介绍

阴道上皮作为物理屏障,保护阴道腔从外部伤害和病原体的入侵。阴道上皮细胞表现出周期性的,estrogen-dependent细胞增殖和分化在发情周期,在切除卵巢的雌激素管理局诱发阴道上皮细胞增殖(OVX)老鼠。然而,调节细胞增殖和分化的机制在阴道仍然知之甚少。更年期发作,雌激素水平迅速降低,对阴道有明显的影响,加速其自然萎缩的过程(1]。雌激素替代疗法往往是有益的治疗阴道萎缩。然而,雌激素替代疗法已不受欢迎的副作用,其中最严重的是癌症的风险增加(2]。因此,阴道内稳态应分别监管,有效和安全代理积极影响底层的生理机能,从而提高绝经后妇女的阴道内稳态的定性方面将是有价值的。

在啮齿动物阴道和子宫等生殖器官,雌激素扮演监管角色绑定到基质表达雌激素受体α(ERα)[3,4,5]。雌激素使stromal-secreted生长因子激活细胞信号转导通过PI3K / Akt和增殖蛋白激酶(MAPK)信号级联促进上皮细胞增殖6,7,8,9,10]。异常的PI3K / Akt激活导致复杂的非典型增生和endometrioid癌在子宫11,12,13,14,15]。这些发现表明PI3K / Akt信号通路是雌激细胞增殖和分化的功能介质。哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)是PI3K / AKT通路的一个重要组成部分。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶associates的脚手架蛋白猛禽和Rictor分别在两个不同的复合物,mTOR复杂1 (mTORC1) [16),促进蛋白质合成和RNA转录主要通过磷酸化S6,和mTOR复杂2 (mTORC2) [17]Akt激活S473网站[18]。

mTOR起着核心作用的传感环境条件和调节新陈代谢的几乎所有方面的细胞和组织层次的(19]。mTOR的失调已经观察到在人类各种病理条件下,如癌症(20.),神经系统疾病(21)、糖尿病(22)、心血管并发症(23),和老化21]。此外,针对mTOR是最具潜力的领域之一的有效治疗这些疾病。最近,积累证据发现mTOR的作用在女性生殖生理和病理条件下,包括胚胎发育(24,25),卵巢体细胞增殖(26],folliculogenesis [27),卵母细胞减数分裂成熟(28),卵巢衰老(29日),生育率(29日],青春期发病[30.,子宫内膜内稳态(31日]。然而,很少有人知道mTOR信号的作用或如何与雌激素信号阴道。mTOR的角色在阴道上皮内稳态信号通路,尤其是更年期妇女的阴道萎缩的过程中,需要进一步调查。

在这项研究中,我们评估的角色mTOR estrogen-mediated阴道上皮细胞增殖和分化的信号。与生殖tract-specific使用小鼠模型Rptor或Rictor删除,我们发现的损失Rptor但不是Rictor阴道导致上皮细胞的异常增殖和失败的角质化的分化。值得注意的是,基因表达分析显示雌激素反应迟钝的阴道estrogen-primed OVXRptorcKO老鼠。几个estrogen-mediated基因,包括Pgr和EGF-like生长因子Ereg没有雌激素引起的RptorcKO小鼠阴道。此外,补充EREG可以通过YAP1激活阴道上皮细胞的增殖和生存在没有猛禽。我们的数据公布mTORC1信号的关键作用结合雌激素和阴道上皮细胞增殖和分化生长因子信号,提供新的见解如何mTOR在阴道内稳态信号通路功能。

结果

雌激素促进阴道上皮细胞激活mTORC1信号

根据先前的研究32],mTORC1信号被浓缩在更年期妇女的阴道与三个月雌二醇(E2)治疗基因集富集分析(GSEA)分析(图。1),暗示可能雌激素在阴道的开发和功能维护。确定mTOR活动之间的相关性和雌激素水平,我们检查了猛禽的表达和p-S6雌激素水平在整个月经周期与周期变化(图1 b)。结果显示一个动态激活mTORC1信号在发情周期中小鼠年龄8 - 10周。猛禽和p-S6最高在发情前期阴道上皮细胞中表达,当雌激素水平最高(图。1 c)。为了避免hypothalamus-pituitary-gonadal轴的任何干扰,我们进一步使用OVX小鼠和分析mTORC1的激活信号estrogen-injection紧随其后。OVX小鼠阴道上皮和基质的显示极低水平的mTORC1信号活动。然而,当OVX小鼠服用雌性激素,mTORC1信号在阴道上皮细胞,迅速激活和猛禽蛋白质表达和核糖体蛋白S6磷酸化显著增加(图。1 d, E)。这些结果表明,雌激素介导的激活mTORC1阴道上皮细胞的信号。

