NGF-TrkA信号指示神经向内成长和异常软组织创伤后骨软骨分化gydF4y2Ba

软组织创伤如肌肉骨骼多发性损伤、中枢神经系统创伤,或广泛烧伤损伤引起的病理形成软骨和骨外骨架,被称为异位骨化(HO)gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。伤害HO可以视为一种组织修复过程失败,主要是当地的间叶细胞祖细胞异常分化,通过软骨内或膜内的不当形成骨骨化gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。在更严重的症状,何能引起慢性疼痛,影响伤口愈合,增加医疗服务利用率,导致残疾,降低生活质量gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。治疗方案为主要或复发HO是稀疏的gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba和医学治疗HO本质上是有限的非甾体抗炎药和低剂量的辐射gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。痛苦之前HO在零星的形式gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba},甚至罕见的遗传形式gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba},这通常是成比例的临床检查。鉴于这些临床观察,我们假设感觉神经支配发挥pathoetiogenic作用的伤害。gydF4y2Ba

中央中介骨痛的神经生长因子(神经生长因子),它传递疼痛的信号直接通过激活原肌球蛋白受体激酶(TrkA)表达疼痛的纤维或通过间接机制,加强其他疼痛的反应途径gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。激活后,NGF-receptor复合物内化的内吞作用,形成专门的信号经过长途的囊泡,从远端轴突逆行运输到胞体通过信号内体gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。发展中或受伤的老鼠骨骼,TrkA-expressing感觉神经元侵入长骨软骨膜及骨膜神经生长因子表达的网站,在那里他们需要后续的扩张和骨祖细胞的分化伴随着血管组装gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。在较低的脊椎动物,一个类似的范例外围神经支配似乎在组织再生操作。例如,某些海星和两栖动物的肢体再生,治疗鱼鳞和杠铃都取决于神经输入gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。最近的研究表明,老鼠数字提示再生可能同样代表了外围nerve-dependent事件gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}。几个临床前研究骨形成蛋白2 (BMP2)全身HO影响周围神经细胞作为一个潜在的因素形成gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。然而,一个基本的了解周围神经支配调节异常的间充质干细胞命运决定创伤后缺乏。gydF4y2Ba

在这里,我们试图定义的监管作用的神经输入以前伤害HO特征模型的异常细胞的命运gydF4y2Ba^{34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。在疾病进展,神经生长因子表达在一些细胞类型,特别是血管平滑肌细胞(smc)和周,推动进步的感觉和交感神经轴突何氏网站的入侵。去神经外科阻碍轴突长在肉内,废除软骨内骨形成在软组织受伤。类似地,两个转基因动物模型打断NGF-TrkA信号抑制osteocartilaginous进化分化和削弱。的临床相关的小分子抑制剂TrkA同样废除这个异常的细胞分化命运减轻HO的形成。来解释这些观察,单细胞测序(scSeq)建议从转变增长factor-β(TGFβ)纤维母细胞生长因子(FGF) pre-chondrogenic细胞之间的信号激活后损失的神经输入。最后,分析人类的病理标本和数据库确认NGF-TrkA信号在人类疾病的相关性。总之,NGF-responsive, TrkA-expressing周边积极调节神经元伤害。这些发现表明,NGF-TrkA信号抑制双重治疗软组织创伤中使用,作为止痛剂和负异常干细胞分化的监管机构。gydF4y2Ba

轴突入侵伴随着异常的细胞命运在创伤后gydF4y2Ba

temporospatial模式的周围神经异位骨形成过程中第一次检查是在之前验证伤害引起的小鼠模型gydF4y2Ba^{34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。这里,阿基里斯腱,加上背烧损伤引起系统性炎症导致病理定义的网站腱在软骨内骨化9周。矢状横截面的小鼠后肢检查,关注远端站点腱(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。之前报道,一个阶段的疾病过程就会受伤后,概括人类疾病,包括fibroproliferative阶段(1周)(图。gydF4y2Ba1 b, cgydF4y2Ba),软骨阶段(3周)(图gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba),骨的阶段(9周)(图gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

