分段流发生器系列欧洲x射线晶体学自由电子激光gydF4y2Ba

x射线自由电子激光的出现(XFELs)已经明显在过去十年中先进的x射线晶体学绕过许多传统goniometer-based同步x射线结晶学的局限性。传统高分子x射线晶体学从辐照收集完整的数据集的一个大型水晶旋转在x射线曝光获得尽可能完整的一组结构因素,随后支持精制原子模型(s)的亚基组成的晶体材料。辐射诱导结构损伤gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}可以减轻,但不是消除,通过数据收集在低温条件下,使用相对较大的晶体或传播剂量超过几个水晶吗gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。蛋白质结构是成功地从渐减地确定小收益率高分辨率的蛋白质晶体结构在现代微焦点同步beamlines。然而,这通常局限于静态结构辐射损伤可能被改变或破坏gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。此外,时间分辨同步加速器大分子晶体学目前仅限于100 ps时间分辨率和几乎全部进行可逆的,light-initiated反应大的晶体。在连环飞秒结晶学与XFELs(自解压),每个衍射模式获得水晶之前被强烈XFEL脉冲,使从辐射灵敏高分辨率结构在室温下测定样品(如金属离子)gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba}与高时间分辨率、和反应中间体gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。自解压数据集包含成千上万的单一微晶核的快照收集衍射模式随机取向与单一交互femtosecond-scale XFEL脉冲gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

欧洲XFEL EuXFEL)旨在提供列车MHz的fs x射线脉冲重复率在这样的火车。火车重复10 Hz有效断开梁> 99%的时间,造成了一个巨大的样品浪费问题如果样品交付连续(即使EuXFEL满负荷运行的4.5 MHz脉冲重复率在火车在未来)。因此,大量的蛋白质需要生产和结晶结构的决心,创建一个瓶颈,数百毫克到克蛋白质需要一个完整的数据集gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

EuXFEL MHz脉冲重复率需要快速样品补充被证明是高射流速度来完成≥50 m / sgydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。合适的注射器晶体悬浮进样气动态虚拟喷嘴(GDVN)gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba或液体与双流式集中聚焦喷嘴(DFFN),也利用GDVNgydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。GDVN可以产生高速度之间的样本喷气飞机能够补充MHz EuXFEL脉冲gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba},DFFN取得足够的喷射速度在实验室测试gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。样品交付与粘性媒体喷油器gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba如油脂的立方相注入器gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba或固定目标的方法gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}不能跟上MHz EuXFEL尽管他们优势的重复率减少样品浪费。类似问题出现的微流体动电的样品持有人(网)gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba和它的升级版,同心网喷射器(coMESH)gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

滴注的方法有可能克服限制由于样品浪费gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba,但为了兼容MHz的重复率EuXFEL他们必须实现快速补充需求。此外,任何方法减少样品的浪费,也应该与时间分辨兼容(TR)晶体学建设的终极目标分子的电影gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。设置为TR-SFX用光催化反应可以很容易地适应使用滴注入。然而,生物分子与配体反应或基板需要与反应物混合晶体在溶液中注入之前XFEL的路径。声滴喷射器(面)演示了交付drops-on-demand SFX达到高的分数gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}通常与传送带传输水滴到x射线束。然而,当前实现正面的不兼容EuXFEL MHz间距短脉冲,因为他们已经证明在数量级低频率可用XFELs日期gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。此外,这种方法仅限于photoinitiated TR-SFX研究和反应涉及气相基质送到水媒体在毫秒时间尺度或以上,不含大量类es反应。后者限制然而克服了时间分辨的液体应用方法分析最近证明了Mehrabi et al。gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba,大火pL水滴水晶允许生物相关时间尺度要实现时间分辨的研究。压电微滴喷油器gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba相比之下,遭受大量液滴增加背景散射和不兼容MHz EuXFEL所需的重复率。gydF4y2Ba

