介绍

通过向中枢神经系统(CNS)输送治疗物资，基因疗法已成为治疗一系列神经退行性疾病的一种有前景的方法。在所有基因治疗载体中，腺相关病毒(AAV)成为体内基因治疗最强大的系统，通过不同的给药途径转导广泛的分裂和非分裂细胞类型，并具有令人印象深刻的安全性[1，2，3.]。

AAV是一种小的单链DNA细小病毒，最初于1965年被确定为腺病毒制剂中的污染物[4]。事实上，它是最小的病毒之一，具有直径约25纳米的无包膜二十面体衣壳，属于细小病毒科Dependovirus属。aav封装了一个4.7千碱基的线性单链DNA基因组，其两侧是两个反向末端重复序列(ITRs) [5]。重组版本的aav (raav)可以通过在itr之间插入感兴趣的基因来定制[6]。

基于衣壳氨基酸序列的多重差异，AAV有11种自然存在的血清型，从人类和非人类灵长类组织中分离出100多种变体[2，7，8]。据预测，结构可变区构象的差异决定了不同菌株的衣壳具有不同的抗原性，并与不同的细胞受体结合，从而在不同的哺乳动物器官中提供独特的组织趋向性和转导效率[9，10]。发现一种特殊的血清型AAV9能够穿过血脑屏障(BBB)，这提高了使用非侵入性递送途径实现广泛的中枢神经系统基因表达的可能性[11]。自首次使用aav作为转导载体以来[12，13]，临床前研究、临床试验和已上市的基于aav的药物继续显示出前景，并以谨慎乐观的态度取得进展[14，15，16，17]。

尽管人们致力于更好地了解AAV的生物学特性，但缺乏合适的成像技术以单细胞分辨率有效地监测其在整个器官中的趋向性，这阻碍了对AAV特性的充分了解，这是其作为基因传递载体所必需的。在组织深处成像的能力受到样品不透明度的限制。这是由于富含内源性发色团(血红蛋白和肌红蛋白)的组织吸收光，最值得注意的是，在不同分子、亚细胞结构、膜和细胞群之间的边界上散射量的不均匀[18，19，20.，21]。在小鼠大脑中，不透明度限制了光穿透深度，在标准激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)中可达100-200µm，在双光子激发荧光显微镜(TPEFM)中可达500-800µm。当大脑样本被固定以保留详细的结构时，这个问题似乎更成问题，将成像深度减少到最大300微米[22，23]。

作为一种常见的解决方案，传统的组织学研究需要切片和重建来观察深层细胞结构，其缺点是耗时，难以自动化，容易造成组织缺陷和许多结构的破坏[24，25]。

或者，最近的研究将他们的努力转向通过i)洗涤或脱色内源性发色团，ii)有意去除疏水性脂质，iii)轻度变性蛋白质从而改变其水合状态和/或iv)匹配细胞成分内不同介质的折射指数(RI)来使整个器官具有光学透明度[20.，26，27，28]。这个想法最早在一个多世纪前由斯帕尔特霍尔兹提出，从那时起[29，30.]，已经开发了大量的方案，并可根据其主要机制分类为:有机溶剂基、水基和组织转化方法[23，31，32，33]。每种方法在组织透明度、组织大小变化、细胞和组织水平形态完整性、抗原和荧光保存、时间和成本效率等方面各有优缺点。

由于光在组织深处畅通无阻地传播，因此可以通过LSCM、TPEFM或光片荧光显微镜(LSFM)获得三维(3D)图像。虽然LSCM和TPEFM是用于小样本成像的慢点扫描方法，但LSFM已经重新成为一种强大的工具，可以在更广泛和更深的组织区域以快速采集速度生成单细胞分辨率图像，同时减少光漂白和光毒性作用[2]。34，35，36，37]。由于这些原因，自2007年以来，几种LSFM技术已成为对大型清除样本成像的首选方法[38，39]。

考虑到组织清除技术和LSFM相结合所带来的机会，在本研究中，我们的目标是开发一种新的管道，用于在全脑水平上以单细胞分辨率分析现有和新型raav血清型变体的生物分布。例如，通过(i)标准30µm脑切片和免疫组化(IHC)染色，(ii) 1 mm脑切片、清除和免疫组化染色，以及(iii)全脑半球清除和直接分析，评估静脉(IV)注射后rAAV9在小鼠脑中的转导效率。

材料与方法

病毒载体

在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下，从Addgene (Addgene病毒prep #105530-AAV9-pAAV.CMV.PI.EGFP.WPRE)获得编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP) (rAAV9 - EGFP)的病毒载体。bGH来自James M. Wilson;RRID: Addgene_105530;http://n2t.net/addgene:105530;沃特敦，马萨诸塞州，美国)。

rAAV制剂的滴度，以病毒基因组表达/µL (vg/µL)，使用AAVpro™滴定试剂盒Ver.2 (Takara Bio Inc，滋贺，日本)和StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，按照制造商的说明，通过实时PCR检测。