神经纤维在何氏网站第一次检查,使用第三pan-neuronal标记β微管蛋白(TUBB3)远端站点腱的矢状部分(无花果。gydF4y2Ba1 h-kgydF4y2Ba)。不显眼的TUBB3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维主要被发现在peritenon受伤的跟腱(无花果。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba)。在TUBB3逐渐增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba观察神经纤维入侵的远端站点腱1,3,9周后损伤(无花果。gydF4y2Ba1 i (kgydF4y2Ba)。量化的TUBB3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维密度证实了这些调查结果,证明平均315%,1128%,和1650%增加神经密度/基线在1、3和9周(图。gydF4y2Ba1 lgydF4y2Ba)。神经纤维类型下的特征使用免疫组织化学检测的感觉神经标记降钙素相关基因肽(CGRP怎样)或交感标记酪氨酸羟化酶(TH)(图。gydF4y2Ba1先生gydF4y2Ba)。不显眼的CGRP怎样gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维出现在peritenon基线(图。gydF4y2Ba1米gydF4y2Ba),在郊区的明显增加受伤的跟腱在研究端点(图。gydF4y2Ba1 ngydF4y2Ba)。这反映出CGRP怎样增加569%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经密度(图。gydF4y2Ba1阿gydF4y2Ba)。类似的模式中观察THgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内交感神经纤维,少受伤peritenon(无花果。gydF4y2Ba1便士gydF4y2Ba),但明显增加网站在9周腱(无花果。gydF4y2Ba1问gydF4y2Ba)。这反映出在增长572%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在整个研究期间神经密度(图。gydF4y2Ba1 rgydF4y2Ba)。因此,进步的轴突入侵伴随创伤后异位骨肽能的和富有同情心的自主神经纤维组成。gydF4y2Ba

近端神经切除术废除创伤后异常细胞的命运gydF4y2Ba

为了询问要求轴突的入侵,何鸿燊感应的上下文中执行手术去神经。有或没有执行,何鸿燊感应侧坐骨神经横断近端神经的三根分叉部(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。冯·弗雷测试确认机械痛觉减退在去神经的动物(补充图。gydF4y2BaS1agydF4y2Ba,21.2%的延迟爪子撤军)。正如所料,在sham-operated条件,TUBB3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维再次显示进步的网站入侵HO 1, 3, 9周后损伤与0-week控制。相比之下,这种渐进的生成是去神经的HO网站(图中未见。gydF4y2Ba2 b - hgydF4y2Ba)。定量组织学分析下使用TUBB3-immunostained执行部分(图。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba)。这是量化,展示整体进步增加TUBB3免疫反应性在整个研究期间(增加303%、1224%和1286%,3和9周,分别与控制),虽然没有显著增加神经纤维频率去神经的动物在这个时间内观察到的课程(无花果。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba相比减少79%,9周sham-operated动物)。这些发现被证实使用免疫组织化学鉴定CGRP怎样gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba感觉纤维和THgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba交感神经纤维内的网站(无花果。gydF4y2Ba2 j-ogydF4y2Ba)。CGRP怎样免疫染色及定量分析的网站完全抑制CGRP怎样了gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba纤维的生成(图。gydF4y2Ba2 j-lgydF4y2BaCGRP怎样减少66%,疣状)。整合和TH完全废除gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba纤维的生成也观察到,使用TH免疫组织化学和定量分析(图。gydF4y2Ba2 m-ogydF4y2BaTH免疫染色减少68%)。gydF4y2Ba

去神经的影响下评估软骨和骨形成。受伤的矢状部分肌腱被应用与SOX9沾染了红色染料O检测软骨内开发HO站点(无花果。gydF4y2Ba2 pvgydF4y2Ba)。在1周后损伤,增加SOX9免疫反应性被发现在sham-operated网站,但不是去神经的损伤(图网站。gydF4y2Ba2 p, qgydF4y2Ba)。在3个星期,sham-operated动物显示彩色软骨粘多糖的积累,而不是neurectomized动物(图。gydF4y2Ba2 r, sgydF4y2Ba)。弗兰克在9周,观察骨形成在sham-operated控制组织,而软骨中观察到现在去神经的突起物(无花果。gydF4y2Ba2 t, ugydF4y2Ba)。这些发现的软骨内骨化延迟使用histomorphometric量化分析串行部分描绘软骨区(C.Ar)受伤的网站(图。gydF4y2Ba2 vgydF4y2Ba)。sham-operated条件下,软骨组织地区著名的3周,几乎没有检测到9周软骨内骨化的进展。相比之下,软骨组织在3周(图大幅减少。gydF4y2Ba2 vgydF4y2Ba,减少66% C。基于“增大化现实”技术在去神经的标本比较sham-operated动物)。剩余的软骨被确认在9周去神经的动物。这减少软骨内骨化确认用microcomputed断层扫描(μCT),评估在研究端点(图。gydF4y2Ba2 w xgydF4y2Ba)。在所有样本,extraskeletal骨化是明显sham-operated标本,但不是在去神经的标本,这证实了显著减少骨体积(BV)μCT分析(图。gydF4y2Ba2 ygydF4y2Ba去神经的动物之间,减少97%)。基本完成骨化的废除是证实了使用修改后矢状部分沾戈德纳的三色的(无花果。gydF4y2Ba2 z, aagydF4y2Ba)。同样,histomorphometric评估骨区(B.Ar)证实,近端神经切除术完全废除异位骨(图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba去神经的动物之间,减少96%)。gydF4y2Ba

鉴于HO的著名的减少与外科去神经形成,我们进一步分析了潜在的运动机能的变化在虚假的或neurectomy-treated动物。整体运动去神经的动物之间没有明显的变化,事实上,电视节目分析发现一个轻微的增加整体活动在去神经的动物(补充图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)。因此,外围神经支配是异常的细胞分化所必需的程序,发生在创伤HO整体动物活动没有显著变化。gydF4y2Ba