在这里,我们介绍一个方法来减少浪费在EuXFEL SFX实验样本。它是基于sub-nL晶体悬浮液滴的生成嵌入在一个非混相石油,允许与传统GDVN注入。这种液体注入方法是基于创建高速战机在连续模式注入适合MHz结晶学,将兼容现有mix-and-inject方法gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。我们将演示滴代3-deoxy-D -gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba-octulosonate 8-phosphate合成酶(KDO8PS)水晶悬浮液与微流控液滴发生器和表明,液滴生成频率可以控制流量的水和石油流。晶体的衍射质量KDO8PS类似油滴包围在注入水或通过GDVN连续注入,与滴~样品消耗减少60%实现注入。确定结构揭示了新的细节之前定义循环KDO8PS地区,一个潜在的抗生素研究的目标。这些结果从调试EuXFEL倡导未来常规集成液滴生成的分段在世界其他XFELs油流。这包括的光源(拼箱)SLAC国家加速器实验室从30 - 120赫兹(线性)操作gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba和其他XFELs Spring-8埃紧凑等自由电子激光(SACLA)脉冲在30 - 60赫兹gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba,浦项市加速器实验室XFEL (PAL-XFEL) 60赫兹gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba和SwissFEL高达100赫兹gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。所有这些工具浪费大多数样本期间连续液体喷射gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba这里介绍的方法可以显著降低。gydF4y2Ba

在EuXFEL液滴发生器设置gydF4y2Ba

我们提出一个液滴发生器提供sub-nL大小的水滴水晶水悬浊液连续油相交叉的实验EuXFEL,图中所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。分区的原则由水晶悬挂在通过一个非混相油相液滴分段。这个概念图中描述。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,产生的液滴在微流控液滴发生器的毛细管示意图中他们飞往与EuXFEL x射线脉冲。集成这一原则在一个典型的自解压液体喷射设置使用GDVN交付样品在一个真空室,我们采用3 d印刷微流控液滴发生器,如前所述gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。这里,我们适应这种方法对工作流兼容早期的用户实验EuXFEL图中所描绘的一样。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,它允许XFELs大分子结构研究在室温下真空室。正压应用开车从液相色谱泵以恒定流量的水射流水库。高效液相色谱泵、流量传感器远程访问,允许实时调整为油相流量条件和晶体悬浮实验。包含水晶悬挂的水库是安装在一个防沉装置防止晶体沉淀和维持在4°C减少晶体退化gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。聚四氟乙烯活塞在水库流离失所的样本或油,和流速与流量监测传感器安装后不久水库。水晶悬挂离开样本水库的液滴发生器入口流入水相流速,gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba,从3到20µL分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。离开各自的石油储层进入连续相液滴发生器的入口(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba),石油流速,gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{石油gydF4y2Ba},从5到40µL分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。因此,总流率,gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{合计gydF4y2Ba},从8 - 50µL最小值不同gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},不同的流量比例组合gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{石油gydF4y2Ba}来gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba用于液滴的一代。水滴退出通过出口和相关的毛细管液滴发生器。补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了一个包含晶体生成液滴的代表形象gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba= 4.5µL敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{石油gydF4y2Ba}= 12µL敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}成像后的毛细管液滴发生器。毛细管是连接到GDVN零死体积结,保证液滴转移到液体的毛细管GDVN喷嘴外杆(见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。根据流量条件下,液滴体积范围从70 ~ 800年pL在这项研究。gydF4y2Ba

毛细管离开液滴发生器连接到另一个毛细管穿过位于约30厘米的液滴探测器从液滴发生器下游。液滴探测器对这个实验至关重要,因为这允许液滴生成频率的实时反馈。交付的光电探测器可伸缩滴频率的电压信号,允许记录示波器。图gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba显示了液滴检测器的功能原理,利用石油和水传播差异的解决方案在激发1550海里。水滴不断观察与液滴检测器如无花果所示。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba。相同的毛细管直接担任GDVN的入口毛细管x射线束注入分段流。毛细管长度液滴发生器~ 2米后适应滴探测器安装在真空室的顶部附近,喷嘴的全长棒插入GDVN SPB所需/ SFX真空室(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。在总流速大于8µL mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},我们观察到一个稳定喷射的射流直径约5µm(见补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。我们进一步注意到水液滴量总是足以形成一个连续的液体喷射元素,足以跨越的时间~ 30µs长脉冲序列(32脉冲重复在每列火车1.1 MHz)。样品被真空室和x射线衍射数据收集与AGIPD探测器gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba(有关详细信息,请参阅“方法”部分)。此外,我们强调创建的飞机穿过玻璃GDVN分段流和连续注入样品足够快了1.1 MHz脉冲频率在一个火车。补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba显示索引的数量为每个脉冲模式ID,表明索引率是独立于脉冲的数量在一个火车,这是一个强烈的迹象飞机足够快脉冲之间的补充样本和按照结构报告MHz重复脉冲通过Yefanov et al。gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