动物的处理

所有涉及动物的实验均按照欧盟共同体关于实验动物护理和使用的指令(2010/63/EU)进行，该指令于2013年转化为葡萄牙法律(法令113/2013)。此外，动物程序由科英布拉大学医学院动物福利负责组织和神经科学与细胞生物学中心授权的动物设施批准(国际动物福利保证编号520.000.000.2006)。研究人员接受了充分的培训(felasa认证的课程)和葡萄牙当局颁发的进行实验的证书(葡萄牙里斯本食品 总局)。这些动物被安置在一个温度控制的房间里，保持12小时的明暗循环。提供了食物和水随意。一切努力都是为了尽量减少痛苦。

新生儿静脉注射

野生型新生小鼠随机用于评估静脉注射rAAV9-EGFP的脑转导效率，该小鼠由Charles River实验室(Les Oncins, Saint Germain Nuelles, France)的雄性和雌性C57BL/6小鼠在室内交配产生。从胚胎第17天到第21天，怀孕小鼠单独饲养，每天监测，尽可能减少干扰，以确保新生幼鼠在出生后第2天给药(P2)。

6只新生小鼠最初在冰床上休息约1分钟进行麻醉。病毒制备物共含1 × 10个11将rAAV9-EGFP用50µL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释1 × pH = 7.4 (Fisher BioReagents, Pittsburgh, PA, USA)，并添加0.001% Pluronic F-68 100x (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，使用100µL Hamilton注射器连接30号斜面尖针(Hamilton, Reno, NV, USA)，手动注射到4只新生小鼠的面部静脉。注意到静脉变白，证实注射正确。2只阴性对照动物注射50µL PBS 1x，外加0.001% Pluronic F-68 100x。注射后，幼崽被允许在一个温暖的平台上康复，通过脚趾上的纹身来识别，仔细清洁，用原来的被褥摩擦以防止母亲排斥，然后回到原来的笼子里。

组织收集和准备

rAAVs (P55)静脉给药53天后，小鼠通过腹腔注射氯胺酮(Clorketam 1000, vsamutoquinol, Lure, France)和噻嗪(Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany)的混合物，经心脏灌注冷PBS 1x (pH = 7.4)，然后第二次灌注新鲜制备的冷冻4%多聚甲醛(PFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，进行终末麻醉。切除灌注好的脑，在4°C下用4% PFA固定过夜，然后转移到20%蔗糖/PBS 1x溶液中冷冻保护。一旦大脑下沉(大约48小时后)，它们被冷冻并保存在- 80°C。

对于标准IHC，使用低温恒温器(CryoStar NX50, Thermo Scientific, Thermo Fisher Scientific)在- 21°C下切割厚度为30µm的连续矢状切片。每只动物的96个左半球矢状面切片按解剖序列收集，在添加0.05%叠氮化钠(Sigma-Aldrich)的PBS 1x中作为自由浮动切片，保存在4°C以待进一步处理。

右脑半球要么被完整地处理以进行清理，要么被切成1毫米的薄片。对于后者，将大脑半球包埋在4%低熔点琼脂糖立方体中(Sigma-Aldrich)，并在振动琴(VT1200S, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)上获得1mm厚的矢状切片。随后处理厚脑切片进行清除和免疫标记。

标准荧光免疫组织化学

选取8个矢状30µm切片进行荧光免疫组化处理，每只动物的相交距离为240µm。该方案首先在含有10%正常山羊血清(NGS, Gibco)的0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)中进行阻断和渗透步骤，在室温下PBS 1x中放置1小时。然后，自由漂浮切片在4°C下与以下一抗孵育过夜:兔多克隆抗gfp抗体(1:1000，目录# A-6455, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)，鸡多克隆抗gfp抗体(1:50 00，目录# ab13970, Abcam，剑桥，英国)，兔多克隆抗电离钙结合适配器分子1 (Iba1)抗体(1:1000，目录# 019-19741,FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，大阪，日本)，小鼠单克隆抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(1:50 00，目录# IF03L，默克Millipore，Burlington, MA, USA)，兔多克隆抗神经元核(NeuN)抗体(1:1000，目录# ABN78，默克Millipore)，兔多克隆抗少突胶质细胞转录因子2 (Olig2)抗体(1:500，目录# AB9610，默克Millipore)和小鼠单克隆抗calbindin (CALB)抗体(1:500，目录# 214011,Synaptic Systems, Goettingen，德国)。在PBS 1x中洗涤15分钟，经过三个步骤，切片在室温下与相应的二抗孵育2小时:偶联Alexa Fluor 488荧光团的山羊多克隆抗兔抗体(1:20 00，目录# A-11008, Invitrogen)，偶联Alexa Fluor 488荧光团的山羊多克隆抗鸡抗体(1:20 00，目录# A-11039, Invitrogen)，偶联Alexa Fluor 568荧光团的羊驼单克隆抗兔纳米体(1:50 00，目录# srbAF568-1, Chromotek, Planegg-Martinsried，德国)，偶联Alexa Fluor 647荧光团的羊驼单克隆抗小鼠纳米体(1:50 00，目录# A-11008, Invitrogen)，目录# sms1AF647-1, Chromotek)。脑切片在PBS 1x中洗涤三次，装在涂有明胶的显微镜载玻片上，盖上荧光装片培养基(S3023, Dako, Glostrup, Denmark)。