软组织创伤诱发血管周的神经生长因子表达gydF4y2Ba

有了必要的神经纤维在创伤,我们接下来阐明信号刺激这个神经损伤后长在肉内。神经生长因子是主要的生成,刺激骨骼感觉神经的生成gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。提供详细的动态表达式分析,现场scSeq HO的形成进行分析之前受伤(天0)和在早期的时间点的3、7和21天后损伤与未受伤害的控制(无花果。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。9细胞集群定义,大致包括三个中层人群(周皮细胞/血管SMC、间叶细胞和骨骼肌前体),两个内皮人口(内皮细胞和内皮细胞淋巴),和四个炎性细胞群(巨噬细胞,B细胞、T细胞和嗜中性粒细胞)(图gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。特定的审讯gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达跨细胞集群和跨时间点执行。周皮细胞/血管SMC人口典型gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba平滑肌肌动蛋白α2gydF4y2Ba),gydF4y2BaMyh11gydF4y2Ba(gydF4y2Ba肌凝蛋白重链11gydF4y2Ba)表达式代表的主要来源gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba在基线和受伤后(图gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba,意思是归一化gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达0.4;gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba检测到细胞的39%)。在一个小得多的程度上,人口间充质来源的表示gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba成绩单,也以基因标记gydF4y2BaPdgfragydF4y2Ba(gydF4y2Ba血小板源生长因子受体αgydF4y2Ba),gydF4y2BaPrrx1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba成对相关同源框1gydF4y2Ba)(平均归一化gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达0.04;gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达的细胞)的7.4%。其他人群表现出罕见的没有表达gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba,包括gydF4y2BaPecam1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba血小板内皮细胞黏附分子1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内皮细胞和个人炎性细胞群(不属于细胞外膜细胞/ SMC或间充质集群显示意味着规范化gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba0.009的表达,检测到细胞的1.2%)。Subclustering表达名列前茅gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达周皮细胞/ SMC人口证实,两个subclusters在场(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba),其中包括gydF4y2BaPdgfrbgydF4y2Ba(gydF4y2Ba血小板源生长因子受体βgydF4y2Ba)gydF4y2Ba^高gydF4y2BaPrrx1gydF4y2Ba^高gydF4y2BaAbcc9gydF4y2Ba(gydF4y2Ba磷酸腺苷磁带,sub-family C,成员9gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和周围的周gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba^高gydF4y2BaPlngydF4y2Ba(gydF4y2Ba受gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMyh11gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba血管smc(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。这两个subclusters,血管smc最高gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达式在基线(smc,意味着规范化gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达0.52;gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba发现在41%的细胞;周,意味着规范化gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达0.28;gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba检测到23%的细胞),周和血管smc证明了感应的gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba受伤后(图表达。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。已知的受体神经生长因子下评估在相同的数据集(补充图。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)。高亲和性受体神经营养受体酪氨酸激酶1 (gydF4y2BaNtrk1gydF4y2Ba)编码TrkA基本没有透露表现在所有采样细胞(补充图。gydF4y2BaS4a bgydF4y2Ba,意思是规范化表达细胞的0.2%)。低亲和力受体gydF4y2BaNgfrgydF4y2Ba主要是外膜细胞中表达/血管SMC集群(补充图。gydF4y2Ba自己,dgydF4y2Ba平均归一化表达式0.3,表示30%的细胞)和低表达的所有其他细胞集群(平均归一化表达式0.017,表示1.6%的细胞)。因此,在这个模型中,夫妻神经向内成长和异常的间充质细胞分化、血管周的细胞显示最高gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

确认这浓缩gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba记录在不同的细胞群在何起源,我们接下来分析NGF-eGFP记者的动物gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba。该模型表示一个增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的小鼠神经生长因子启动子的转录调节整个神经生长因子基因,包括pro-NGF、成熟的神经生长因子,和各种各样的拼接pre-pro-NGF基因变异。这里,矢状横截面的转基因记者下肢进行评估,关注远端站点相比受伤肢体腱(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。在没有受伤的跟腱,本质上没有观察到神经生长因子记者活动在肌腱的身体,和不显眼的记者活动出现在周围的软组织(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。一周后和腱在fibroproliferative阶段,明显的神经生长因子记者活动出现远端站点腱周围(图gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。在何进展3周计算,神经生长因子记者活动仍然高企网站腱周围的活性区(图gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。在骨的阶段(9周),神经生长因子记者活动减弱,但仍高于基线升高(图gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。蛋白表达在受伤部位下评估神经生长因子的免疫组织化学、免疫印迹,酶联免疫吸附试验(ELISA)(补充图。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)。神经生长因子免疫组织化学进行NGF-eGFP记者部分,展示高度重叠在1周后损伤(补充图。gydF4y2BaS5a-cgydF4y2Ba)。西方墨点法神经生长因子和pro-NGF确认增加7天受伤(补充图。gydF4y2BaS5d-fgydF4y2Ba)。定量分析的pro-NGF ELISA证实这些发现(补充图。gydF4y2BaS5ggydF4y2Ba)。接下来,pTrkA的表达分析在侧腰背根神经节(drg)对应的跟腱受伤部位(补充图。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba)。在这里,增加7.52倍pTrkA免疫反应性观察48 h后受伤。gydF4y2Ba

