相互作用的转录coregulator NUPR1通过upregulation SREBP1促进肝癌进展的脂肪生成

肝细胞癌(HCC)是第六个最常见癌症和癌症相关死亡的第三大原因在世界范围内,随着发病率和一些有效的治疗选择1]。大多数HCC发生在慢性肝脏疾病的设置,如感染B型肝炎或C型和非酒精性脂肪肝(2]。肝脏是一个中心代谢器官在人体,已经建立了在合成中发挥核心作用,存储和脂质退化。越来越多的证据表明,脂质代谢改变人类肝脏肿瘤、移植脂肪从头合成,以确保增殖细胞获得额外的脂质膜生物起源、能源,信号和转录后修饰脂质分子(3,4]。此外,异常表达和活动参与脂肪酸的从头合成的关键酶,如脂肪酸合成酶(FASN)和stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1),已确定为肝癌发展(5]。甾醇反应元件结合蛋白1 (SREBP1),主转录因子脂肪从头合成和脂质稳态,据报道诱导肿瘤细胞的脂肪生成的重组,并提供一个关键致癌信号和肿瘤代谢之间的联系(6]。前体的乳沟SREBP1收益率成熟SREBP1 (mSREBP1)产品。一旦成熟,活跃SREBP1把原子核和transactivates目标基因的表达,如FASN和SCD1 [7]。然而,SREBP1需要额外co-regulatory转录因子调节正常启动子(8]。

核内蛋白1 (NUPR1 / p8 / COM1)是一个转录coregulator和多功能跟压力蛋白,它的作用在几个最近引起人们的重视protumorigenic过程在不同癌症类型,包括细胞生长、迁移、入侵、耐药性,ferroptosis、血管生成和线粒体呼吸9,10,11]。表达升高NUPR1一直与高脂肪饮食有关,和有人建议NUPR1可以防止组织细胞损伤在肥胖和高脂肪饮食的背景下(12,13]。鉴于肝脏是最重要的器官参与脂质合成和代谢和NUPR1与脂质代谢相关,我们试图检查是否NUPR1可能影响肝癌进展通过改变脂质代谢。

在目前的研究中,我们发现NUPR1可以与mSREBP1交互,表明NUPR1充当co-regulatory SREBP1的转录因子。此外,我们发现NUPR1可以促进肝癌细胞的恶性可能通过促进核易位SREBP1和transactivating目标基因的转录活性形式FASN SCD1,导致脂质积累。此外,药物或基因的封锁NUPR1-SREBP1 / FASN途径增强体内和体外抗癌活动。

NUPR1在LIHC组织和调节与贫穷的生存

初步调查NUPR1转录表达水平的癌症,我们分析一个TCGA pan-cancer队列。我们发现NUPR1被调节以多种癌症类型,包括LIHC(肝脏肝细胞癌(HCC)), BRCA(乳腺浸润性癌),“绿带运动”(多形性成胶质细胞瘤),KICH(肾chromophobe) KIRC(肾肾透明细胞癌),KIRP(肾肾乳头状细胞癌)和马(前列腺腺癌(图)。1)。经过临床阶段,分层Cox比例风险模型被用来评估的重要性NUPR1对病人的结果。我们发现NUPR1 LIHC的危险因素和THYM(胸腺瘤(图)。1 b)。此外,kaplan meier曲线表明,NUPR1表达式与LIHC病人生存,随着10年期总体存活率低表达组明显优于高表达组(p= 0.033无花果。1 c)。进一步证实我们的研究结果的临床意义,我们分析了NUPR1表达组织从LIHC病人,这表明NUPR1的表达在肿瘤组织与正常组织相比显著增加(图1 d, E)。这些结果提供了令人信服的证据表明NUPR1可能与LIHC进展。