用蔡司Axio扫描显示经EGFP免疫组化处理的矢状脑切片的染色。Z1显微镜(卡尔蔡司显微镜有限公司，耶拿，德国)，配备Plan-Apochromat 20倍/0.8物镜。使用配有Plan-Apochromat 20x/0.8物镜的ZEISS Axio Imager Z2 (Carl ZEISS Microscopy GmbH)，用EGFP和不同的细胞标记物标记小脑和海马。在配有Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC物镜的倒置共聚焦显微镜ZEISS LSM 710 (Carl ZEISS Microscopy GmbH)上获取不同的z-stacks，生成小脑和海马特定区域的详细图像。

脑厚切片的清除和免疫标记

在振动器上生成1毫米厚的小鼠脑切片，随后用“Binaree组织免疫染色清除试剂盒”(SHBI-001, Binaree, Inc.，大邱，大韩民国)进行清除和标记[40]。脑切片最初在2ml固定液中4°C下缓慢滚动孵育24小时(或直到沉淀发生)。然后将样品转移到900µL组织清除溶液A中，在37°C/60 rpm下孵育4天，然后用5 mL洗涤液在37°C/60 rpm下洗涤12小时。脑切片在900µL组织清除液B中37°C/60 rpm浸泡2天，然后用5 mL洗涤液在37°C/60 rpm下洗涤12小时。此时，样品在4ml自制的渗透阻断溶液a [PBS 1x含0.2% Triton X-100, 20%二甲基亚砜(DMSO, PanReac AppliChem, Barcelona, Spain)， 10% NGS]中37°C/60 rpm孵育3天，然后在37°C/60 rpm下用抗calb抗体(1:50)标记6天，稀释在自制的渗透阻断溶液B (PBS 1x含1% Triton X-100, 5% DMSO, 10% NGS)中。样本洗2毫升的清洗解决方案在37°C / 60 rpm和孵化24小时37°C / 60 rpm 5天用二级抗体羊驼单克隆anti-mouse Nanobody共轭Alexa萤石647荧光团(1:10 0)稀释在上述透化作用和屏蔽解决方案。最后,样本洗2毫升的清洗解决方案在37°C / 60 rpm 24小时,然后孵化在安装和存储解决方案至少24小时前成像。

在整个过程中，样品被用铝箔包裹起来，以防止光线的照射。通过将切片浸入水中并随后测量水的位移来确定清除程序前后的体积变化。

在配有W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC (UV) VIS-IR 75 mm物镜的ZEISS LSM 710, Axio Examiner显微镜(Carl ZEISS Microscopy GmbH)下获得共聚焦图像。由于该物镜设计用于浸入水(RI = 1.33)或生理盐溶液中，因此在成像过程中，将固定在培养皿上的清除脑切片浸入PBS 1x中。

清除整个大脑半球

使用“Binaree组织清除试剂盒”(肖克-001,Binaree, Inc.)清除整个小鼠大脑半球[40]，根据制造商的说明。首先，将样品放入5 mL固定液中，在4°C下缓慢滚动，直到沉淀发生(约24小时)。然后将大脑半球转移到2ml的器官清除液中，在37°C/60 rpm下孵育36小时，用新鲜的器官清除液重复该步骤36小时。然后用20 mL洗涤液在4°C下洗涤12小时，在DraQ5 DNA染色液(2.5µM in PBS 1x, Invitrogen)中37°C/60 rpm孵育12小时，再用20 mL洗涤液在4°C下洗涤12小时。最后，将大脑半球置于2ml的mount and Storage Solution中，在37°C/60 rpm下孵育，直到36小时后达到高度透明。

为了保存内源性荧光，用铝箔保护样品避光。通过测量上述清除前后的水位移来评估组织体积变化。

清除后的大脑半球被强力粘在样品支架上，并放入装有蔡司Lightsheet Z.1显微镜(卡尔蔡司显微镜有限公司)成像室的安装和存储溶液中。使用EC Plan-Neofluar 5x/0.16和Clr Plan-Neofluar 20x/1.0 Corr获得图像。n= 1.45。

图像处理

获取的图像最初使用ZEN成像软件(3.1版蓝色版，卡尔蔡司显微镜有限公司)进行处理，并使用arivis Vision 4D(3.3.0版，arivis AG，慕尼黑，德国)和Imaris(9.5.1版，Bitplane AG，苏黎世，瑞士)软件工具完成3D渲染。