免疫组织化学染色NGF-eGFP记者部分下表现(图与细胞特定类型的抗体。gydF4y2Ba4 f-mgydF4y2Ba)。在1周内部分,tenomodulin (TNMD)gydF4y2Ba^+gydF4y2Batenocytes基本上是记者的负面(图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)。符合scSeq发现,α-smooth肌肉肌动蛋白(αSMA)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血管周的细胞显示神经生长因子的最高强度记者活动(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)。在较小程度上,成纤维细胞的梭形细胞不连接到血管少了强大的神经生长因子记者活动,其中一些表达αSMA(无花果。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba),其中一些表达PDGFRα(无花果。gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)。在这个反应区,偶尔F4/80gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞还演示了神经生长因子记者活动(图。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba)。在何鸿燊的恶化,软骨间叶原基下检查(无花果。gydF4y2Ba4 k, lgydF4y2Ba)。在三周的计算,Aggrecan(能)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaX, X型胶原(Col)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba软骨细胞表现出软弱和不均匀的神经生长因子记者活动(图。gydF4y2Ba4 k, lgydF4y2Ba)。在9周计算,观察成熟骨,骨钙素(OCN)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba成骨细胞和骨细胞显示出一些记者活动(图。gydF4y2Ba4米gydF4y2Ba)。因此,使用动态单细胞转录组以及特定的神经生长因子记者动物,伴随创伤后急性神经生长因子表达增加。此外,这种软组织损伤导致局部神经生长因子蛋白表达增加,以及增加的磷酸化TrkA DRG内轴突的解剖区域供应。gydF4y2Ba

神经生长因子gydF4y2Ba删除抑制HOgydF4y2Ba

我们下一组描述异位骨形成的神经生长因子表达的要求。为了这个目的,gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}动物在治疗损伤部位与adenovirus-encoding Cre重组酶(Ad-Cre)gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}同窝出生收到Ad-GFP矢量控制(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。使用膜TdTomato /执行验证的复合膜GFP(吨/毫克)记者动物,Ad-Cre示范重大重组post操作网站腱在3天内,出现绿色(图。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)。此外,一些系统性的腺病毒被确认的分布,包括肺和肝脏中最显著(补充图。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba)。动物有或没有gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba删除受到HO感应,评估在9周后受伤。在控制条件下的观察轴突入侵Ad-GFP治疗(无花果。gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba),这严重削弱Ad-Cre-treated之一gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}网站腱(无花果。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。TUBB3的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba轴突内的HO网站量化,展示之间的平均神经纤维增长757%频率Ad-GFP相比受伤控制(无花果。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。相比之下,Ad-Cre-treatedgydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}网站展示腱TUBB3无显著增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维频率基准(平均减少88%相比,Ad-GFP控制)。研究结果证实了在CGRP怎样gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba感觉纤维和THgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba交感神经纤维(图。gydF4y2Ba5氯gydF4y2Ba)。CGRP怎样gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经长在肉内显示Ad-Cre-treated明显减少gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}受伤的网站(无花果。gydF4y2Ba5 h-jgydF4y2Ba相比减少73%,Ad-GFP控制)。同样,届gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba交感神经纤维在Ad-Cre-treated严重削弱了gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}网站腱(无花果。gydF4y2Ba5 kmgydF4y2Ba相比减少83%,Ad-GFP-treated控制)。在其他环境中观察到gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba,减少神经密度可能改变血管的生成。评估网站多血管受伤,CD31免疫组织化学染色下执行。Ad-Cre-treatedgydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}网站展示腱CD31显著下降gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血管通道(补充图。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba%减少相比Ad-GFP-treated控制)。的表型结果gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba删除对骨形成下一个评估。μCT重建了显著减少在骨化Ad-Cre-treated网站相比,腱Ad-GFP-treated控制(图。gydF4y2Ba5 n, ogydF4y2Ba证实了),显著减少BVμCT分析(无花果。gydF4y2Ba5便士gydF4y2Ba,平均减少60% Ad-Cre-treated HO网站)。显著减少HO确认使用修改后矢状部分沾戈德纳的三色的(无花果。gydF4y2Ba5 q sgydF4y2Ba)。Histomorphometric评估B。基于“增大化现实”技术证实Ad-Cre-treatedgydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}受伤的网站已经大大减少异位骨(图。gydF4y2Ba5 sgydF4y2Ba,减少63% Ad-Cre-treated受伤站点)。最后,显著减少OCN免疫反应性是Ad-Cre-treated固顶网站(图中观察到。gydF4y2Ba5 t, ugydF4y2Ba)。因此,gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba删除削弱轴突到受伤的网站,相应的伤害引起的病理过程异位骨形成,而拟表型近端神经横断。gydF4y2Ba