液滴生成频率gydF4y2Ba

液滴发生器实验前测试使用氟化油为连续相(10:1 PFD:卵圆孔未闭)和KDO8PS母液作为分散相的实现液滴生成频率。许多因素可能影响液滴生成,包括通道尺寸,液体流量和速度、液体粘度和界面张力之间的两个水火不相容的。一个全面的方程,考虑上述物理参数描述液滴生成频率,gydF4y2Ba\ (\ {\ mathrm {f}} _ {\ mathrm {d}} \)gydF4y2Ba,是由张等。gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BavgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba是分散的速度(水)阶段,gydF4y2BavgydF4y2Ba_{合计gydF4y2Ba}是总速度,Ca是毛细管数,gydF4y2BaWgydF4y2Ba是连续相通道的宽度,gydF4y2BaKgydF4y2Ba是一个因子特征的系统,通常通过拟合实验数据gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。毛细管数描述粘性剪切和界面之间的关系,并等于产品的粘度(gydF4y2BaηgydF4y2Ba= 13.3 mPa和连续相的速度除以界面张力(σ= 12 mN / m)两个水火不相容的。注意,唯一的变量在Ca是连续相速度。gydF4y2Ba

两个连续的速度和分散阶段变化通过改变他们的流率,同时保持通道几何、流体粘度、界面张力恒定,总速度,gydF4y2BavgydF4y2Ba_{合计gydF4y2Ba},10至20 mm / s。见图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,获得液滴频率跟随情商中描述的关系。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)的协议。的流速测试Ca是10gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}既密切对应瞬态滴一代政权之间滴和挤压据徐et al。gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba和克里斯托弗et al。gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba,情商的关系。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)持有gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。最适合的实验数据获得gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 3.7±0.2 m / s,这是接近因子1.0所描述的张等人以水为水相gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。我们在几何属性的差异变化的丁字路口,Kumar Gupta和报道gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba和Wehking et al。gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。影响液滴生成频率,以及这一事实Zhang et al。gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。用纯水产生水滴。我们进一步注意到目标10 Hz液滴生成频率匹配EuXFEL脉冲序列的频率是可以实现的gydF4y2Ba\ ({\ mathrm {Ca}} ^{4/3} \ * \压裂{{v_ {\ mathrm {d}}}} {{v_ {{\ mathrm{合计}}}}}\)gydF4y2Ba= 3×10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}。此外,水滴可以调到其它当前XFEL工具的重复率,补充图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba根据情商。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

流速、水晶打分数,和衍射质量相关性gydF4y2Ba

光束期间实验中,我们调查的影响水和油流速的水晶打分数,这里定义每x射线晶体衍射模式的平均数量的脉搏。在这些实验中,液滴生成不同步EuXFEL脉冲火车、x射线是大于液体喷射直径(见图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba底部)。如果我们假设液体喷射的平推流模型,我们预计打分数gydF4y2BaNgydF4y2Ba追随的关系:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba\ (r_ {\ mathrm {j}} ^ 2 \)gydF4y2Ba对应于射流半径,gydF4y2BaDgydF4y2Ba_bgydF4y2Ba是XFEL光束直径,gydF4y2BangydF4y2Ba是晶体的数量密度,gydF4y2Ba\ (p_ {{\ mathrm {aq}}} = \压裂{{{\ mathrm {Q}} _ {{\ mathrm {aq}}}}} {{Q_ {{\ mathrm{合计}}}}}\)gydF4y2Ba。飞机半径成正比gydF4y2Ba\ \√{Q_ {{\ mathrm{合计}}}}\)gydF4y2Ba因为飞机的速度几乎是固定的鞘气体压降gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。因此,我们期望的关系gydF4y2Ba\ (N = \πD_ {\ mathrm {b}} nQ_ {{\ mathrm {aq}}} \)gydF4y2Ba,打击一部分水流速成正比给定XFEL光束直径。这个配方可能被修改成包括晶粒大小(假定为小于XFEL梁)通过增加有效XFEL光束直径,因为更大的晶体将产生可观测的布拉格峰在梁中心更大的距离。gydF4y2Ba