基于图谱的EGFP生物分布分析是通过遵循QUINT工作流程实现的，该工作流程包括在EBRAINS研究基础设施框架内开发的一套工具，用于自动量化和空间分析[41]。工作流程分为5个主要步骤。在步骤1中，126个规则间隔的大脑半球数据集最初以PNG文件格式导出并选择用于分析。在步骤2中，导出的DraQ5和EGFP数据集分别使用Nutil软件(NeSys Utilities V0.7.0，神经系统实验室，奥斯陆大学基础医学研究所，挪威)的Resize功能进行处理，以适应QuickNII和ilastik软件包的输入大小要求[42]。在步骤3中，DraQ5图像被注册到3D参考图集(Allen Mouse Brain atlas version 3 2017)。为了实现这一目标，使用QuickNII(2.2版，神经系统实验室)提供的FileBuilder程序生成XML描述符文件[43]。利用QuickNII软件进行半自动化锚定，获得与实验剖面的空间方向和比例相匹配的定制地图集。然后使用VisuAlign软件(版本0.9，神经系统实验室)对每个部分应用用户引导的非线性细化。步骤4，使用ilastik软件(版本1.3.3 post3, Anna Kreshuk的实验室，欧洲分子生物学实验室，海德堡，德国)对EGFP图像进行分割[44]。使用像素分类工作流进行分割，以区分EGFP和背景。25张图像被用来训练分类器，这些分类器随后应用于整个系列。步骤5，将各切片图像的分割配准信息上传到Nutil的Quantifier feature中，提取参考图谱中各区域EGFP表达的定量信息。使用MeshView图集查看器(Allen成年小鼠脑参考图集空间版本3，神经系统实验室，https://www.nitrc.org/projects/meshview)。

重建后用Imaris软件对10个小脑浦肯野细胞的树突进行定量分析。

统计分析

使用GraphPad Prism 6(版本6.01,GraphPad Software, San Diego, CA, USA)和R软件(版本3.6.3,R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)确定平均值、平均值标准误差(SEM)并生成所呈现的图形。

结果

为了测试我们在全脑水平和单细胞分辨率下分析raav生物分布的管道，我们在P2的面部静脉注射了1 × 10的野生型C57BL/6小鼠11rAAV9-EGFP或PBS的浓度，如实验时间(图2)所示。1)。在P55，小鼠被终末麻醉并经心灌注PBS，然后第二次灌注4% PFA。如图所示。1 b收集的脑组织在4% PFA中固定，然后在20%蔗糖/PBS 1x中浸泡冷冻保护48小时，然后在- 80°C中保存。左半球在30µm切片上进行(i)标准免疫组化染色(即用抗egfp和/或针对细胞标记物的抗体进行免疫标记)，并通过荧光显微镜和LSCM成像。(ii)将右脑半球切成1mm厚的切片，清除后用抗calb免疫标记，然后进行LSCM成像，或(iii)直接进行组织清除处理，然后进行LSFM成像。

图1:评估raav在静脉注射后在整个大脑中实现广泛生物分布的潜力的示意图。
图1

一个实验时间。新生小鼠通过面部静脉注射PBS作为阴性对照，或1 × 1011在CMV启动子的控制下，rAAV9编码EGFP。注射后53天(P55)，处死小鼠，经心灌注1倍的冷PBS，然后再灌注新鲜制备的4%冷冻PFA。B切除的脑在4°C的4% PFA中后固定，然后转移到20%蔗糖/PBS 1x溶液中。一旦大脑下沉，它们就被冷冻并储存在- 80°C。左脑半球在30µm切片上进行(i)标准免疫组化染色(即用抗egfp和/或针对细胞标记物的抗体进行免疫标记)，右脑半球要么(ii)切成1mm厚的切片，在成像前用抗calb进行清除和免疫标记，要么(iii)直接进行组织清除处理。经标准免疫组化(IHC)处理的矢状脑切片(左半球)通过荧光和LSCM显示。通过LSCM (1mm厚的脑切片)或LSFM(整个脑半球)对右半球进行成像。

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标准免疫组化分析揭示了新生小鼠静脉给药后rAAV9在小脑和海马中的优先神经转导

通过标准免疫组化初步分析rAAV9-EGFP的生物分布和趋向性(图2)。2)。正如预期的那样，在EGFP免疫标记后，注射PBS的动物没有显示EGFP荧光。经静脉注射rAAV9 - egfp的动物矢状面获得的荧光代表图像显示，在这些实验条件下，rAAV9能够穿过血脑屏障并传导几个大脑区域，包括嗅球、大脑皮层、髓质、脑桥，最值得注意的是海马和小脑，如图所示。2。

图2:静脉注射后rAAV9在整个大脑中的生物分布评估。
图2

免疫荧光代表性图像显示广泛的EGFP表达(绿色)遍及大脑的多个结构，包括小脑、髓质、脑桥、海马、大脑皮层和嗅球。比例尺表示全脑图像2mm，海马体和小脑详细视图500µm。