NUPR1促进肝癌细胞体外增殖和诱导体内肿瘤的生长

演示的作用NUPR1在肝癌细胞的生长和迁移,我们过表达NUPR1 mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞株和稳定撞倒了NUPR1 Huh7和smmc - 7721细胞系基于他们的表达内源性NUPR1(补充图。1)[14]。这些效率NUPR1超表达向量(LV-NUPR1)和shrna首次评估中存在(无花果。2)。然后稳定免疫印迹进行确认过的NUPR1 mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞的差别,对这些Huh7和smmc - 7721细胞,分别(无花果。2 b和补充图。1 b, C)。随后,CCK-8、EdU和集落形成试验探讨了NUPR1对肝癌细胞增殖的影响。如无花果所示。2摄氏度,NUPR1 overexpressing肝癌细胞表现出显著增强的增殖率。同样,在EdU化验,NUPR1 upregulation增加的百分比EdU阳性细胞(图。二维)。此外,表达下调NUPR1表达显著抑制Huh7和smmc - 7721细胞的增殖导致更少的殖民地(图。2 c、G)。mhcc - 97 h细胞与LV NC / LV-NUPR1和smmc - 7721细胞与空白/ shRNA1皮下注入BALB / c裸小鼠。NUPR1超表达显著增加肿瘤体积和重量的异种移植小鼠模型(无花果。2 e),而NUPR1击倒抑制肿瘤生长(图2 h)。NUPR1超表达在异种移植肿瘤样本进一步证明了包含IHC(无花果。2 f)。总的来说,这些发现表明,NUPR1可以促进肝癌细胞的增殖和肿瘤生长在体外和体内。

NUPR1促进肝癌细胞的迁移

伤口愈合和transwell迁移进行了分析评估NUPR1对细胞迁移的影响。细胞划痕试验表明NUPR1超表达显著增强伤口差距关闭mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞相比,对照组(无花果。3)。击倒Huh7 NUPR1显著抑制这些变化的smmc - 7721细胞(图。3 b)。与此同时,在transwell迁移试验,NUPR1 overexpressing肿瘤细胞(mhcc - 97 h_LV-NUPR1,57.00±4.359,SK-Hep1_LV-NUPR1,153.3±7.126)表现出一个侵入性表型明显多于控制细胞(mhcc - 97 h_LV-NC,29.33±2.186,SK-Hep1_LV-NC(85.00±1.528)p< 0.01)(图3 c)。然而,NUPR1击倒抑制Huh7细胞的迁移能力(无花果。3 d)。这些发现表明,NUPR1在肝癌细胞有刺激对细胞迁移的影响。

NUPR1与mSREBP1 mSREBP1和诱发核条目

上述实验结果表明NUPR1与肝癌细胞增殖和侵略性的表型。进一步探索潜在的分子机制,我们收集人类RNA-seq TCGA数据从数据库LIHC项目。差异表达基因调节高NUPR1表达式和低表达组之间受到KEGG通路富集分析。我们发现一个强大的协会之间NUPR1和非酒精脂肪肝(hsa04932)以及胆固醇代谢(hsa04979)(补充表1)[15]。它建立了转录coregulators可以身体与转录因子相互作用,调节靶基因的转录因子的一个常见子集(16]。因此,我们试图确定直接绑定合作伙伴NUPR1 mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞转染Flag-tagged NUPR1 co-immunoprecipitation。重要的是,我们发现mSREBP1 NUPR1-interacting蛋白质。除此之外,需要额外的co-regulatory转录因子在所有SREBP-regulated启动子研究。如无花果所示。4,我们执行anti-Flag免疫沉淀反应之后,免疫印迹和anti-SREBP1发现一群的活跃的成熟形式SREBP1 (mSREBP1)。免疫沉淀反应的内生SREBP1 NUPR1进行免疫印迹(无花果。4 b)。上述免疫沉淀反应化验证明NUPR1之间的交互和mSREBP1 mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞。

同时,我们分析了影响NUPR1 SREBP1及其表达的亚细胞定位。的存在和免疫印迹结果表明,过度NUPR1显著调节SREBP1表达式mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞与对照组相比(图4 c, E),而下调NUPR1减少SREBP1表达式(无花果。4 d, F)。此外,细胞分离和免疫印迹NUPR1证明过度增加核表达SREBP1 mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞(图4 g),而击倒NUPR1减少核本地化mSREBP1(无花果。4 h)。此外,我们还观察到一个连接NUPR1通过免疫组织化学方法和SREBP1 HCC患者样本(包含IHC)(软木= 0.4506,p= 0.0233,无花果。5 e)。综上所述,这些实验证明NUPR1 SREBP1表达增加,核本地化,可以绑定到mSREBP1,暗示NUPR1转录coregulator SREBP1。