抑制TrkA废除gydF4y2Ba

确定了中央神经生长因子的作用,我们下一组验证神经生长因子对其影响神经长在肉内,其次通过其高亲和性受体TrkA干细胞命运决定。首先,我们使用之前验证方法治疗先天性畸形,TrkA信号是严重扰乱了定义一段时间。TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}老鼠敲入为纯合子的等位基因编码蛋白激酶的phenylalanine-to-alanine替换子域名V,呈现其催化活性敏感特异性抑制membrane-permeable,小分子1 nmpp1gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。以前,我们已经验证了时间在TrkA 1 nmpp1抑制动力学gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}动物和验证,1 nmpp1没有明显的直接作用于成骨细胞的细胞gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。此外,我们确认1 nmpp1-treated TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}小鼠没有表现出明显的表型受伤跟腱(补充图。gydF4y2BaS9gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}老鼠或TrkAgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba同窝出生现在受到感应燃烧/固顶,和所有的动物提供1 nmpp1(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。冯·弗雷TrkA内测试证实了感官的赤字gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}老鼠(补充图。gydF4y2Ba印地gydF4y2Ba相比,38%延迟爪子戒断1 nmpp1-treated TrkAgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba同窝出生的)。正如所料,TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}老鼠表现出神经纤维减少频率(图。gydF4y2Ba6 b-ggydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba)。这是第一次观察到基线TrkA受伤peritenon内gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}动物(图。gydF4y2Ba6 b, egydF4y2Ba和补充图。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba)。正如所料,TrkAgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba演示了一个健壮的入侵TUBB3动物gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba远端站点腱内神经纤维(图gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba),大大削弱了TrkA之一gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}同窝出生(无花果。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba)。定量组织学分析下使用TUBB3-immunostained执行部分(图。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)。在实验之前,TUBB3的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba观察神经纤维密度TrkA之一gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba受伤的网站(9周期间增加了442%),虽然没有显著增加神经纤维在TrkA观察频率gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}动物(图。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

抑制TrkA催化活性的影响在何进展是软骨和骨形成下一个评估。受伤的矢状部分肌腱被沾染了红色染料O检测软骨内开发HO站点(无花果。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)。在3周后受伤,染色观察软骨粘多糖的积累TrkA之一gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba受伤的网站,没有找到TrkA之一gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}同窝出生(无花果。gydF4y2Ba6 i, jgydF4y2Ba)。在9周,弗兰克在TrkA观察骨形成gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba软骨组织,而现在TrkA中观察到gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}后肢骨骼(无花果。gydF4y2Ba6 k, lgydF4y2Ba)。这些发现的软骨内骨化延迟再次确认使用histomorphometric描绘C串行部分的分析。基于“增大化现实”技术(无花果。gydF4y2Ba6米gydF4y2Ba)。在TrkAgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba条件下,软骨组织地区著名的3周,几乎没有检测到9周软骨内骨化的进展。相比之下,TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}标本,软骨组织在3周(图大幅减少。gydF4y2Ba6米gydF4y2Ba,平均减少83% C。基于“增大化现实”技术在TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}与TrkAgydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba四肢三星期的计算,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.06)。剩余软骨被确认在9周TrkA之一gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}动物(平均增加243% C。Ar TrkA相比gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba动物)。这种延迟在软骨内骨化TrkA之一gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}使用μCT受伤网站确认,证明减少异位骨μCT重建(图可视化。gydF4y2Ba6 n, ogydF4y2Ba)。BV的定量μCT评估确认TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}动物表现出显著减少异位骨(图。gydF4y2Ba6 pgydF4y2BaTrkA内,减少74%gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}受伤的网站)。减少extraskeletal骨化是下证实了使用修改后矢状部分沾戈德纳的三色的(无花果。gydF4y2Ba6 q, rgydF4y2Ba)。Histomorphometric评估B。基于“增大化现实”技术证实TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}小鼠异位骨TrkA相比明显下降gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba老鼠(图。gydF4y2Ba6 sgydF4y2BaTrkA之间,平均减少52%gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}受伤的网站)。gydF4y2Ba