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鉴于rAAV9-EGFP广泛转导海马和小脑的证据，我们进一步表征了rAAV9-EGFP在这些脑区域的细胞特异性趋向性。为此，30µm脑切片同时用以下抗体进行标记:抗iba1(用于小胶质细胞)、抗gfap(用于星形胶质细胞)、抗olig2(用于少突胶质细胞)、抗neun(用于神经元)和抗calb(用于浦肯野细胞)。对于每个细胞标记，海马的荧光代表图像(图2)。3)和小脑(图2)。3 b)，以及LSCM实现的双染色的更详细的三维图像分析。海马体中不同标记物的详细图(补充图)1)和小脑(补充影片)2)，也生成了注射rAAV9-EGFP的动物。这些结果表明，新生小鼠静脉注射rAAV9-EGFP后，海马和小脑的小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞几乎没有转导。然而，NeuN和EGFP在齿状回和海马CA1-3区广泛共定位(图2)。3)。EGFP和CALB的共标记进一步揭示了EGFP信号在浦肯野细胞中的存在(图2)。3 b)。总之，这些数据证明了新生小鼠静脉给药后rAAV9-EGFP的神经元偏好性，正如先前对该血清型的描述[11，45]。注射PBS的动物切片也用相同的抗体标记，但未观察到EGFP荧光(补充图2)。1)。

图3:静脉给药后，rAAV9在海马和小脑中的细胞偏好。
图3

一个免疫荧光代表性图像显示，海马中神经元(NeuN) EGFP表达强烈，小胶质细胞(Iba1)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(Olig2)的转导不佳或缺失(见补充影片)1)。B小脑中的细胞特异性显示rAAV9对浦肯野细胞(CALB)具有优先性，而对小胶质细胞(Iba1)、星形胶质细胞(GFAP)、少突胶质细胞(Olig2)和其他成熟神经元细胞(NeuN)几乎没有转导(见补充电影)2)。箭头表示共定位区域。比例尺表示整个海马和小脑的图像为500µm，各自的3D详细视图为50µm。

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一个简单的基于水的清除程序允许在一毫米厚的样品中进行转导和免疫标记细胞的3D成像

由于基于水的清除方法显示出高生物安全性和生物相容性水平，无需专用设备[33]，我们随后评估了最近发布的一种清除该家族的方法的潜力，以概括和超越标准IHC获得的结果。“Binaree组织免疫染色清除试剂盒”通过对大量组织进行光学接触，同时对感兴趣的蛋白质进行免疫标记，可以进一步阐明rAAV9的转导效率和特异性。我们推断，将大脑切成1毫米厚的切片，通过改善直接扩散到感兴趣的区域，可以在透明度和标记方面取得更好的结果。数字4总结了rAAV9-EGFP注射动物1mm切片的清除和免疫标记方案。本实验用内源性荧光信号检测EGFP转导细胞，用抗calb抗体标记浦肯野细胞。由于抗体渗透到组织中是一个速度限制步骤，我们利用了二级纳米体，因为它们比传统的IgG抗体(150 KDa)分子量更小(15 KDa)。此外，我们选择了远红色光谱中的荧光团，以尽量减少组织自身荧光的干扰。组织转化过程中多个步骤的变化如图所示。4 b。值得注意的是，切片在固定液中沉淀24 h后出现，在组织清除液A中开始变得更加透明，这一事件伴随着组织膨胀。在标记过程中，样品变得不透明，但在安装和存储溶液中浸泡后实现了极大的透明度。最后的孵育引起轻微的组织收缩，通过测量程序开始和结束时的液体位移来确定(图2)。4摄氏度)。清除后的切片通过LSCM成像，可以同时显示免疫标记的浦肯野细胞(CALB)和转导细胞中的内源性EGFP荧光(图2)。4 d及辅助电影3.)。即使对于小区域，LSCM也是一种缓慢的扫描方法，在我们清除的部分的图像采集过程中导致光漂白事件。LSCM成像显示，清除组织表面可见免疫标记的浦肯野细胞的体突和树突;然而，在组织深处只能看到体细胞。另一方面，内源性EGFP荧光可以很容易地在组织深处检测到，从而可以可视化精细和详细的结构。

图4:用“Binaree组织清除试剂盒免疫染色”清除并标记的脑厚切片LSCM成像，以评估rAAV9在小脑中的生物分布和趋向性。
图4

一个1毫米小鼠脑切片的清除和免疫标记过程示意图。组织清除和抗体染色是通过简单的浸泡在不同的溶液中实现的。每种抗体应优化抗体浓度和潜伏期。B在手术的多个阶段中，将厚脑切片的代表性图像放置在0.5厘米的网格上。C通过测量液体位移来评估清除和免疫标记程序前后的样品体积。数据代表6个小鼠脑切片(1mm厚)，用mean±SEM表示。采用配对Student’s评价统计学显著性t以及(* *p< 0.01)。D“Binaree组织清除试剂盒用于免疫染色”有效地清除组织，并与病毒传递的荧光蛋白和抗体标记兼容。LSCM对1mm厚切片的三维成像显示，rAAV9-EGFP转导小鼠小脑浦肯野细胞的内源性EGFP荧光和CALB标记之间存在强烈的共定位(见补充影片)3.)。箭头表示共定位区域。比例尺表示500µm的小脑整体图像和50µm的详细图像。