图1:雌激素介导的激活mTORC1阴道上皮细胞的信号。
图1

一个GSEA浓缩块mTORC1信号在阴道活检转录组从19岁更年期女性阴道干涩前后3个月E2治疗(GSE11622)。B小鼠血清E2水平在发情前期(n= 5)发情期(n= 8)、metestrus (n= 15)和间情期(n= 10)。值表示为均值±SEM。C阴道涂片细胞学的评估使用的发情周期测定结晶紫染色法8-wk-old WT老鼠。n在每组= 5。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:100μm(上)。代表图像猛禽(中间)和免疫荧光染色的Phospho-S6 (Ser235/236)(低)在小鼠阴道在发情前期,发情,metestrus,间情期。n在每组= 5。核与DAPI染色。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:75μm。D,E代表图像的猛禽(D)或p-S6 (Ser235/236) (E)免疫荧光染色OVX小鼠阴道的芝麻油(n= 3)和E2管理局(n= 3)。实验重复三次。核与DAPI染色。显微镜放大20(上)和××63(低)。酒吧规模:75μm。

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Rptor缺乏导致发情周期内稳态的破坏

研究mTORC1在阴道的作用,我们生成的一个条件Rptor基因敲除小鼠模型。要做到这一点,Rptor液氧/液氧老鼠[33,34)是老鼠携带交配PgrCre等位基因,Cre蛋白表达是由Pgr启动子(35(补充图。1)。我们验证Rptor淘汰赛效率在阴道的信使rna和蛋白质水平定量rt - pcr (qPCR),免疫印迹和免疫荧光(补充图。1罪犯)。免疫荧光的p-S6 (Ser235/236)进一步证实mTORC1信号的失活RptorcKO阴道上皮使用OVX模型(补充图。1 e)。因为mTORC1活动变化与发情周期,我们检查的影响Rptor删除在发情周期,由连续13天daily-vaginal涂片和总结在无花果。2摄氏度。我们发现阴道阴道涂片检查和组织学的动态变化在发情周期中控制老鼠RptorcKO老鼠仍在间情期,阴道涂片RptorcKO老鼠含有大量的白细胞(无花果。2),上皮萎缩(图2 - 3细胞层。2 b)。

图2:Rptor缺乏破坏发情周期内稳态,同时保持正常的卵巢功能。
图2

一个代表图像的阴道涂片细胞学评估控制RptorcKO老鼠用结晶紫染色法对发情周期的决心。n=每组5只老鼠。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:100μm。B阴道粘膜形态学变化在老鼠发情周期中由他染色。n= 5老鼠在每个阶段。显微镜放大×10。酒吧规模:200μm。C发情8-week-old控制循环(n= 5)和RptorcKO (n= 7)小鼠每日取决于阴道灌洗细胞学为13天。值表示为均值±SEM。D代表HE-stained卵巢部分控制,RptorcKO老鼠在8 ~ 10周的年龄。n=每组5只老鼠。显微镜的放大倍数×4。规模的酒吧:1毫米。E代表HE-stained卵巢控制部分(n= 8)和RptorcKO (n= 6)小鼠超数排卵后在8 ~ 10周的年龄。显微镜的放大倍数×4。规模的酒吧:1毫米。F输卵管卵母细胞收集的超数排卵控制(n= 8)和RptorcKO (n= 6)老鼠。显微镜放大×10。酒吧规模:100μm。G散点图显示了统计两组老鼠之间的卵母细胞数量F。值表示为均值±SEM。H,我血清E2 (H)和P4 (我)在控制和水平RptorcKO老鼠在发情前期、发情、metestrus间情期。n= 5(控制老鼠发情前期阶段),n= 8(控制老鼠发情阶段),n= 15(控制老鼠metestrus阶段),n= 10(控制鼠间情期阶段)n= 9 (RptorcKO老鼠)。值表示为均值±SEM。

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考虑到Pgrcre表达在排卵期前的卵泡的颗粒细胞(35和mTORC1一直与卵巢功能36),我们也评估的影响Rptor卵巢功能。卵巢部分的控制和组织学结果RptorcKO老鼠在8 ~ 10周的年龄(无花果。二维(图)和之后。2 e)超数排卵没有差异,可比排卵期前的成熟卵泡和黄体。最后,RptorcKO和控制老鼠产生等量的E2和P4(无花果。2 h,我)。所以发情周期的损失RptorcKO老鼠并非由于破坏卵巢功能,建议mTORC1信号的重要作用发情周期建立和维护。