NUPR1调节脂肪生成酶和脂质含量在肝细胞

增加核SREBP1蛋白质与mRNA水平升高有关的已知SREBP1目标基因参与脂肪酸的生物合成。因此,我们评估了脂肪acid-metabolizing酶表达的细胞系。如无花果所示。5的信使rna表达水平FASN, SCD1和脂肪酸desaturase 2 (FADS2)显著增加NUPR1 overexpressing mhcc - 97 h细胞,和转录水平的FASN SCD1和脂肪酸desaturase 1 (FADS1)调节NUPR1 overexpressing SK-Hep1细胞,随后经免疫印迹(图。5 b)。此外,NUPR1击倒mRNA和蛋白水平的差别导致了重大的对这些FASN, SCD1, FADS1 FADS2,相比新成分控制Huh7和smmc - 7721细胞(图。5 c, D)。此外,从包含IHC HCC患者样本结果显示积极和显著的相关性NUPR1和FASN(软木= 0.5047,p= 0.0012,无花果。5 f)。除了upregulation SREBP1及其目标基因,NUPR1过度也诱导肝癌细胞中脂滴的积累(无花果。5克)。这些结果表明,NUPR1可能作为转录coregulator SREBP1,因此提升相关靶基因的表达,导致细胞内脂滴的积累。

通过加强SREBP1 NUPR1促进肝癌细胞的恶性肿瘤/ FASN-mediated脂肪从头合成

Fatostatin,特定抑制剂,如激活,据报道在多种癌症类型(具有抗肿瘤活性17]。正如所料,NUPR1超表达量可以抑制脂肪生成的酶诱导表达co-incubation 20μM Fatostatin mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞(图。6)。此外,迅速引起的细胞增殖率NUPR1过度也可能被逆转药物抑制SREBP1(无花果。6 b, C)。的迁移能力NUPR1-overexpressing mhcc - 97 h细胞治疗Fatostatin也降低与对照组相比(图。6 d)。此外,肝细胞处理Fatostatin展出减少脂滴堆积(无花果。6 e)。总的来说,这些结果证实NUPR1 overexpression-induced细胞增殖,迁移和脂滴堆积SREBP1抑制体外可以逆转。

上面的实验显示NUPR1对调节的影响肝癌细胞的恶性表型是依赖SREBP1表达式。由于FASN SREBP1的关键目标基因,我们假设抑制FASN也可以反向NUPR1-induced变化。FASN C75,不可逆抑制剂,用于进一步研究FASN的角色NUPR1-mediated肝癌细胞恶性表型CCK8和transwell紧随其后迁移化验。正如所料,NUPR1 overexpression-induced细胞增殖可以逆转的政府50μM C75(无花果。7 a、B)。同样,移民迁移实验显示能力降低C75治疗(无花果。7 d)。如无花果所示。7 c,脂滴堆积也降低肝癌细胞与FASN抑制后。这些观察暗示NUPR1促进肝癌细胞的增殖和迁移的转录活性形式移植SREBP1,粘住FASN表达式和促进脂质积累。

NUPR1 stress-inducible核蛋白质对细胞压力和癌症启动特性和开发属性。目前的研究表明,NUPR1促进肝癌细胞生长和迁移导致肝细胞癌进展,符合出版的文献。上下文中的表达升高NUPR1高脂肪饮食曾被报道。最近的研究表明NUPR1保护组织免受细胞损伤在肥胖和高脂肪饮食的背景下(13]。综上所述,这些研究结果强烈支持NUPR1和脂质代谢之间的关系。鉴于NUPR1高度表达高脂肪饮食和参与肝细胞癌发病机制后,我们试图阐明可能在HCC NUPR1和脂质代谢之间的关系。

在目前的研究中,小说的角色NUPR1在LIHC曾发现进展。NUPR1显示在肝脏肿瘤组织和LIHC患者的不良预后相关。有趣的是,我们发现NUPR1和SREBP1之间的相互作用。鉴于NUPR1属于染色质remodelers HMG家族的转录辅因子的活动,它可以作为转录coregulator发挥重要作用。在随后的实验中,我们发现NUPR1促进肝癌细胞增殖和迁移通过促进核易位SREBP1和transactivating目标基因的转录活性形式如FASN促进脂肪生成。药物或基因的封锁NUPR1-SREBP1 / FASN途径增强抗癌活性在体外和体内。这些结果表明,NUPR1起着促进的作用,增强SREBP1-mediated表达FASN在肝癌细胞和脂肪从头合成。虽然NUPR1据报道在肿瘤的发生和发展,所知甚少的潜在机制(s)的规定由NUPR1癌症细胞的脂质代谢。