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rAAV9在全器官水平的广泛生物分布，单细胞分辨率通过组织清除和LSFM实现

在证明了这种方法在清除厚样品的同时保留组织形态和内源性荧光的可行性后，我们将努力在整个器官水平上可视化rAAV9-EGFP的3D生物分布。按照图中总结的方案清除整个小鼠大脑半球。5使用“Binaree组织清除试剂盒”，它更适合内源性荧光和DNA染料。在不同溶液的孵育过程中监测大脑半球的外观(图2)。5 b)。和之前一样，样品在固定液中沉淀24小时。在器官清除液中浸泡三天后，样品呈明胶状粘稠度，并略有膨胀。细胞核在DraQ5溶液中浸泡染色，通过洗涤步骤去除多余的细胞核，最后将样品转移到安装和存储溶液中。通过清除前后的液体位移测量样品体积，观察到明显的收缩(图2)。5度)。高度清除的大脑半球被安装在蔡司Lightsheet Z.1显微镜的成像室中(图2)。5)，随后填充了安装和存储解决方案(RI在1.45-1.48之间)。正如先前在其他研究中提出的那样[25]，样品在成像前在成像室中保存数小时，以完美平衡最终温度和RI不匹配，同时允许气泡分散。可以用单细胞分辨率成像整个右脑半球，并观察到EGFP在几个大脑区域的表达(图2)。5 d及辅助电影4)。小脑的详细视图揭示了rAAV9-EGFP稀疏转导的浦肯野细胞的独特形态特征。在小脑的多个小叶中，可以观察到浦肯野细胞位于薄层(浦肯野细胞层)的躯体。一个或两个主要的树突从每个躯体延伸出来，形成一个独特的高度分支，平面，扇形结构，也被可视化，如文献中所描述的[46，47，48，49]。此外，对于多个浦肯野细胞，EGFP荧光显示单个长轴突离开各自的细胞体走向颗粒细胞层(图2)。5 d及辅助电影4)，这是标准免疫组化无法观察到的特征。

图5:使用“Binaree组织清除试剂盒”对全脑半球进行组织清除。
图5

一个“Binaree组织清除试剂盒”方案示意图概述。在七天的过程中，大脑半球用不同的溶液孵育，呈现出高度透明的样品，可以在蔡司光片Z.1上成像。B脑半球在清理过程中不同阶段的外观。大脑被放置在0.5厘米的网格上。C通过测量液体位移来评估清除前后的样品体积。数据代表五个大脑半球，用平均值±SEM表示。采用配对学生t检验(****)评估统计学显著性p< 0.0001)。DrAAV9在全器官水平的单细胞分辨率三维生物分布分析。“Binaree组织清除试剂盒”实现高度透明的大脑半球，同时保留内源性EGFP荧光(绿色)。细胞核用DraQ5 DNA染色(红色)染色。蔡司Lightsheet Z.1能够快速获取小鼠大脑半球(左上)以及几个大脑区域的图像，包括小脑(右上)和浦肯野细胞(下图)，具有特定的细节(见补充影片)4)。箭头1显示单个长轴突离开各自的细胞体，箭头2显示高度分枝的平面树突。小脑的比例尺为225µm(右上)，浦肯野细胞的详细视图为90µm(底部)。

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为了释放这项技术在病毒载体生物分布方面的全部潜力，我们下一步将在全脑水平上扩展数据处理和分析。为了实现这一目标，我们基于可用的3D参考图集，应用QUINT工作流对EGFP表达进行量化和空间分析[41，42，43，44]。通过DraQ5标记识别的解剖区域被用于注册大脑半球数据集的126个规则间隔平面(图2)。5 d)转换为三维参考小鼠脑图谱。利用ilastik软件的像素分类工作流程对EGFP荧光信号进行分割。最后，在Nutil软件中使用生成的地图集地图和分割图像，在参考地图集的每个区域中产生EGFP定量(补充图2)。2及补充表1)。例如，将分割的像素分组并在十个自定义的大脑区域下着色，并在在线MeshView图集查看器中显示(图2)。6)。每个自定义区域的转导面积百分比如图所示。6 b及补充表2。在这些实验条件下,rAAVs能够转换室系统(这个地区的总面积的6758%)、小脑(这个地区的总面积的3933%),嗅觉区域(这个地区的总面积的2474%),大脑皮层(这个地区的总面积的2382%),纤维束(这个地区的总面积的1353%),海马(这个地区的总面积的1158%),中脑,后脑和髓质(这些地区总面积的1084%),丘脑(占该区域总面积的1,018%)，纹状体和苍白体(占这些区域总面积的0,438%)，下丘脑(占该区域总面积的0,037%)。