Rptor阴道的缺乏导致menopausal-like障碍通过促进细胞死亡和抑制细胞的生存

生殖管道的观察表明,外部的阴道口Rptor缺乏的老鼠明显小于控制老鼠(无花果。3),最大(max)和最小(最小值)阴道直径估计基于MRI在成人也减少RptorcKO的老鼠相比,控制老鼠(无花果。3 b, C)。有趣的是,损失的观察阴道上皮角化作用的成年人RptorcKO老鼠,而没有发现显著差异RptorcKO和控制老鼠出生后28天(无花果。3 d)。产后28天代表青春期前的时期的开始,当老鼠卵巢未成熟,激素水平很低。这些结果表明,损失的Rptor可能导致更年期障碍小鼠阴道,如萎缩和发情周期,同时也表明mTORC1信号通路介导成年小鼠的阴道的激素调节发展。

图3:Rptor损耗会导致阴道萎缩通过促进细胞死亡和抑制细胞增殖。
图3

一个代表图像的外部阴道口控制(n= 5)和RptorcKO (n= 5)雌性老鼠。B女性生殖系统的3 d渲染控制(n= 5)和RptorcKO (n= 5)小鼠基于核磁共振T2加权图像。规模的酒吧:5毫米。C准确的最大和最小直径阴道测量基于统计B。值表示为均值±SEM。(D)代表HE-stained阴道部分控制,RptorcKO老鼠在8周(左)(n每组= 5只老鼠)和产后28天(右)(n每组= 3只老鼠)。实验重复3次。显微镜放大×10。酒吧规模:200μm。E,F控制和RptorcKO切除卵巢的老鼠和休息2周。连续3天E2是管理。不是代表图像(E)或Ki67 (F)在控制和染色的阴道RptorcKO老鼠。细胞核被苏木精染色。n在每组= 3。实验重复3次。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:50μm。G代表图像的TUNEL免疫荧光染色后OVX小鼠的阴道E2管理。核与DAPI染色。n在每组= 3。实验重复3次。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:75μm。

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此外,PAS染色显示增厚cornified控制小鼠阴道上皮,但失去复层鳞状上皮细胞和粘蛋白生产的阴道RptorcKO老鼠E2(图处理。3 e)。我们下一个检查阴道上皮细胞的增殖Ki67使用免疫组织化学。阴道基底层细胞的增殖水平低RptorcKO的老鼠比控制处理E2(无花果。3 f)。我们还研究了使用TUNEL阴道上皮细胞的凋亡。凋亡指数在E2-treated增强阴道上皮和基质RptorcKO老鼠与控制(图。3 g),这表明mTORC1信号有助于调节上皮细胞和基质细胞的生存。这些结果表明缺陷应对E2的阴道RptorcKO的老鼠,Rptor损耗会导致阴道萎缩通过促进细胞死亡和抑制细胞增殖。

Rptor损耗受损基因的表达参与阴道上皮细胞的发育和分化

避免混杂因素引发的荷尔蒙变化在整个发情周期,RNAseq阴道组织执行使用OVX小鼠的存在和缺乏三daily-E2注射。3634个基因表达明显控制鼠E2治疗后阴道,而1153个基因被改变RptorcKO老鼠E2治疗后。1976年在阴道之间的差异表达基因RptorcKO治疗和控制鼠E2,只有191个基因在阴道之间的差异表达RptorcKO和控制未经处理的小鼠(无花果。4)。这些差异表达基因在上面的四组被分为六个集群(图。4 b)。我们发现,910个基因在一个集群是专门治疗控制鼠E2升高,但在其他三个组(无花果。4 b),参与建立细胞器定位、皮肤发展,甾醇生物合成的过程中,脂质分解过程,和一些代谢过程(图。4摄氏度)。此外,GSEA分析结果表明,前积极丰富通路在“WT_E2”组相比,“WT”组和“KO_E2”组相关的皮肤(图发展。4 d),包括cornified信封,肽交联,建立皮肤屏障,角质化,角化细胞分化、等几个角化细胞differentiation-related基因显著调节治疗控制鼠E2的阴道,但保持不变RptorcKO老鼠E2(图处理。4 e)。和角蛋白家族基因的mRNA水平,特别Krt6a,Krt6b,Krt10,Krt13,Krt16被qPCR验证(无花果。4 f)。我们还执行GSEA分析基于先前公布的数据集(GSE26761和GSE11622)。值得注意的是,cornification-related生物过程明显下调绝经后的妇女患有阴道干涩的阴道(无花果。4 g)。三个月E2治疗也显著提升角质化具有促进更年期妇女的阴道健康(图。4 h)。这些结果表明,失去mTORC1信号通路受损E2-mediated keratinization-related基因表达和阴道上皮分化。