在无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,总结了几个流量条件强调这种行为与石油流量固定gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{石油gydF4y2Ba}= 15µL敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}而gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba是多种多样的。是增加的数量gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba增加,这表明更多的水晶悬挂在分段喷气机,从而达到增加分数正如上面所讨论的。我们的观察从而符合预期依赖水和油流速与EuXFEL不同步时实现。gydF4y2Ba

KDO8PS衍射数据质量进一步晶体悬浮在水滴的分段相比具有相同样品悬浮在一个连续射流(无油)。一个子集的数据来自13个连续注入和67运行液滴喷射被选为分析从相同的结晶获得批(1 = 2分钟)。水晶被停职的消息不断注入10μL /分钟的流量26分钟(13)运行,生成一个注入体积的260μL,导致577水晶。这不断注入样本相比,分段流动注射相同的示例批处理在同一时间(13分的比较)。在分割的情况下,液滴在不同流量条件下,生成不同的从3µL分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}5µL敏gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}为gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba总结,总量110μL水晶悬挂注入了13分。平均gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_aqgydF4y2Ba在这段时间是4.2µL分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}735年,导致晶体。在连续晶体悬浮注入,2.2μLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}收集在6.6袭击μLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在分段收集流动注射(参见表吗gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

尽管观察冲击分数与以前相比是小SFX实验在拼箱gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba},类似于其他SFX实验中观察到早期用户梁次EuXFELgydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}。这个打分数下降引起的光束直径大~ 20µm(相比2µm在拼箱和1µm SACLA)结合低脉冲能量的0.25 mJ(相比更高的脉冲能量4乔丹在拼箱)。为了测量高分辨率数据,需要更大的晶体,这些实验与其他XFELs相比。这些较大的晶体更容易堵塞,从而可以使用更少的晶体密度。最重要的是,相比之下,不断注入样品在其它条件相同的情况下,晶体的数量达到三倍和样品/样本体积增加消费减少分段流动注射~ 60%。与此同时,这两种情况下的衍射质量可比对平均分辨率,分辨率最高,平均每个模式的峰数支安打,峰值/索引模式的平均数量,列在表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

总的来说,KDO8PS水晶悬挂使用分段注射流总共134分钟总结整个梁,在数据收集是可能的。在这个时候,晶体悬浮流率介于3和12之间µL分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}注射总量962µL悬挂。平均6.0µLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}获得的样本平均4解决。这清楚地表明,油相液滴生成过程不影响晶体质量和结构并不影响数据质量的决心。为了进一步证实这一发现,我们进行了漫散射分析结合径向配置文件注入条件对应于co-flow水水晶悬挂并行和石油,以及分段滴注入(补充图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。从这个比较中,可以观察到一个油环盛行的漫散射co-flowing在几乎所有的图像,而对于液滴喷射,只有很少的选择图片显示这个散射油环。我们可以因此得出结论,大多数晶体被注入水相,而不是“混合”石油蛞蝓。少数石油表观漫散射分析的实例可以归因于撞击液滴的开始或结束,水和油相都是礼物。石油散射的稀疏滴注入进一步展示了样品的精确相位重叠液滴与x射线脉冲序列。一个代表性的衍射模式KDO8PS补充图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

自解压KDO8PS结构gydF4y2Ba

KDO8PS的自解压结构解决了基于所有收集的数据,通过内联滴液滴形成确认探测器。晶胞常数分布的均值(补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)计算a = b = c = 118.4和α=β=γ= 90°,cell_explorer CrystFEL包的一部分gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。37000模式分为支安打,16777可以索引和15777模式包含在最终的合并反射(1000模式被partialator拒绝在合并)和用于结构的决心。发现衍射峰达到2.8的一项决议(见补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。概述数据收集和处理参数和统计提出了补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。进一步的细节确认所有分段流数据的子集(134分钟)补充表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