图6:使用QUINT工作流在全器官水平上对EGFP荧光进行空间分析和定量。
图6

一个作为示例，在MeshView脑图谱查看器中显示了16个总图像系列中每个分割对象的坐标。点云根据小鼠大脑的定义区域着色。B利用Nutil量化器在脑半球数据集的126个平面上测量每个脑区的转导面积百分比。

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egfp阳性浦肯野细胞树突的重建及定量分析

通过定量评估重建后10个aav阳性浦肯野细胞的形态，我们进一步证明了清除整个小鼠大脑半球和随后的LSFM可视化的相关性。7一个)。根据距离躯体最短路径上分支点的数量(树突分支深度)，采用颜色梯度对树突片段进行标记。作为一个例子，图中盒装的浦肯野细胞(pc2)。7 b图中突出显示了30µm切片经过标准免疫结构处理后会丢失的树突凉亭的范围。

图7:组织清除和LSFM对浦肯野细胞树突的分析。
图7

一个通过LSFM对清除的大脑半球进行成像，可以看到表达raav衍生的EGFP的浦肯野细胞(左图)。在Imaris软件上重建具有代表性的浦肯野细胞，并以不同的视角(中间和右边的面板)显示，其中不同的颜色对应不同的树突分支深度。比例尺代表20µm。B重建的浦肯野细胞2 (pc2)矢状面(左图)和冠状面(右图)。矢状图中的框架区域阐明了30µm切片的树突分支损失程度，并通过标准IHC进行处理。如冠状图所示，浦肯野细胞在P55上呈现复杂的单面树突状突起。比例尺代表20µm。C浦肯野细胞的示意图(左边)，不同的颜色对应不同的分支深度，Sholl交叉点的数量用黑色的同心圆表示。树突分支点的数量(用字母表示)和树突终点的数量(用数字表示)如图所示。D定量分析10个重建的浦肯野细胞(pc1 - 10)的树突分支点总数(左图)、树突末端点总数(中图)和树突长度总和(右图)。数值以平均值±SEM表示。E各分支深度的枝晶段数和(F) 10个浦肯野细胞的分析。数值以平均值±SEM表示。

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树突凉台的分析是通过绘制以5µm间隔为中心的假想球体来进行的[50]。计算了每个球体内相交的枝晶段的数量。树突分支深度以及Sholl交点、分支点和端点的数量如图所示。7 c。有趣的是，枝晶分支点越多，枝晶端点的数量也越多，但枝晶长度的总和并不一定越高，如图所示。7 d。例如，pc8和pc4的树突长度总和相似，但pc8的树突乔木在深度15-40处的枝节数明显较多，枝深为51，而pc4在该深度范围内的枝节数较少，枝深为85，如图所示。7 e。Sholl交叉口的平均数量(图1)。7 f)在半径60-190微米处达到最高水平。与pc4相比，我们还观察到pc8总体上具有更多的树突片段，但较少的边缘数量和完整的分支水平(补充图2)。3)。根据起始段的直径，在每个分支点归属分支级别数。有趣的是，这里分析了一组浦肯野细胞(pc1 - 4和10)。3)显示的平均树突长度与其他使用raav和标准IHC程序标记具有相同大致年龄的动物的浦肯野细胞的研究报告相似[47]。树突面积和体积的总和也被量化(补充图2)。3)。为了阐明树突状乔木不同特性之间的依赖关系，还生成了相关图(补充图2)。3 b)。由此可见，全枝深度与树突分支点数量呈负相关关系，而树突分支点数量越多，树突节段、末端数量越多，树突长度、面积和体积总和也越大。

所采用的基于水的清除程序保留了内源性荧光

清除方法的一个重要特点是保留荧光，特别是如果图像采集完全依赖于内源性荧光信号。为了用“Binaree组织清除试剂盒”方法评估EGFP信号的保存情况，我们采用了补充图中总结的方案。4在培养细胞和大脑切片中。简单地说，在转染rAAV9-EGFP质粒后48小时，在清除或未清除的HEK293T细胞中评估EGFP信号(补充图2)。4 b)。每种情况下共获得24张共聚焦图像并定量，结果显示清除细胞的荧光保存率为71±8.2% (n= 4，补充图4摄氏度)。在60µm的脑切片上进行荧光定量观察，结果相似。在本例中，在清除方法前后的4个脑切片中，每个切片显示了6-14个小脑区域，荧光保存率为67.25±5.4%(补充图)。4 d, E)。在60µm脑切片中观察到的内源性荧光信号水平相当但略低，这可能是由于在清除过程前后对同一切片进行成像而引起的光漂白事件。

不同的清除技术在样品不透明度(因此成像深度)、组织结构和荧光的保存、免疫标记的适用性和大小变化变化方面提供了不同的结果(如表所示)1)。一种面向应用的全局清算方法方案证明了这一点(补充图2)。5)，我们发现“Binaree Tissue Clearing Kit for immuno染色”结合LSCM更适合于raav在厚组织切片中的细胞特异性表征，而“Binaree Tissue Clearing Kit”提供了通过LSFM成像在整个器官水平上研究raav生物分布的可能性。