图4:Rptor损耗影响基因的表达参与阴道上皮细胞的发育和分化。
图4

一个RNAseq分析使用阴道OVX WT老鼠和RptorcKO老鼠有或没有3 day-E2管理。差异表达基因的数量上面的四组策划。B热图显著改变基因在上述四组之间的阴道属于六大类。CGO的显著改变基因B丰富使用的绿色框架ClueGO Cytoscape插件。DGSEA分析使用的术语。E热图的角质化differentiation-related基因的表达水平显著改变基因在绿色框架B。F的表达Krt6a,Krt6b,Krt10,Krt13,Krt16量化使用qPCR阴道的老鼠在吗一个。n= 7 (OVX小鼠控制),n= 5 (OVXRptorcKO老鼠),n= 6 (OVX控制鼠E2治疗),n= 5 (OVXRptorcKO老鼠与E2治疗)。值表示为均值±SEM。GGSEA浓缩的转录组分析绝经后女性阴道干涩的阴道活检(n= 4)和绝经后的控制没有阴道干涩n= 6)(GSE26761)。HGSEA浓缩的转录组分析绝经后的妇女患有阴道干涩的阴道活检术前和术后3个月E2治疗(n= 19)(GSE11622)。

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损失的猛禽妥协阴道雌激素响应,因此公关表达式

据报道,大鼠阴道上皮细胞增殖和分化周期性E2,通过ER (37]。公关,包含PR-A PR-B亚型,是经典的ER-regulated蛋白质。研究抗类固醇的底层机制RptorcKO老鼠,我们分析了ER和PR表达的阴道RptorcKO和控制老鼠,发现阴道公关(PR-A和PR-B)表达式RptorcKO老鼠是明显减少与控制老鼠相比,而ER水平相当RptorcKO和控制老鼠(图。5 a、B)。我们也发现PR表达使用OVX小鼠,发现公关水平显著增加外源性E2治疗后控制老鼠,但不是RptorcKO老鼠(图。5度)。确定是否减少公关表达式是由于雌激素活性,阻碍我们在RNAseq还概要ER目标基因数据,和Pgr和Klk1信使rna水平验证了qPCR(无花果。5 d, E)。这些结果证实,Rptor缺乏妥协雌激素响应性,因此其目标基因的表达,包括Pgr,不管存在的正常循环和ER水平E2水平。

图5:Rptor损耗会导致阴道雌激素没有反应。
图5

一个,B免疫印迹分析公关和ER阴道的蛋白质含量控制(n= 3),RptorcKO (n= 3)老鼠。β-Actin作为加载控制。C代表图像的免疫荧光染色公关OVX控制和阴道的RptorcKO老鼠管理与E2连续3天。核与DAPI染色。n在每组= 3。实验重复三次。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:75μm。D热图estrogen-regulated目标基因表达水平的控制和阴道RptorcKO老鼠的存在与否E2政府3天。EEstrogen-regulated目标基因D被qPCR验证。n= 7 (OVX小鼠控制),n= 5 (OVXRptorcKO老鼠),n= 6 (OVX控制鼠E2治疗),n= 5 (OVXRptorcKO老鼠与E2治疗)。值表示为均值±SEM。

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EREG充当阴道上皮细胞增殖和分化的潜在因素下游mTORC1信号

据报道,协调ErbB信号通路之间的串扰和ERα导致雌激素效应的女性生殖器官,由几个EGF-like生长因子包括EGF、TGF-α,HB-EGF, BTC,沙土荒漠,EREG, nrg。ErbB标志基因的信号通路被叠加到RNAseq数据集和异形在无花果。6。12个基因专门控制OVX小鼠接受E2升高,但不是在其他三组,表明其可能的重要功能。12个基因的mRNA水平被qPCR然后验证Ereg最重要的一个(无花果。6 b)。值得注意的是,EREG在阴道上皮细胞只表达E2-primed OVX小鼠的控制,但不是的RptorcKO小鼠的免疫荧光结果显示在无花果。6摄氏度,这意味着可能E2-mTORC1-EREG信号在阴道上皮细胞自分泌机制。

图6:EREG充当阴道上皮细胞增殖和分化的潜在因素。
图6

一个表达水平的热图ErbB信号通路基因控制和阴道的签名RptorcKO老鼠E2政府的存在与否。BqPCR执行验证基因在框架。n= 7 (OVX小鼠控制),n= 5 (OVXRptorcKO老鼠),n= 6 (OVX控制鼠E2治疗),n= 5 (OVXRptorcKO老鼠与E2治疗)。值表示为均值±SEM。C代表图像的免疫荧光染色EREG OVX控制和阴道RptorcKO老鼠有或没有E2进行管理。核与DAPI染色。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:75μm。DOVX控制和RptorcKO老鼠与E2和/或EREG管理。PAS染色的阴道被收获,Ki67免疫荧光染色法和TUNEL染色。PAS染色,细胞核被苏木精染色。酒吧规模:50μm。在Ki67免疫荧光染色法和TUNEL染色,核与DAPI染色。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:75μm。E表达水平的Krt6a,Krt6b,Krt10,Krt13,Krt16在小鼠的阴道使用qPCR量化。n= 6 (OVX控制鼠E2治疗),n= 5 (OVXRptorcKO小鼠接受E2),n= 4 (OVXRptorcKO小鼠接受E2和EREG)。值表示为均值±SEM。F中所示的阴道D收获了免疫荧光染色YAP1,核与DAPI染色。n= 6 (OVX控制鼠E2治疗),n= 5 (OVXRptorcKO小鼠接受E2),n= 4 (OVXRptorcKO小鼠接受E2和EREG)。实验重复三次。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:75μm。