人们普遍认为积极增殖细胞,特别是肿瘤细胞,增加脂质要求,依赖从头合成。一个增强脂肪从头合成在癌细胞一直以来被认为是恶性肿瘤的重要特征(18]。在这方面,表达升高SREBP1已经观察到在很多类型的癌症和与攻击性和恶性表型(19,20.]。更重要的是,需要额外的co-regulatory转录因子SREBP-regulated推动者。越来越多的证据表明,SREBP1的成熟和核易位是由各种各样的蛋白质,蛋白质-蛋白质之间的关系与表观遗传修饰,优雅地将细胞外信号,如胰岛素,或细胞内的信号,如氧化应激、脂类的生物合成调节的转录活动SREBP1 [21,22]。高度增殖细胞,肿瘤相关FASN是必要的膜脂质生产和脂滴形成支持增加增殖和代谢23]。不饱和脂肪是一种脂肪酸和至少一个双键的脂肪酸链,可以催化脂肪酸desaturases。不饱和脂肪酸是细胞膜的磷脂的重要组成部分,有助于维持膜流动性24]。有充分的证据表明,增加脂质不饱和现象是一种针对癌症的代谢标记干细胞参与肿瘤恶化和不饱和脂肪酸(25,26]。Borrello等人指出,NUPR1保护肝脏免受lipotoxicity通过调节脂肪酸代谢(27]。在我们的研究中,所扮演的角色NUPR1脂肪酸代谢的监管机构证实。虽然取得了相当大的努力,以确定脂肪生成的酶调控的机制,目前尚不清楚如何调节异常脂肪酸影响细胞命运的癌症。

先前的研究已经表明,抑制NUPR1 zzw - 115,一个强大的NUPR1抑制剂,产生一种强大的抗癌效果在HCC在体外和体内28]。更重要的是,我们表明,高NUPR1-expressing显示肝细胞癌细胞增殖能力强在体外和体内,而NUPR1击倒抑制肿瘤生长在皮下异种移植模型中。我们还发现肝细胞癌细胞NUPR1较高的表达水平表现出更具有攻击性的表型。集体,NUPR1是一种很有前途的治疗肝癌的目标和zzw - 115在治疗肝癌有巨大的临床应用前景。

然而,这项研究有一些局限性。首先,底层机制NUPR1在肝癌细胞的脂质代谢并没有澄清目前的研究。此外,它应该承担记住几个脂肪酸desaturases可能由NUPR1监管,而不饱和脂肪酸的特定角色没有调查。此外,功能富集分析显示NUPR1与非酒精脂肪肝,肝细胞癌的主要危险因素。然而,NUPR1的功能性意义在非酒精脂肪肝没有解决。这项研究的另一个限制是NUPR1表达主要在周围的地区炎性浸润或纤维母细胞渗透基于我们包含IHC染色结果。此外,NUPR1报道中发挥至关重要的作用在肝脏的纤维化,胰腺和肾脏15,29日,30.]。NUPR1之间可能存在一种密切的关系和慢性肝炎和肝癌微环境恶化。进一步的研究是必要的调查具体的潜在机制。

总之,我们的研究结果提供了新的见解NUPR1功能和描述一个假定的机制增加肝癌细胞增殖和迁移通过调节脂质合成。重要的是,NUPR1对肝癌病人是一个非常有前途的治疗目标。