据报道gydF4y2Ba^{56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba}KDO8PS结构的细化是特别困难由于固有的非均质性安排的单体KDO8PS四聚物,和三倍四聚物的对称中心轴相交。这是观察到这里给出的数据,提炼到最后R结构gydF4y2Ba_{工作gydF4y2Ba}/ RgydF4y2Ba_{免费的gydF4y2Ba}18.6/24.9在我们的高度约束的改进协议。这些价值也在良好的协议与以前发表的结构虚荣等。gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba也解决了通过应用分子置换,但在低温下同步加速器辐射来源。此外,报告的结构由Radaev et al。gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba和虚荣等。gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba有缺失,非结构化循环区域(残留aa - 206 aa - 217),这被认为是蛋白质的活性部位的一部分。在这里给出的结构,残渣半胱氨酸- 206显示清晰的电子密度,因此包含在模型(无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)。进一步偏离之前出版模式,虚荣等。gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba循环地区被发现从残留246年至251年,这是修改后的1 x8f搜索模型按照清晰的电子密度(图中出现的偏差。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。这个循环是完全省略了Radaev发布的结构等。gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba,这表明它是一个高度灵活的循环。KDO8PS是一个灵活的蛋白质,由这一事实表示了严重的构象变化在配体结合gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。我们结构代表了朊蛋白结构在室温下,wheras出版结构测定在低温条件下,在cryo-protectant补充道gydF4y2Ba^{58gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba}。,附加的cryo-protectant以及冷冻过程可以引起构象变化或选择一个子集的构象在室温下。例子室温XFEL和低温结晶学结构的变化也被观察到的5 -羟色胺受体gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

我们提出了一个有效的方法来缓解固有的样品浪费在脉冲连续流动进样SFX XFEL来源,挑战加剧了独特的脉冲EuXFEL结构。我们证明了一个3 d印刷微流控液滴发生器可以集成到工作流SPB /自解压的一个自解压实验仪器EuXFEL和已经成功滴含蛋白质晶体注入MHz重复率x射线束。从GDVN连续注射相比,分段流动注射导致更高的每卷水晶连接次数,同时保持相同的自解压数据的质量。gydF4y2Ba

KDO8PS决心的室温结构微晶核交付与分段流发生器。电子密度显示不同的细节相比之前报道KDO8PS结构在低温下决定gydF4y2Ba^{56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba},如半胱氨酸- 206和不同循环构象残留的范围246 - 251(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。尽管分辨率略低的室温结构,事实上,这些差异出现在这样一个灵活的结构是一个指标的数据质量很好。在未来,我们还计划时间分辨SFX KDO8PS调查研究,如果在这里观察到结构变化与功能的参与酶的催化机制。在这篇文章中列出的结果分段流描绘了一幅广阔的前景样品交付减少样品浪费问题独特的脉冲EuXFEL的结构。与液滴与x射线脉冲的频率和相位同步,我们期望进一步减少样品的体积消耗(可能降至1%,连续注射EuXFEL),允许勘探的新不结晶的晶体样品容易在大量和实现结构决心MHz XFELs秩序的分钟gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}。努力使液滴在3 d印刷液滴发生器通过电触发目前正在探索gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}。此外,液滴生成频率可调,具有很大的前景分割流样品交付稀缺,hard-to-crystallize样本和更有效的数据收集研究在其他当前和未来的XFELs大分子动力学。提出了分段流方法也兼容mix-and-inject时间分辨连环结晶学,如通过Ishigami et al。gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}女士,有可能达到,时间分辨率与ultracompact Knoska等人最近证明了3 d微流体gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

化学品和材料gydF4y2Ba

IP-S光刻胶从Nanoscribe购买GmbH(德国);从Microchem SU-8开发人员,(美国);Novec 1720,从3 M(美国);异丙醇,从VWR分析(美国);环氧树脂(# 04001)Hardman Inc .(美国);从Sigma-Aldrich perfluorodecalin (PFD),(美国);1 h, h, 2 h, 2 h-perfluorooctanol(卵圆孔未闭),从阿尔法蛇丘有限公司(美国);KDO8PS基因,从GenScript Inc .(美国);gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba新英格兰,从生物学实验室(美国);σ快速平板电脑,β-mercaptoethanol,三、盐酸乙二胺四乙酸(EDTA)、硫酸鱼精蛋白,氯化钾,蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,从Sigma-Aldrich(美国);和聚(乙二醇)5000甲基醚(PEG5000 MME),从汉普顿(美国)的研究。熔融石英毛细管从莫仕公司(美国);管和毛细管联盟连接器,从国际防务展卫生和科学LLC(美国);PicoClear工会,新目标,Inc .(美国);PEEK油管,从宙斯(美国);从3 M双面胶带,(美国);从Centricon和10 kDa截止过滤器,微孔(美国)。gydF4y2Ba