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阐明EREG在阴道角化细胞分化的作用RptorcKO老鼠,和控制RptorOVX小鼠与E2和/或EREG管理。PAS-positive细胞中观察到表面的细胞治疗控制鼠E2的阴道。相比之下,只有少数PAS-positive细胞观察阴道RptorcKO鼠E2和/或EREG对待。有趣的是,合并施打EREG和E2导致OVX阴道上皮增厚RptorcKO老鼠在OVX治疗控制鼠E2(无花果。6 d)。此外,EREG和E2合并施打增强阴道上皮细胞增殖和维持细胞生存RptorcKO老鼠E2-treated控制老鼠透露Ki67和TUNEL染色(图。6 d)。随后,角化细胞包括differentiation-related基因Krt6a,Krt13水平调节OVX的阴道RptorcKO老鼠EREG管理局(无花果。6 e)。

YAP1作为组织生长和器官大小的关键调节器通过调节细胞增殖和细胞凋亡38]。解析EREG是否可以通过激活YAP1功能,免疫荧光分析使用阴道从OVX控制和执行RptorcKO老鼠(图。6 f)。在小鼠表皮(之前报道39),我们的研究结果表明,YAP1高度表达suprabasal-differentiated控制OVX小鼠阴道上皮细胞层和E2治疗。YAP1水平显著减少OVX的阴道上皮细胞RptorcKO老鼠E2治疗。有趣的是,EREG治疗显著诱导YAP1的表达水平RptorcKO老鼠(图。6 f)。总之,这些数据显示,EREG可能需要完全激活雌激素效应的阴道。和EREG可能促进阴道上皮的分化通过促进细胞增殖和通过YAP1维持细胞生存。

mTORC2信号对阴道上皮细胞的体内平衡没有影响

据报道,mTORC2有助于Akt激活,进而信号Foxo1,行为与mTORC1[协同起来40]。探索Rictor / mTORC2-dependent分子通路在阴道上皮细胞内稳态,老鼠携带的等位基因纯合子Rictor与老鼠携带loxP网站交配Pgrcre等位基因生成条件Rictor基因敲除小鼠(RictorcKO)(无花果。7一个)。的删除Rictor基因和蛋白质是由qPCR验证和免疫印迹(无花果。7 b, C)。观察生殖管道的RictorcKO的老鼠显示外部的阴道口Rictor缺乏的老鼠相当与控制老鼠(无花果。7 d)。核磁共振技术也被用于评价阴道体内发展。成人RictorcKO和控制小鼠相比最大和最小阴道直径(无花果。7 e, F)。阴道涂片从RictorcKO老鼠发情周期的四个不同阶段控制老鼠(无花果。7 g),表示RictorcKO小鼠正常的发情周期。他的研究结果表明,阴道组织的完整性RictorcKO老鼠一样的控件(无花果。7小时)。OVX模型、阴道上皮RictorcKO老鼠迅速扩散和分化后E2政府没有控制和观察到的差异RictorcKO老鼠(图。7小时)。这些结果表明,mTORC2信号不占优势E2-mediated小鼠阴道上皮细胞的增殖和分化。

图7:mTORC2信号中没有地位在阴道上皮细胞的发展。
图7

一个育种策略用于生成RictorcKO雌性老鼠。B的表达Rictor使用阴道的qPCR量化控制(n= 6)和RictorcKO (n= 5)老鼠。CRictor蛋白质含量的控制(n= 4)和RictorcKO (n= 4)阴道组织是由免疫印迹。β-Actin作为加载控制。实验重复两次。D总值形态的外部阴道口和生殖的控制(n= 5)和RictorcKO (n= 5)老鼠。E女性生殖系统的3 d渲染控制(n= 4)和RictorcKO (n= 4)小鼠基于核磁共振T2加权图像。规模的酒吧:5毫米。F准确的最大和最小直径的阴道被测量的基础上E。值表示为均值±SEM。G代表图像的阴道涂片细胞学评估控制RictorcKO老鼠用结晶紫染色法对发情周期的决心。n=每组5只老鼠。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:100μm。H代表HE-stained OVX控制和阴道部分RictorcKO老鼠所示。细胞核被苏木精染色。n每组= 3只老鼠。实验重复三次。显微镜的放大倍数×20。酒吧规模:50μm。

