞中，都会降低CXCL9的表达，而S100A7沉默或用晚期糖基化终产物受体(RAGE)抑制剂(FPS-ZM1)处理会增加CXCL9的表达(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS3f ggydF4y2Ba)．进一步的通路研究表明，AKT抑制剂可轻微减弱CXCL9的表达(图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS3hgydF4y2Ba)．前期研究表明S100A7可以通过RAGE发挥其功能，促进下游信号通路的激活。gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}在我们的研究中，S100A7蛋白的过表达或外源性导入均可激活p-Erk和p-AKT通路(图2)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．此外，我们还观察到pd - l1的表达水平被S100A7明显地解除调控(图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS3cgydF4y2Ba)．先前的研究报道，激活p-Erk信号通路会增加PD-L1的表达。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba值得注意的是，我们的研究表明，通过敲除S100A7或使用RAGE或AKT抑制剂治疗，PD-L1的表达可以部分消除。gydF4y2Ba1 g hgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS3c-egydF4y2Ba)．基于这些发现，我们推测S100A7过表达不仅通过激活p-AKT通路降低PD-L1水平，还通过下调CD68的浸润抑制肿瘤微环境中趋化因子CXCL9的分泌gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肿瘤细胞中的巨噬细胞和CXCL9水平。这些机制进一步下调了CD8的浸润gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTILs，反过来又建立了免疫抑制TIME，主要抵抗ICIs。gydF4y2Ba

考虑到S100A7表达与免疫抑制时间之间的关系，我们希望确定在LUSC中观察到的S100A7失调对免疫治疗反应的影响。为此，我们在后续实验中使用了具有人类S100A7小鼠同源物的小鼠模型，S100A7a(补充图)。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS5agydF4y2Ba)．与载体对照相比，抗pd - l1抑制剂在s100a7a敲低组的抗肿瘤作用更强(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;无花果。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS5cgydF4y2Ba)．同时，与我们之前的结果一致，在缺乏抗pd - l1抑制剂的情况下，敲除S100A7a会降低肿瘤结节的生长能力(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;无花果。gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS5bgydF4y2Ba)．免疫组化研究显示PD-L1和CXCL9表达升高，CD8升高gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和CD68gydF4y2Ba^+gydF4y2Bas100a7a敲除小鼠肿瘤标本中巨噬细胞浸润(图;gydF4y2Ba1 j-mgydF4y2Ba)．更重要的是，在s100a7a过表达小鼠中使用抗PD-L1药物并没有引起PD-L1表达和CD8的更显著变化gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞浸润与其他组比较(图;gydF4y2Ba1 j, kgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

根据之前的报道，S100A7可以在细胞外分泌，并在血浆中检测到，gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba纳入了27例接受ICIs治疗的LUSC患者队列，以调查S100A7基线血浆水平与ICIs疗效之间的关系(补充表)gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．在进展性疾病的LUSC患者中观察到较高的S100A7基线血浆水平(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.039;无花果。gydF4y2Ba1 ngydF4y2Ba)．计算受试者工作特征(ROC)曲线下面积，分析基线血浆S100A7水平对免疫治疗应答的预测能力，其值为0.869(图。gydF4y2Ba1阿gydF4y2Ba)．然后，我们根据ROC曲线计算出的最佳截断值(截断值= 0.903;无花果。gydF4y2Ba1阿gydF4y2Ba)．在我们的分析中，我们发现较高的S100A7基线血浆水平与较差的无进展生存率显著相关(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.005;无花果。gydF4y2Ba1便士gydF4y2Ba)．此外，单因素和多因素Cox回归分析显示，S100A7基线血浆水平是一个独立的预后因素(补充表gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

综上所述，我们证明了S100A7的上调可能导致ICIs耐药，这是由于通过激活p-AKT通路导致PD-L1表达降低和CD8降低的免疫抑制时间重构所致gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTILs通过下调CXCL9表达浸润(图;gydF4y2Ba1问gydF4y2Ba)．我们还证实，靶向抑制S100A7可能通过产生炎症表型来增强ICIs的疗效，然而，抗S100A7抑制剂的缺乏限制了我们的临床应用。最后，我们确定了基线血浆中S100A7水平的预测能力，这可以进一步指导ICIs在LUSC患者中的使用。然而，小样本量的局限性应该得到承认，因此在未来的大规模研究中进一步验证这一生物标志物是有必要的。gydF4y2Ba