样品制备gydF4y2Ba

野生型KDO8PS基因(加入基因库NC_000913)购买从GenScript pET-23d合成基因的质粒。完整的和带注释的矢量地图,质粒DNA和蛋白质序列中详细补充无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。这个质粒后来变成LEMO21 (DE3)主管gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞和表示根据参考文献中描述的协议。gydF4y2Ba^{58gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba}如下。蛋白质是在Lemo21 (DE3)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞的T7启动子的控制下。磅媒体含有氨苄青霉素,氯霉素接种文化和大力动摇了37°C,直到达成了A600 = 0.6 - -0.8,然后0.2毫米isopropyl-1-thio-ß-D-galactopyranoside是补充道。4 h孵化后37°C细胞被离心收获在4°C 8000 rcf 10分钟,然后冻结在−80°C。冻丸re-suspended在缓冲区包含20毫米三pH值7.3,300毫米氯化钾,1 SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(EDTA-free)(σ),和10毫克/ 1 g细胞颗粒冻干的溶菌酶。暂停后,细胞被孵化的裂解缓冲30分钟在室温下对冰的孵化20分钟紧随其后。细胞被破碎的使用与microtip 50%功率超声发生器,10 6脉冲周期共计1分钟30年代孵化在冰之间循环。细胞被离心机24000×gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟。硫酸鱼精蛋白沉淀然后执行上层清液。这一步硫酸鱼精蛋白2.2%,20毫米三pH值5,300毫米氯化钾,和1 SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(EDTA-free)解决方案添加到实现最终浓度为0.26%。在冰上的降水进行了15分钟,然后解决方案是离心机在48000×30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。当时上层清液透析对5毫米磷酸钾pH值7.3,75毫米氯化钾。一个缓冲交换4 h后进行。透析的酶制剂是离心机7000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 10分钟去除沉淀蛋白质。gydF4y2Ba

离心后,上清液过滤使用0.22μm注射器过滤器。整除被注入一个阴离子交换柱(900毫米×16毫米,DEAE-sepharose)平衡和20毫米Tris-HCl pH = 7.3, 75毫米氯化钾,β-mercaptoethanol 2毫米。盐浓度的增加到125毫米氯化钾是洗提KDO8PS分数。纯度是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和硫代巴比土酸试验是用来证实KDO8PS功能活动。此外,由MALDI-TOF / TOF质谱分析和动态光散射(DLS)是用来证实KDO8PS的身份和结晶之前样品的单分散性的特点。纯粹的分数KDO8PS汇集和集中10 kDa截止离心过滤到的吸光度值gydF4y2Ba_{205年gydF4y2Ba}= 0.645。浓缩液冷冻和储存在−80°C到结晶。KDO8PS微晶核成长使用搅拌批处理方法gydF4y2Ba^{65年gydF4y2Ba}KDO8PS的最终浓度调整到8.75 -12毫克/毫升毫升Tris-HCl缓冲区包含20毫米,pH值7.4 150毫米氯化钾。结晶是由一滴一滴地诱导的16 - 20% w / v PEG5000居里夫人50%股票的解决方案在水里。样品交付的最终的晶体生长在多个批次的600年1.5毫升µL每个血管反应在室温(25˚C)。优化的实验条件下,300µL PEGMME 5000年的20%(从50%股票的解决方案在水)下降到300µL KDO8PS解决方案在21个毫克/毫升,而激动人心的一个小薄搅拌棒(0.5毫米×5毫米)。使用1000µL吸管滴添加时间约为2分钟。结晶的解决方案是在室温下培养没有搅拌1.5 h。晶体解决在这段时间。他们resuspended上层清液的结晶实验样品交付之前直接在颗粒体积比1到10的上层清液导致晶体的密度大约5×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba晶体/ mL估计通过计算晶体细胞计数室。水晶立体显微镜下批次监控和检查和动态光散射的特征来选择所需的大小和最均匀的晶体尺寸均匀性。水晶批次用于实验由统一晶体8和10µm之间的尺寸范围。报告的数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、水晶悬挂从相同的结晶条件是用于连续流动注射,以及一部分注入26分的比较。gydF4y2Ba