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讨论

雌激素发挥监管作用的开发和功能维护女性生殖器官生物学(41]。虽然雌激素可以激活mTOR信号,其作用的发育和功能的阴道仍然未知。使用功能丧失的小鼠模型,我们的角色特征mTORC1信号在阴道上皮内稳态的维护。本研究假设的方案提出了无花果。8。在阴道组织,雌性激素激活mTORC1绑定后,通过分泌生长因子信号通路。激活mTORC1参与阴道上皮细胞的增殖和分化调控表达水平的公关和EREG-YAP1(无花果。8)。mTORC1抑制雌激素反应和公关和EREG下调表达,从而影响雌激素使阴道上皮细胞的增殖和分化(无花果。8 b)。我们的研究结果表明,mTORC1是必要的发展和体内平衡阴道上皮细胞,这可能提供新的见解的管理绝经后女性阴道萎缩。

图8:一个可能的方案描述mTORC1信号在雌激素的作用在小鼠阴道上皮细胞增殖和分化。
图8

一个mTORC1信号参与阴道上皮细胞的增殖和分化促进公关和EREG-YAP1的表达水平Rptorfl / fl老鼠。B的损失Rptor妥协雌激素通过显示阴道上皮细胞的增殖和分化公关和EREG的表达。

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结果从先前的研究表明阴道雌激素是一种有效的治疗阴道萎缩的症状增加阴道组织厚度和水分,改善阴道血流量(32]。同样,两周后卵巢被移除,萎缩性改变阴道粘膜和开发的阴户。有趣的是,阴道上皮厚度显著增加后E2挑战OVX小鼠观察的控制,但不是RptorcKO老鼠。

此外,雌激素靶基因,包括Klk1,PgrE2治疗后显著调节控制小鼠的阴道,但不是RptorcKO老鼠,这意味着的阴道RptorcKO老鼠是雌性激素不敏感。值得注意的是,我们的研究结果与之前的研究表明上皮公关可能导致失调小鼠阴道上皮的增殖反应雌激素(37]。kallikrein-related肽酶(KLK)家庭,组织中表达丰富的女性生殖系统(42),是由雌激素严格监管。KLK1证明促进角化细胞迁移和增殖通过激活protease-activated受体信号(43]。加强雌激素可能启动几个信号级联包括mTOR促进阴道上皮细胞的增殖和分化。

生长因子和激素之间的协调的相声是必不可少的功能和体内平衡的女性生殖器官。管理EGF或TGF-αOVX成年小鼠诱发女性生殖道细胞增殖和分化,同时封锁TGF-α或EGF本身不能完全抑制雌激素使有丝分裂发生44,45]。在OVX大鼠,阴道内的政府BTC蛋白导致阴道上皮增生(32]。此外,沙土荒漠被牵连的效应ESR1 mosue阴道开发中使用一个器官培养系统(37]。分析后的mRNA水平生长因子的控制和阴道RptorcKO老鼠有或没有治疗E2,我们发现Ereg和Btc前两个显著调节基因控制老鼠的阴道后E2管理,但不是在吗RptorcKO老鼠。调查是否参与EREG阴道上皮细胞的增殖和分化mTOR的斡旋下,当地管理EREG OVX的阴道RptorcKO的老鼠,这可能部分救援阴道上皮分化的缺陷RptorcKO老鼠。有趣的是,EREG补充未能促进阴道上皮的PR的表达(结果未显示),虽然生长因子EGF和IGF-I作为诱导物的公关46,47),这表明EREG下游公关的目标,符合先前的报道在小鼠卵巢48]。EREG是表皮生长因子受体的配体和ErbB4我们也异形的mRNA水平鼠标ErbB家族的受体酪氨酸激酶。qPCR结果建议阴道的mRNA水平表皮生长因子受体/Erbb1,Erbb2,Erbb3,Erbb4可比WT与RptorcKO小鼠接受E2(数据没有显示)。我们相信mTORC1参与EREG雌激素生长因子的表达,而不影响阴道erbB受体的水平。

河马/ YAP1信号通路是细胞分化的关键调节器,增殖和凋亡。先前的研究已经证明,YAP1丰度可以由促性腺激素和性类固醇激素(49]。E2对促进经济增长和抗凋亡的影响通过上调YAP1在乳腺癌细胞的表达50]。同样,YAP1行为一个重要的角色在促进子宫内膜的增殖和抑制细胞凋亡(51,52]。可以激活YAP1 EGF家族的配体(53]。相反,激活YAP1还导致upregulation EGF-like增长因素,像沙土荒漠54]和EREG [55]。我们发现YAP1水平显著升高后阴道EREG的政府RptorcKO老鼠co-administrated E2。因此,mTORC1调节雌激素使阴道上皮细胞的增殖和分化EREG-YAP1通路。