进一步定义的转化潜力TrkA抑制HO的预防,我们在临床开发利用小分子拮抗剂,AR786,这适用于C57BL / 6 j野生型小鼠(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。AR786是一种选择性细胞内TrkA激酶活性抑制剂,口服生物利用度gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。TUBB3 AR786-treated动物显示下降gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维密度比车辆control-treated老鼠(图。gydF4y2Ba7中gydF4y2Ba)。AR786-induced神经纤维密度的减少受伤peritenon(图中都被观察到。gydF4y2Ba7 b, cgydF4y2Ba),在损伤部位(无花果。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba手术后3周)。定量分析表明TUBB3的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba之间的神经纤维密度vehicle-treated老鼠伤害网站(增加494%),而没有显著增加神经纤维内观察频率AR786-treated老鼠(图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba车辆控制相比减少85%,相应的计算)。番红精O染色在损伤部位的矢状部分演示了软骨粘多糖的积累在控制条件下,基本上没有发现在AR786-treated动物(图。gydF4y2Ba7 g hgydF4y2Ba)。Histomorphometric分析表明AR786-treated老鼠显示C减少69%。基于“增大化现实”技术相比,控制(图。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)。类似的模式中检测出疣状软骨抗原,包括SOX9和COL2(无花果。gydF4y2Ba7 j-mgydF4y2Ba)。增加疣状固现场观察在control-treated动物中,但不是在AR786-treated动物。因此,TrkA抑制通过两个独立的方法削弱轴突长在肉内软组织受伤,与平行减少伤害引起异位软骨和骨骼。gydF4y2Ba

去神经TGFβ转向FGF信号激活pre-chondrogenic细胞gydF4y2Ba

更好地理解下游分子机制,受损轴突长在肉内防止异常骨软骨分化,scSeq再次执行,现在在虚假的手术或侧坐骨神经切除术(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。HO诱导损伤后七天有或没有近端神经切除术,组织是scSeq孤立和维减少导致10独特的集群(无花果。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)被表达独特的细胞标记(无花果。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)。总体相似之处被发现之前我们的数据集,包括几个中层集群包括gydF4y2BaCol1a1gydF4y2Ba表达间充质集群(集群2和5,还发现高度表达gydF4y2BaPdgfragydF4y2Ba),以及一个gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba表达周皮细胞/ SMC集群。在我们之前的数据集的表达gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba再次主要局限于外膜细胞/ SMC集群和被去神经不变(补充图。gydF4y2Ba向gydF4y2Ba)。虚假的和神经切除术样本在所有集群(补充图表示。gydF4y2BaS12agydF4y2Ba),和细胞频率总体之间类似的骗局和神经切除术条件(补充图。gydF4y2BaS12bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

间叶细胞集群是孤立和再分析,生成三个独特的subclusters(无花果。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)。这些集群被确定为gydF4y2BaTppp3gydF4y2Ba表达肌腱sheath-like台盟),gydF4y2Ba过渡委员会gydF4y2Ba表达tenocyte-like (TL)和三分之一的人口富含软骨标记等gydF4y2Ba电脑及相关知识gydF4y2Ba和gydF4y2BaThbs4gydF4y2Ba,我们指定fibrocartilage-like (FCL)。台盟和TL细胞集群共享基因签名具有类似名称最近发表在鼠标髌腱修复模型gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。而台盟和TL subclusters同样体现在虚假的和神经切除组,FCL subcluster浓缩在动物神经切除术(批大小修正,占全国总人口72.6%)(图gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)。细胞周期分析显示,FCL subcluster内神经切除术明显减少细胞增殖(无花果。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

为了更好地理解假定axon-to-mesenchymal细胞旁分泌的关系在我们的模型中,执行中的映射使用两个单细胞的数据集。确定了所有潜在的配体从肽能的疼痛的纤维,使用先前生成的scSeq数据集来自腰背根神经节gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。在下行频率,分泌配体相互参照确认的同源受体的表达在数据集的间充质细胞(s)。这生成一个列表中的150双(补充图。gydF4y2BaS11gydF4y2Ba),其中48%是生长和分化因子,趋化因子,27%和25%的神经肽。选择的路径可能调节chondrogenic分化gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba这已经被证明参与神经骨相声图所示。gydF4y2Ba8 ggydF4y2Ba,包括FGF TGFβ、PDGF VEGF和WNT信号gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

多个信号通路可能是重要的在HO创世纪axon-to-mesenchymal细胞旁分泌作用;我们下一个分析信号中每个通路的激活上下文去神经。为此,我们回到了FCL subcluster,细胞集群,演示了一个pre-chondrogenic损伤后基因签名,并检查途径激活的差异sham-operated与神经切除组。平均通路基因的表达分析列表展示upregulation FGF信号激活,同时减少在集群FCL TGFβ信号激活细胞神经切除术后(图gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)。Upregulation FGF信号后神经切除术被Upregulation典型的几个基因等gydF4y2BaFgf2gydF4y2Ba,gydF4y2BaFgf11gydF4y2Ba,gydF4y2BaFrs2gydF4y2Ba,gydF4y2BaFgfr2gydF4y2Ba(补充表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。的Downregulation TGFβsignaling-associated基因包括神经切除术后,例如,gydF4y2BaTgfβ2gydF4y2Ba和gydF4y2BaTgfβ3gydF4y2Ba,以及gydF4y2BaThbs1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSmad3gydF4y2Ba。其他途径,如WNT、VEGF和PDGF显示更多的适度调整组(无花果。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)。进一步调查从TGFβ转向FGF信号激活,免疫组织化学,pSmad2 FGF2,在受伤部位pERK1/2检查有或没有手术去神经(无花果。gydF4y2Ba8 i ngydF4y2Ba)。结果进一步支持从TGFβ转向FGF信号激活在去神经的损伤网站,包括减少pSmad2疣状(图gydF4y2Ba8 i, jgydF4y2Ba),增加FGF2和pERK1/2疣状(图gydF4y2Ba8 k - ngydF4y2Ba)。因此,损失的神经输入与从TGFβ转向FGF信号激活,可能解释的损失chondrogenic分化。gydF4y2Ba