液滴发生器制造gydF4y2Ba

连续油相制备混合PFD和卵圆孔未闭的比例10:1 v / v。液滴发生器设备是双光子聚合(2页)制造的,3 d印刷gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。简单,模型设计在AutoCAD(美国欧特克)和3 d印刷使用IP-S光刻胶和光子专业GT 3 d打印机(德国Nanoscribe GmbH)。印刷术在固体完成模式使用蘸激光光刻2页。一旦出版,设备开发SU-8开发者和异丙醇冲洗。每个设备然后用胶带固定在载玻片,熔融石英毛细管与抛光结束插入并粘到设备入口和出口与环氧树脂。最后,设备、GDVN和毛细血管表面处理充满Novec 1720,设备被放置在烤箱150°C一夜之间以去除多余的溶剂gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。熔融石英毛细管外径(OD)是360年µm和内径(ID)不同(50,75,或者100µm)。定义的丁字路口是十字路口100µm×75µm×650µm矩形通道和一个50µm直径圆柱形通道(见图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

射流装置gydF4y2Ba

使用高效液相色谱泵正压应用(LC-20AD从日本岛津公司有限公司,日本)启动和控制流体流动。每一个高效液相色谱泵送水定制或商业储层包含一个活塞水晶悬挂或油相分发gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba。压力调整提供预期的流速、压力从800 psi ~ 200 psi,根据射流油管使用的确切长度,水晶样品注射和其他因素影响的压力和流速。XFEL实验,晶体悬浮水库是安装在一个旋转的防沉装置和温度控制在4°CgydF4y2Ba^59gydF4y2Ba。PEEK油管和射流连接是用于连接组件上游的液滴发生器装置,而石英毛细管和PicoClear工会被用来连接下游玻璃GDVN液滴发生器。GDVNs被Gisriel等类似。gydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba}。的距离液滴发生器的小费GDVN约为2.5米。液体流动米sli - 0430和slg - 0075(瑞士Sensirion)被用来监测水库后的流速(见图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba对于一个整个射流装置和辅助图的示意图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba更多细节)。gydF4y2Ba

使用这个设置,液滴生成丁字路口。液滴体积是大到足以覆盖整个持续时间的脉冲序列(~ 30µs)如下指定节XFEL仪器设置和无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。滴卷在~ 70 - 800 pL的范围取决于液滴频率定义的流量的水和油阶段。因此,使用总流速介于8和µL 45分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},滴在飞机大约100 - 500µs,远高于脉冲序列的持续时间。此外,流量条件改变时,允许大约10分钟的平衡稳定系统中的压力,因此液滴频率。流量稳定是另外通过流量传感器监测。gydF4y2Ba

液滴检测gydF4y2Ba

所有组件都从Thorlabs购买,美国,除非另有规定。简单地说,一个1550海里5 mW激光束(L1550P5DFB激光二极管和LTC56B控制器工具包)传播在熔融石英毛细管连接丁字路口GDVN液滴发生器,和透射光放大的光电探测器检测(PDA20CS)。准直透镜(C230TMD-C)运动学山(KC1-T),熔融石英毛细管自定义构建持有人和200μm针孔对准激光二极管和探测器之间使用x - y翻译(SCPO5T) 30 mm笼系统内。信号(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)在一个示波器显示和记录(TDS 2024,美国泰克)。液滴实验之外的一个XFEL设施与brightfield另外监控光学显微镜(美国奥林巴斯IX71)和Photron高速摄影机(FASTCAM SA4,日本)。美国加州大学旧金山分校事必躬亲(版本1.4.22)和ImageJ(美国国家卫生研究院版本1.48 v)软件是用于图像采集、处理和分析,起源(美国OriginLab Corp .)是用于生成的情节。gydF4y2Ba