值得注意的是,mTOR的确切作用在基质细胞和上皮细胞不能准确地阐明了通过使用我们的小鼠模型,更适用的模型是必要的。例如,epithelial-specific基因敲除小鼠模型CK-5Cre, stromal-derived因素可能在阴道上皮细胞内稳态也扮演着重要的角色。有趣的是,尽管先前的研究表明mTORC1损失函数不显著改变皮肤表皮增殖或凋亡[56),我们观察阴道上皮细胞凋亡和增殖抑制。

总之,mTORC1是雌激素使阴道上皮细胞增殖和分化的关键。在缺乏mTORC1、阴道上皮失去雌激素响应能力,导致萎缩。总的来说,一种改进的理解下游分子参与雌激素活动在组织层面将阐明estrogen-mediated阴道内稳态机制,提供新的见解我们对女性生殖障碍的理解。

材料和方法

老鼠

Rptor液氧/液氧老鼠(股票编号为013191)Rictor液氧/液氧老鼠(股票编号020649)从杰克逊实验室购买。PR-Cre老鼠从Cyagen获得生物科学(广州)。Rptor液氧/液氧老鼠了,PR-Cre小鼠产生Rptorfl / fl公关Cre / +(RptorcKO)老鼠。Rictor液氧/液氧老鼠了,PR-Cre小鼠产生Rictorfl / fl公关Cre / +(RictorcKO)老鼠。Rptor液氧/液氧老鼠或Rictor液氧/液氧老鼠被用作控制。同窝出生的液氧和gene-deleted老鼠利用在同一组实验遗传背景差异的影响降到最低。这次调查中使用的所有老鼠被安置在特定的无菌动物设施在暨南大学动物资源中心,按照道德准则暨南大学动物伦理委员会的批准没有:20210128 - 12)。

结晶紫染色的阴道涂片老鼠发情周期分段识别

发情周期的阶段RptorcKO,RictorcKO和控制老鼠(8 - 10 w)被确定使用结晶紫染色的阴道涂片如前所述[57]。短暂,被轻轻冲洗阴道细胞引入100μl PBS使用吸管,并转移到干燥的载玻片。下滑是风干,沾1%结晶紫(v5265 - 500 ml,σ)1分钟,后跟一个1分钟的在水中冲洗三次。幻灯片用盖玻片覆盖使用中性胶(g8590 - 100 ml, Solarbio),并查看与奥林巴斯BX53显微镜。

测量血清雌二醇和孕酮水平

鼠标在检测时间收集血液样本。血清水平的estradiol-17β(E2)和孕酮(P4)测量使用雌二醇2分析工具包(H102-1、南京建成生物工程研究所、南京、中国)和孕激素测定工具包(H089、南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商的建议。

激素治疗

在大多数实验中,小鼠OVX 6 - 8周的年龄和休息2周消除内生卵巢激素。用于检查E2的影响,一个皮下注射100 ng E2 (E8875σ)是给OVX小鼠3天,最后注入后杀死了24小时。阴道是组织学和qPCR收集分析。阴道的Rptor删除治疗和控制鼠E2或PBS为RNAseq收集分析。确定潜在作用激活mTORC1 E2的信号,一个皮下注射100 ng E2 OVX小鼠和牺牲注射后6 h。阴道收集免疫荧光的猛禽和Phospho-S6在无花果。1 d, E。用于检查EREG的影响,阴道内的注入400 ng EREG蛋白质(50599 - m01h Sinobiological)或PBS给OVX小鼠3天,和老鼠牺牲最后注射后24小时。

组织学

小鼠阴道组织在多聚甲醛固定修复解决方案(g1101 - 500 ml, Servicebio) 24 h和嵌入在石蜡,并在5μm分段。部分是干30分钟60°C, deparaffinized ddH2O和脱水;75%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、100%乙醇和水。的阴道与苏木精染色(G1140 Solarbio)和伊红(G1100 Solarbio)。阴道上皮细胞角化是确定使用PAS染色(G1281 Solarbio)。TUNEL分析是进行石蜡包埋的阴道使用原位检测细胞死亡工具包(11684817910,罗氏公司)根据制造商的指示。

免疫荧光和免疫组织化学

抗原检索是由加热部分柠檬酸钠缓冲(10毫米柠檬酸钠,0.05%渐变20,pH值6.0),持续15分钟。部分permeabilized在PBS triton - 100 0.2% 1% 45分钟然后阻塞(wt /卷)BSA分数V(山羊血清ST023 Beyotime)和10%(卷/卷)(B900780 Proteintech)在PBS的主要添加了抗体在免疫组织化学和免疫荧光染色。