表1不同组织清除技术综述。
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讨论

在本研究中，我们的目标是建立一个新的管道，在全脑水平的单细胞分辨率的raav的生物分布分析。作为一个例子，通过标准免疫组化和清除脑切片和全脑半球的3D成像，比较了rAAV9在小鼠脑内静脉给药后的转导效率。

如前所述[11]，在本研究中，通过标准免疫组化(IHC)检测，新生小鼠静脉注射rAAV9-EGFP后53天，小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞几乎没有转导，导致优先神经元倾向(P55)。

相对于在薄片上进行的标准免疫组化，一个潜在的改进是对更大的脑组织块进行标记和成像，从而对raav的生物分布进行更快、更可靠的分析。为此，用抗calb抗体标记1mm厚的脑切片，并用“Binaree组织免疫染色清除试剂盒”进行清除。小脑LSCM成像显示，清除切片表面有树突状叶和浦肯野细胞的免疫标记，表明抗体识别所需的表位被保留。然而，在组织的较深区域的标记强度下降被观察到，可能是由于抗体的被动扩散的限制作用。通过在较长时间内用新制备的抗体溶液进行多轮标记，增加抗体浓度，或者随着新的标记染料和能够深入组织的抗体的出现，可以潜在地绕过这个问题。或者，最近开发的方法使用外力来增强分子进入清除组织的运输[51，52]，而另一些则采用灌注技术来实现全器官和全身的标记和清除[53，54]。组织深部微弱的免疫荧光信号也伴随着一些自身荧光，即使在清除的切片上选择具有远红色发射峰的荧光团来标记calbindin。为了缩小这一问题，一些研究在其免疫染色方案中使用了甘氨酸和肝素[26，35，37，55，56]，这一策略也可以在未来的研究中使用这里描述的清除协议来实施。有趣的是，在清除的切片中可以观察到转染的浦肯野细胞的内源性EGFP荧光，这促使我们清除整个小鼠大脑半球。

我们发现，组织清除技术在保持组织形态和内源性EGFP荧光的同时，呈现出高度清除的大脑半球。在清除过程中，样品可能会变得稍微不透明并暂时肿胀，但浸泡在安装和存储溶液中会增加透明度和组织收缩。事实上，可以通过稍微改变引起样品水化的不同成分(如尿素)或引起样品脱水的山梨醇、甘油、蔗糖和果糖的浓度来调节已清除样品的收缩和膨胀[18，57，58]。在某种程度上，组织收缩可以被视为一种优势，因为成像体积和各自生成的数据更小，并且由于更大一部分组织符合薄片显微镜的最佳成像区域，可以产生高质量的图像[33，37，59]。然而，脱水驱动的收缩也可能去除维持荧光蛋白和荧光团所必需的水分子[25，60]。另一方面，组织扩展本身可以减少光散射，从而增加透明度，这是扩展显微镜使用的一个关键特征[57，61]。此外，组织扩张也可能为分子和抗体的扩散创造更多的空间。这些是测量距离时必须考虑的清理方法的常见人工制品，但通常保留结构的比例和一般解剖结构，以便在应用相同的清理方法时进行比较研究。

内源性EGFP荧光在清除的大脑半球中的生物分布更详细地概括了标准IHC的观察结果。事实上，利用开源软件，在方便的半自动化工作流程中，可以在整个器官水平上对病毒载体的生物分布进行定量分析。为了进一步证明这种清除策略的潜力，我们还评估了浦肯野细胞树突解剖特征的复杂性，表明该方法可用于定量研究特定小叶甚至整个小脑的转导浦肯野细胞，而无需物理切片。

在新生小鼠静脉注射rAAV9后，在本研究中，我们观察到小脑浦肯野细胞内广泛表达EGFP，这与先前的报道一致[11，62]。这一观察结果表明，这些载体不仅可以作为阐明浦肯野细胞体外和体内发育的有价值的工具[47，48，63]，也可用于多种疾病的研究和临床前研究，包括多种形式的共济失调、亨廷顿氏病、精神分裂症和自闭症谱系障碍，在这些疾病中浦肯野细胞受到严重影响[64，65]。此外，清除方法可以帮助进一步表征和监测疾病进展，绕过标准的免疫结构限制。

总的来说，与其他清除方法相比，该清除技术在所需时间和设备、透明度和荧光保存方面具有几个优点(如表所示)1)，当与LSFM结合使用时，它将成为一种很有前途的工具。虽然我们关注的是rAAV血清型9载体的静脉给药，但这种创新的方法可能具有巨大的应用价值，可能有助于通过多种给药途径表征其他天然和工程AAV血清型的组织倾向。此外，它可以证明其在评估使用raav向中枢神经系统递送潜在治疗基因的新策略方面的价值。