生物信息学分析

首先,我们比较NUPR1表达肿瘤与正常组织之间跨不同癌症类型使用公开可用的在线肿瘤免疫评估资源2.0(2.0定时器)数据库,综合资源从癌症基因组图谱(TCGA)。随后,我们探索NUPR1表达式之间的关系和临床结果LIHC病人使用Cox比例风险模型,使用定时器2.0调整临床阶段。此外,我们将LIHC样本分成三组根据他们NUPR1表达式(程度上四分位数;四分位范围;下四分位数),将上四分位数之间的10年总生存期组(高集团)和下四分位数集团(集团)低。至于富集分析,我们收集人类LIHC RNA-seq TCGA数据从数据库LIHC项目并将肿瘤样本分成三组根据他们NUPR1度表达式(上四分位数、高组;四分位范围;下四分位数,低组)。高NUPR1之间的差异表达调节基因表达和低表达组受到京都基因和基因组百科全书(KEGG)使用R包clusterProfiler通路富集分析。

患者样本

Formalin-fixed石蜡包埋标本,包括主癌标本(n= 50)和相应的非正常组织标本用于包含IHC收集从肝癌病人。所有临床标本来自南方医院接受手术和病理证实为肝细胞癌。所有实验中人体组织都符合赫尔辛基宣言的原则和制度审查委员会批准南方医院(表1)。

免疫组织化学检测

组织与10%福尔马林溶液固定和嵌入石蜡。5µm-thick部分被削减和烤60分钟60°C。然后,组织部分与二甲苯deparaffinized,患者分级乙醇,然后带到蒸馏水。为抗原检索,部分被淹没在柠檬酸缓冲(pH值6.0)在压力锅在高压下5分钟。内源性过氧化物被3%的过氧化氢,5%牛血清白蛋白在PBS溶液添加为30分钟块在室温下非特异性结合,其次是初级抗体NUPR1(1:15 0稀释,Proteintech,北京,中国;15056 - 1 - ap)孵化一夜之间在4°C。第二天,组织部分与PBS清洗三次,孵化与二次抗体60分钟再洗。疣状后轻拍工具包(MXB生物技术),部分与苏木精复染色、脱水和密封。

细胞培养和病毒感染

mhcc - 97 h, SK-Hep-1 Huh7和smmc - 7721细胞系得到写明ATCC和细胞从身份验证通过STR分析和物种进行身份验证。杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)37°C公司5%₂。体内植入前细胞通道,贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶收获。慢病毒表达的NUPR1 (LV-NUPR1)和NUPR1成分设计、合成了wzbio(山东、中国)。慢病毒转导的细胞系培养在24-well板块包含0.5毫升的DMEM培养基补充5毫克/毫升聚凝胺(σ,中国上海)和20µl病毒集中。12 h后感染,细胞被洗了,可以恢复之前的24小时任何进一步的过程。

免疫印迹分析

溶解肿瘤细胞总蛋白提取得到的里帕裂解缓冲(Beyotime P0013B)含有磷酸酯酶和蛋白酶抑制剂(南方,CW2200S和CW2383S)。由布拉德福德蛋白质含量进行了分析测定(Sigma-Aldrich)。样本size-fractionated通过sds - page,然后转移到聚乙烯二氟化物膜。一夜之间,屁股被孵化在4°C主要抗体,紧随其后的是二级抗体山羊anti-rabbit或anti-mouse免疫球蛋白。核和细胞质分数使用核和胞质蛋白提取分离设备(Beyotime P0028)根据制造商的指示。

Co-immunoprecipitation

蛋白质免疫沉淀反应,细胞(1×10⁷)过表达Flag-tagged NUPR1收获,溶解产物样品含2000μg总蛋白质的免疫沉淀反应4μl M2-Flag(σ)或SREBP1(圣克鲁斯生物技术)分别在4°C一夜之间,其次是孵化与40个μl蛋白质A / G +琼脂糖珠(圣克鲁斯生物技术)在4°C 4 h。珠子被清洗和煮40µl加载缓冲区,然后西方墨点法进行了使用SREBP1 (Proteintech, 14088 - 1 - ap)或anti-NUPR1 (Proteintech, 15056 - 1 - ap)。输入图中使用的蛋白质。4约280µg和8μl用于IP。

RNA孤立存在

培养细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(精确的生物技术,AG21102)根据制造商的协议。然后总RNA反转录成互补DNA使用中存在的Evo M-MLV RT预混料(精确的生物技术,AG11706)。对数据分析,基因表达是规范化和beta-actin表示为相对表达式,由阈值确定周期(C_T)随着褶皱变化= 2^-Δ(ΔCT),ΔC_T= C_{T NUPR1}−C_Tβ-actin和Δ(ΔCT) =ΔC_Ttumor-ΔC_T正常的。引物序列提供了补充表2。