二次神经切除术对其它non-mesenchymal细胞数量的影响下一个评估。中性粒细胞被指出略假和神经切除术条件(补充图之间的隔离。gydF4y2BaS12cgydF4y2Ba)。隔离和可利用的嗜中性粒细胞集群显示度浓缩去条款增加免疫细胞迁移和虚假的中性粒细胞趋化性和神经切除术(补充图。gydF4y2BaS12dgydF4y2Ba)。巨噬细胞也受到额外的分析(补充图。gydF4y2BaS12egydF4y2Ba)。虽然变化相对温和,巨噬细胞来源于神经切除术动物显示转移基因签名M1-related基因的表达减少,随之而来的M2基因(补充图。gydF4y2BaS12fgydF4y2Ba)。值得注意的是,基于我们之前的研究gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba从M1 - M2-related基因不会符合直接诱发作用降低。急性炎症是造成伤害下化验在1周后用流式细胞仪定量评估炎性细胞频率(补充图。gydF4y2BaS14系列gydF4y2Ba)。流式细胞术对炎性细胞群证实了这些调查结果,包括在CD11b频率没有区别gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba白细胞,F4/80gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞,Ly6ggydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中性粒细胞,Ly6c的细微差异gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba- - - Ly6cgydF4y2Ba^低gydF4y2Ba表达单核细胞有或没有手术去神经(补充图。gydF4y2BaS14系列gydF4y2Ba)。因此,基因表达的细微差异的地方观察髓细胞的数量去神经后,包括粒细胞和单核细胞,这可能在受伤后影响干细胞命运扮演次要的角色。gydF4y2Ba

神经生长因子表达和轴突的入侵与人类有关gydF4y2Ba

最后,NGF-TrkA信号的相关性和异位骨形成在人类患者进行评估。后纵韧带骨化(OPLL)是一个相当普遍的退行性脊椎的支持结缔组织的过程,在异位骨化形成韧带的组织内。以前的文献探讨周期性的机械应变的影响对韧带的细胞是从OPLL的病人gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。复审的微阵列数据集(GSE5464)展示了重要的浓缩gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba在培养韧带细胞OPLL病人相对于对照组(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba5.48、日志褶皱变化,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.02)。相关的下游神经生长因子信号(如成员gydF4y2BaMAPK8gydF4y2Ba,gydF4y2BaMAPK14gydF4y2Ba,gydF4y2BaPTGER4gydF4y2Ba,gydF4y2BaPENKgydF4y2Ba)也增加OPLL病人细胞。gydF4y2Ba

接下来,神经生长因子表达进一步化验在人体组织的部分切除HO(无花果。gydF4y2Ba9中gydF4y2Ba)。神经生长因子免疫反应性存在于几个中胚层的细胞类型,包括血管周的细胞邻近骨(图。gydF4y2Ba9 b, cgydF4y2Ba)。样品中最早fibroproliferative前阶段和弗兰克的出现骨骼,神经生长因子免疫反应性的细胞出现细胞内所涉及的成纤维细胞的形态在整个地区(无花果。gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba)。在更为成熟的临床与弗兰克骨形成,何鸿燊的例子类骨质接缝和bone-associated细胞表现出强劲的神经生长因子免疫反应性(无花果。gydF4y2Ba9 b, egydF4y2Ba)。认识提高,细神经纤维被发现在一个周围软组织内频率增加HO切除标本检查常规苏木精和伊红染色(图)。gydF4y2Ba9 f, ggydF4y2Ba)。为神经抗原S100免疫组织化学染色和神经丝SM31有助于突出杂乱无章的轴突人类HO(图的边缘。gydF4y2Ba9 h,我gydF4y2Ba)。因此,人类HO镜子实验结果的关键元素,包括神经生长因子表达中胚层细胞类型中伴随着异常HO-afflicted组织之间的轴突长在肉内。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们使用外科手术和转基因动物模型证明中央的重要性NGF-responsive TrkA-expressing软组织创伤反应和随后的神经干细胞分化形成软骨和骨骼异常。这似乎涉及NGF-expressing血管wall-resident细胞诱导神经向内成长的初期网站chondro-osseous分化,进而积极调节病理软组织内软骨内成骨。其他团体曾调查了潜在endoneurial细胞HO形成的贡献gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。重要的是,这种endoneurial-derived HO之前不同意血统跟踪研究由我们实验室等gydF4y2Ba^{46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}。相反,我们的研究表明潜在的中央旁分泌的周之间的关系,TrkA-expressing轴突和间叶细胞祖细胞在创伤后异常的间充质干细胞分化。gydF4y2Ba