XFEL仪表设置gydF4y2Ba

实验在EuXFEL (Schenefeld、德国)上游的交互区域SPB /自解压工具gydF4y2Ba^{67年gydF4y2Ba}在beamtime P2042。的脉冲结构XFEL由10赫兹的火车,与32脉冲/火车,见图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。火车的重复率是1.1 MHz或889纳秒脉冲之间。脉冲持续时间≤100 fsgydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}9.31 keV的光子能量。与复合折射透镜光束集中一束15×20µm的大小gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。脉冲能量平均是280µJ。衍射数据收集使用AGIPD 1 Mpx探测器gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba在探测器的距离173.5毫米gydF4y2Ba^{69年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba}。数据收集,衍射数据并不是用于前两脉冲在火车上,因为这些校准脉冲。数据记录开始连续脉冲每秒3和脉冲被使用,这样15衍射模式为每个脉冲序列被记录下来。GDVN是附加到喷嘴的杆(~ 1米长)是通过一个气闸系统插入到10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}mbar真空室。氦气的压力150 psi是用来操作GDVN和GP1中电子控制的压力调节器(美国Equilibar)。gydF4y2Ba

漫散射分析gydF4y2Ba

为了调查是否受x射线脉冲水晶液滴喷射的方法在水或油阶段,我们进行了一个基本的漫散射背景分析为单个运行。AGIPD探测器的两个核心板(面板3 & 4根据CrystFEL惯例)被选为这个分析。(背景修正)的整个运行发现的猎豹,每个小组的像素值每达到预期水平,导致一个们漫散射概要文件。执行这个分析为2分钟滴注入,以及一个运行2分钟,石油和水晶悬挂co-flowing(补充图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

数据处理gydF4y2Ba

KDO8PS衍射模式收集使用猎豹被确认和校准gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba}。hit-finding,最少2连接数超过阈值的像素500 ADU的最小信噪比8被认为是一种巅峰,和一个图像包含至少10这样的山峰被归类为打击。从37000年~ 4100000年图片收集,被归类为,对应于平均命中率为0.9%。gydF4y2Ba

大约46%的确定冲击可以被索引和布喇格反射综合使用软件包CrystFEL(0.8.0版)gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba基于峰值位置发现的猎豹。索引顺序是由CrystFEL indexamajig XGANDALFgydF4y2Ba^{72年gydF4y2Ba},DirAxgydF4y2Ba^{73年gydF4y2Ba},MOSFLMgydF4y2Ba^{74年gydF4y2Ba}和XDSgydF4y2Ba^{75年gydF4y2Ba}需要立方体心晶格的晶胞参数a = b = c = 118和α=β=γ= 90°(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。indexamajig集成半径设置为2,3、4像素和索引的解决方案被检查,确保他们占至少50%的观察到山峰(选择“check-peaks”)。gydF4y2Ba

索引模式与ambigator进一步处理gydF4y2Ba^{76年gydF4y2Ba}解决固有的索引模棱两可立方空间群I23连续收集数据。相关系数的数量/水晶仅限于1000的速度,以及10通过歧义消解了所有晶体。这导致8315索引任务发生了变化,相应的大约50%的数据。索引使用partialator反射随后被扩展和合并gydF4y2Ba^{77年gydF4y2Ba},应用统一模型(没有偏袒建模)/ 3迭代。强度被转换为结构因子模使用截断(CCP4套件gydF4y2Ba^{78年gydF4y2Ba}),0.1的一小部分反射被包括在生成的RgydF4y2Ba_{免费的gydF4y2Ba}集。实现的L-test截断被用来确定成功de-twinning数据(补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结构方案和细化gydF4y2Ba

逐步与移相器使用分子替代执行gydF4y2Ba^{79年gydF4y2Ba}CCP4i项目的套件gydF4y2Ba^{78年gydF4y2Ba}使用1 x8f PDB代码gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba搜索模型。获得的模型提炼使用与REFMAC交替周期的自动优化gydF4y2Ba^{80年gydF4y2Ba}与傻瓜和手动执行检验gydF4y2Ba^{81年gydF4y2Ba}。最后使用web服务器PDB-REDO精制结构评估gydF4y2Ba^{82年gydF4y2Ba},这表明,RgydF4y2Ba_{免费的gydF4y2Ba}值是有偏见的。RgydF4y2Ba_{免费的gydF4y2Ba}价值报告结果是公正的gydF4y2Ba_{免费的gydF4y2Ba}价值,PDB-REDO所定义的gydF4y2Ba^{83年gydF4y2Ba}。蛋白质结构的所有数据提出了手稿在PYMOL生成gydF4y2Ba^{84年gydF4y2Ba}。最后精制结构验证使用wwwPDB验证服务和提交蛋白质数据银行沉积6 u57 PDB ID。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步的实验设计中可用的信息gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与本文有关。gydF4y2Ba