细胞增殖实验

对细胞生存能力检测,细胞计数Kit-8 (CCK8)和5-ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU)化验进行根据制造商的协议。细胞被播种在96井的密度板1×10³细胞/好,在一个10%的边后卫DMEM培养基培养。CCK8试剂(Dojindo、东京、日本)添加和孵化2 h每天一次连续6或7天。EdU染色进行使用EdU标签工具包(Ribobio C10310-1)。细胞集落形成能力是衡量平板集落形成试验。细胞(1000或500个细胞/ /)被镀成6-well盘子和培养2周。殖民地是用4%多聚甲醛固定,使用0.1%结晶紫染色图像J软件解决方案和计算。药物治疗后细胞生存能力评估在以下HCC肿瘤细胞系:mhcc - 97 h和SK-Hep1。细胞被播种在96 -孔板(4000个细胞/)的第一天。一夜之间文化后,细胞中取代Fatostatin(20μM,多国评价,hy - 14452)或C75(50μM,多国评价,hy - 12364)第二天。48 h后药物治疗,CCK8或EdU用于测量细胞的生存能力,和细胞生存能力率与对照组比较。

Transwell迁移分析

细胞与胰蛋白酶消化,离心机,并与PBS洗两次。细胞的浓度调整到5×10⁵细胞在无血清培养基/毫升。transwell室8.0μm (SK-Hep1 Huh7和smmc - 7721)或12.0μm (mhcc - 97 h)毛孔被插入到24-well盘子,200μl细胞悬液中添加transwell室。700年μl中含有20%的边后卫在众议院增加。SK-Hep1, Huh7和smmc - 7721细胞培养10 h和mhcc - 97 h细胞培养72 h在37°C的5%股份₂。孵化后,钱伯斯和PBS洗两次,然后用4%多聚甲醛固定30分钟,20分钟0.1%结晶紫染色,洗两次与PBS。Transwell室使用倒置显微镜拍摄的结果。

细胞划痕测试

细胞被播种在6-well板10%的边后卫的媒介。细胞融合增长到90%时,整个细胞单层抓了10µl吸管提示创建一个统一的伤口游离。碎片被轻轻洗PBS和细胞无血清培养系统中。胞外区域的长度是监控和拍照在0,使用光学显微镜48和96 h。数据表示为一个百分比的初始长度在时间为零。

Bodipy染色,显微镜

大多数肝脂质是储存在肝细胞胞质脂滴,三酰甘油和胆甾醇酯组成的中性脂质仓库。因此,BODIPY 493/503的中性脂质仓库是用来检测mhcc - 97 h和SK-Hep1细胞(31日]。细胞生长在一个共焦培养皿(巢)和孵化72 h。然后与PBS和4%多聚甲醛固定细胞被洗。随后,这些细胞被孵化2µM BODIPY (Glpbio)染色溶液,然后用PBS洗了三遍。细胞核与DAPI染色和细胞激光共焦显微镜下观察。

BALB / c-nude小鼠肿瘤发生的实验

我们创建了一个老鼠皮下注射新型癌症诱导的mhcc - 97 h (LV-NC和LV-NUPR1)细胞或smmc - 7721 (smmc - 7721和smmc - 7721 shNUPR1-1)细胞。有没有雄性BALB / c裸小鼠购买形成广东医学实验动物中心,广东,中国。老鼠被随机分配到两组。总共5×10⁶细胞悬浮在100µl PBS和皮下注入BALB / c裸小鼠的右翼。裸体小鼠的肿瘤发生观察每3天。老鼠牺牲后28天注射,异种移植是解剖,拍照,加权,中性缓冲福尔马林固定,随后分析了包含IHC。动物程序南方医院的机构审查委员会批准。

统计分析

统计软件GraphPad棱镜在这项研究中被用来评估数据。一个未配对的双尾的学生t测试是用来比较两组,对比分析了多个组通过单向方差分析Dunnett事后测试。相关分析是评估使用皮尔逊相关系数。一个p值< 0.05在统计学上意义重大。误差在所有数字代表均值±SD。*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;“ns”不重要。