亲爱的编辑器gydF4y2Ba，gydF4y2Ba

越来越多的证据表明，USP28可能是癌症治疗的靶点gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。为了鉴定其抑制剂，我们筛选了10万个合成化合物库，发现3个先导化合物CT1001-1003显示出显著的抑制活性(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．对这些化合物的优化得到了一种更强的抑制剂CT1018(补充图)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．CT1018与CT1002几乎相同，除了它在3个氨基上是半甲基化的。有趣的是，完全甲基化3-氨基(CT1038，补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)几乎杀死了抑制活性，并用乙基取代甲基(CT1047，补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)也导致了一种较弱的抑制剂。这些结果表明，3-氨基的半甲基化对抑制活性至关重要。然而，CT1018在基于细胞的检测中是不活跃的。继续优化得到了CT1073和CT1113(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这两种化合物对USP28以及密切相关的USP25都是有效的(补充图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．3氨基半甲基化的重要性对于CT1073来说也是如此，因为它的未甲基化版本CT1008是一种弱得多的抑制剂(补充图)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．CT1113含有一个手性中心，一个对映体比另一个对映体更有效(补充图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．这些化合物的特异性可以通过CT1073或CT1113对其他去泛素酶和SENP1缺乏高达10 μM的活性来证明。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．此外，我们用SPR仪测量了抑制剂与USP25/28之间的相互作用动力学。如补充图所示。gydF4y2Ba1 h,我gydF4y2Ba， CT1073和CT1113对USP25和USP28有相似的KDs。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

鉴定USP28抑制剂。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaCT1073和CT1113的化学结构。gydF4y2BabgydF4y2BaWestern blotting分析500 nM CT1073或CT1113处理24小时的细胞中指示蛋白。gydF4y2BacgydF4y2BaCT1113在SW1990细胞接种Balb/c裸鼠胰腺癌CDX模型中的作用(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8只/组)。展示了肿瘤的照片。gydF4y2BadgydF4y2Ba肿瘤样本的Western blotting分析gydF4y2BacgydF4y2Ba。gydF4y2BaegydF4y2Ba对照组和CT1113处理动物小肠苏木精和伊红(H&E)染色和免疫组化染色(gydF4y2BangydF4y2Ba每组3只)。gydF4y2BafgydF4y2Ba。BrdU掺入的定量。肠隐窝中的BrdU阳性细胞(gydF4y2BaegydF4y2Ba)被统计和绘制。学生的gydF4y2Bat -gydF4y2Ba试验:n.s.:无显著性差异。gydF4y2BaggydF4y2BaWestern blotting分析对照组和ct1113处理小鼠肠道中USP28和c-MYC水平。这些数字是USP28或c-MYC相对于GAPDH的带强度，与对照组的样本1相比进一步归一化gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

接下来，我们对USP25/28抑制剂进行了各种基于细胞的检测。首先，我们研究了它们抑制细胞dub的有效性。c-MYC是USP28最显著的底物gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。如补充图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2BaCT1073和CT1113都能够在不同的癌细胞系中显著降低c-MYC水平，并且在治疗后1-2小时内发生降低。正如预期的那样，MYC-MAX靶基因的表达在处理过的细胞中被极大地抑制(补充图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．随着处理时间的延长，我们可以看到USP28和USP25本身及其底物LSD1和Tankyrase (TNKS)的水平急剧下降(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．在环己亚胺追逐实验中，我们可以清楚地看到CT1073处理c-MYC的不稳定(补充图。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba)，进一步的泛素化试验表明CT1073或CT1113处理导致c-MYC蛋白的泛素化更多(补充图。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba)和更多的Tankyrase泛素化(补充图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)．正如预期的那样，CT1073处理均缩短了LSD1和TNKS的半衰期。gydF4y2Ba2 h,我gydF4y2Ba)，而由CT1073或CT113处理引起的c-MYC、LSD1和TNKS的不稳定可以被蛋白酶体抑制剂MG132逆转(补充图。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba)．此外，我们还检测了CT1113对p53和CHK2蛋白水平的影响。观察到这两种蛋白质没有明显的不稳定(补充图。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)．总之，这些数据表明我们开发的USP25/28抑制剂对细胞有效。gydF4y2Ba