免疫荧光染色,部分与以下主要抗体:孵化anti-Raptor (sc - 81537,圣克鲁斯生物技术),anti-Phospho-S6核糖体蛋白(Ser235/236)(62016年,细胞信号技术),anti-PR(9856年代,细胞信号技术),anti-ER-alpha Ab (ab32063 Abcam) anti-Ki67 Ab (ab15580 Abcam) anti-YAP1 Ab (13584 - 1 - ap, Proteintech) anti-EREG Ab (MAB1068、研发系统)在一夜之间在4°C。其次是孵化与二级抗体:Alexa萤石488 -共轭affiniPure山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L)(115-585-146,杰克逊ImmunoResearch), Alexa萤石594 -共轭affiniPure山羊anti-Mouse免疫球蛋白(H + L)(111-545-144,杰克逊ImmunoResearch) 1 H,并与DAPI nuclei-staining (D9542σ)在室温下10分钟。由徕卡TCS SP8共焦显微镜拍摄的照片。

免疫组织化学,组织部分浸在3% H2O245分钟后在室温下淬火内源性过氧化物酶透化作用。和以下主要抗体:anti-Ki67 Ab (ab15580 Abcam)一夜之间在4°C。第二天,与生物素化的二次孵化的部分抗体(ba - 1000 - 1.5,向量实验室)在室温下1小时。在PBS几个漂洗后,部分被孵化的Vectastain精英ABC试剂(pk - 6100、向量实验室)30分钟,和免疫反应性的信号是使用ImmPACT民建联EqV过氧化物酶(合)衬底(sk - 4103、向量实验室),并与苏木精复染色。

RNA提取和qPCR

从阴道组织总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。互补的dna(互补)是合成PrimeScript RT大师混合(RR036A,豆类)通过使用500 ng总rna根据制造商的指示。定量实时PCR进行评估感兴趣的基因的表达与SYBR绿色(RR820A、豆类)只连接实时PCR检测系统。mRNA的表达水平是由比较循环阈值(CT) (2−∆∆CT)方法。实验的基因表达数据规范化Actb。补充表中列出了qPCR引物1。

免疫印迹

蛋白分离和免疫印迹分析进行如前所述[58]。抗体猛禽(sc - 81537,圣克鲁斯生物技术),Rictor(2140年代,细胞信号技术),公关(9856年代,细胞信号技术),ER-alpha (ab32063 Abcam)和β-actin (66009 - 1 - ig Proteintech)。

超数排卵试验

雌性老鼠(8周)管理7.5 IU孕马血清促性腺激素(PMSG,贺南洪- 272,ProSpec), 48 h后7.5 IU的人类绒毛膜促性腺激素(hCG, 230734,σ)(i.p)。14 h的hCG注射后,卵巢和输卵管手术切除,cumulus-oocyte复合物质量从输卵管中恢复,并且收集到M2介质(σ)含有1毫克/毫升的透明质酸酶(H3506σ)分离积云细胞卵母细胞。卵母细胞的数量统计和记录。

体内MRI图像采集

MRI研究是使用力量执行Biospec 9.4 T临床磁共振扫描仪(美国力量Corp .)配备一个35毫米内径老鼠身体射频线圈。T2加权图像的雌性小鼠生殖器官,包括阴道和子宫,获得使用参数总结在补充表2。可视化、分割和雌性小鼠生殖器官的3 d模型建立进行了使用3 d切片机(4.11.20210226版)。横截面直径的阴道使用尺子测量功能3 d切片机。

基因集富集分析

先前发表的人类的数据(加入数字:GSE11622和GSE26761)被用于微阵列分析和GSEA分析。数据规范化使用limma R的包。GSEA分析使用clusterProfiler R包。

核糖核酸测序分析

阴道组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体)后,制造商的协议。RNA纯度和量化评估使用NanoDrop 2000分光光度计(美国热科学)。RNA完整性评估使用安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技)。图书馆是构建使用TruSeq滞留mRNA LT样本准备工具包(美国Illumina公司)和测序Novaseq6000平台。清洁读取映射到鼠标使用HISAT2参考基因组(GRCm38.p6)。FPKM每个基因的计算使用袖扣,每个基因的读计数被HTSeq-count获得。微分表达式分析使用DESeq (2012) R包。问值< 0.05和foldchange > 2或foldchange < 0.5设置为阈值显著的微分表达式。转录组测序和分析进行了OE生物技术有限公司(上海,中国)。RNAseq数据存入顺序读取存档(SRA)存储库在NCBI PRJNA787772 BioProject ID。

统计数据

使用双尾学生的统计分析t测试。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。