接下来我们确定了ECgydF4y2Ba50gydF4y2BaCT1073和CT1113对多种肿瘤细胞系增殖或细胞活力的抑制作用。如补充图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba这两种化合物在抑制这些细胞增殖方面都非常有效。ct1073处理的癌细胞的终末表型为凋亡(补充图;gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)或细胞周期阻滞(补充图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．有趣的是，细胞周期阻滞发生在G2期甚至S期(补充图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．这些结果表明，大多数(如果不是全部的话)癌细胞需要gydF4y2BaUSP25gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaUSP28gydF4y2Ba增殖和/或存活。为了从基因上验证这一点，我们减少了gydF4y2BaUSP25gydF4y2Ba，gydF4y2BaUSP28gydF4y2Ba，或两者都在选定的癌细胞系中。在T47D中，两者的消耗gydF4y2BaUSP25gydF4y2Ba或gydF4y2BaUSP28gydF4y2Ba在一定程度上抑制了增殖，但两者的消耗导致了增殖的阻断和最终的细胞死亡(补充图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．在A549中，消耗gydF4y2BaUSP25gydF4y2Ba或gydF4y2BaUSP28gydF4y2Ba而双重耗竭则导致细胞死亡(补充图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．此外，我们表达过度了gydF4y2BaUSP25gydF4y2Ba而且gydF4y2BaUSP28gydF4y2Ba，在HCT116细胞中单独或一起。的过度表达gydF4y2BaUSP25gydF4y2Ba或gydF4y2BaUSP28gydF4y2Ba单独表达CT1113并不会显著改变细胞对CT1113的敏感性，但两者同时过表达会降低细胞对CT1113的敏感性(补充图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)，增加ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba从表达gfp的对照组细胞的65 nM到表达gfp的对照组细胞的92 nMgydF4y2BaUSP25/28gydF4y2Ba过度的细胞。这些数据表明，CT1113的抗增殖作用在很大程度上是一种靶向效应，尽管潜在的脱靶效应的贡献不能完全排除。gydF4y2Ba

接下来，我们想要证明它们在体内的有效性。CT1073不能口服，而且在小鼠体内代谢不稳定，很可能是因为它含有一种容易水解的酰胺键。CT1113(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)对酰胺键进行修饰以克服这一问题，并用于体内抗肿瘤研究。我们首先对由SW1990形成的异种移植瘤进行了测试，SW1990是一种人类胰腺癌细胞系。如图所示。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， CT1113治疗可显著抑制肿瘤生长。该化合物还导致MYC水平下降(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．Ki67染色显示CT1113处理后肿瘤的增殖明显低于对照(补充图)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．处理过的动物看起来正常，除了它们似乎没有像对照组动物那样消耗那么多的食物，这可能是它们体重下降的原因(补充图)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．接下来，我们使用结肠癌细胞系HCT116在结肠癌CDX模型上测试CT1113。观察到类似的疗效(补充图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．总之，这些体内实验结果表明，USP25/28抑制剂CT1113是一种强抗肿瘤药物。gydF4y2Ba

由于c-MYC对正常细胞的增殖也很重要，我们想检查CT1113对小鼠增殖组织的影响，特别是被证明依赖的肠道gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba对再生gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。正常C57BL/6小鼠给予CT1113 21天，恢复21天(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在给药方案结束时，动物没有表现出任何明显的毒性迹象，尽管它们的体重在给药结束时下降了约10%(补充图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)，正如我们在荷瘤裸鼠中看到的那样(补充图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．然而，在停止CT1113给药后，体重迅速回升(补充图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．主要器官组织学检查也未见明显变化。在肠道中，经ct1113处理的小鼠与对照组小鼠的绒毛难以区分(图11)。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．令人惊讶的是，CT1113处理完全没有中断隐窝中的增殖(通过BrdU掺入测量)(图11)。gydF4y2Ba1 e, fgydF4y2Ba)．c-MYC免疫组化染色显示对照中c-MYC表达非常强，但在ct1113处理的肠道中c-MYC表达大大降低(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)，与western blotting分析结果一致(图;gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．然而，c-MYC的表达在隐窝中持续存在(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)，表明在USP28抑制的情况下，干细胞仍能维持c-MYC的表达。这一结果解释了CT1113处理未破坏隐窝的增殖。此外，在睾丸中，CT1113管理没有引起组织学组织的任何畸变，也没有引起精原细胞的增殖(补充图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，我们发现了一类有效的USP25/28抑制剂，显示出广泛的抗肿瘤活性。gydF4y2Ba