一个重要的问题,仍有待进一步评估入侵的轴突的下游分子机制积极调节HO的进化。特别是,二级信使发布的轴突,积极调节软骨或骨形成软组织。在两栖动物肢体再生,许多nerve-derived分子一直在探索包括前梯度蛋白质、fgf, bmp,胶质生长因子gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba}。使用receptor-ligand匹配,我们的实验表明,不同的生长和分化因子存在与DRG-derived感觉轴突,在转录水平及其同源受体存在间充质细胞在损伤部位。其中,从TGFβ信号激活FGF信号激活最为明显的手术去神经。TGFβ信号实验HO形成的重要性已经被我们组和其他人gydF4y2Ba^{44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}和失去间充质TGFβ信号激活牵连到这个途径去神经的组织作为一个公认的nerve-derived生长因子驱动HO的形成。激活FGF信号抑制神经切除术后可能有一个假定的影响一个osteochondrogenic程序后受伤。FGF的关键意义的家庭在正常骨骼发育和HO形成记录gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba}。相反,增强FGF信号激活neurectomized细胞可能抑制osteochondrogenic MSC分化,这将符合我们的整体结果gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。另外,upregulation FGF信号后神经切除术可能代表长期fibroproliferative或软骨的阶段gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

除了FGF和TGFβ信号,其他几个信号通路被认为是当前的模型中。P物质(SP)表达在多个HO动物模型和人类免疫组织化学样品已经被很好地记录下来了gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba},外源性SP诱发tendon-associated HO交付gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba。然而,我们的单细胞分析不支持意义重大gydF4y2BaTac1gydF4y2Ba编码表达式(SP)和受体gydF4y2BaTacr1gydF4y2Ba在当地的网站。值得注意的是,使用scRNA-seq轴突不采样,在多大程度上肽能的axon-derived SP调节HO在当前模型需要进一步解决。其他调查人员发现刺猬信号HO开发中扮演的角色gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba。此外,刺猬配体释放感觉神经终端内诱导干细胞分化的牙齿gydF4y2Ba^{61年gydF4y2Ba}。类似的范例neural-derived Hh信号被认为是在我们的模型;然而,我们无法证明Hh水平数据集的间充质细胞内受体。同样,在我们之前的观察,Wnt信号激活下游谎言TrkA-expressing神经元敏感长骨头内的机械载荷gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}。而增加规范Wnt信号被描述为HO形成的分子因素gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba,在我们的数据集在Wnt信号激活没有观察到显著变化的背景下,神经切除术。下游介质HO形成当地公布的轴突仍进一步调查的主题。gydF4y2Ba

另一个重要考虑因素是neuro-immune相声如何影响形成。大量的文献表明,急性炎症早期微环境所需HO利基因素gydF4y2Ba^{53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba}(引用文献综述。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba)。在我们的研究中,轻微的变化观察中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞基因签名的幸免与切断近端神经。例如,一个温和的转变与M1, M2巨噬细胞表型观察表型在去神经。流式细胞仪显示总体数量的髓细胞相似,但从Ly6c转变gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba对Ly6cgydF4y2Ba^高gydF4y2Ba细胞。在几个实验模型,积极监管作用的巨噬细胞对疾病进展gydF4y2Ba^{65年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba68年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba}。同样,我们最近报道一位著名的监管角色tenotomy-associated HO的单核细胞在我们的模型中gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba。的程度NGF-TrkA信号直接调节免疫细胞迁移或功能在我们的模型是未知的。尽管许多炎性细胞,包括中性粒细胞gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba}、巨噬细胞gydF4y2Ba^{72年gydF4y2Ba}和淋巴细胞gydF4y2Ba^{73年gydF4y2Ba}表达TrkA已报告,我们的结果没有发现明显的gydF4y2BaNgfrgydF4y2Ba或gydF4y2BaNtrk1gydF4y2Ba成绩单中炎性细胞集群。然而,炎症的作用作为一个先决条件的利基因素HO是良好的,我们不能排除,微妙的变化在急性免疫反应在我们的发现可能发挥贡献的作用。gydF4y2Ba

最后,我们同意研究大量的文献支持神经与血管的相声在组织修复的重要性。神经和血管建立影响彼此的成长和轨迹随着他们的成长目标组织器官发生期间或修复gydF4y2Ba^{74年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba75年gydF4y2Ba}。事实上,我们自己的观察神经生长因子的血管周的来源是这方面的一个例子神经与血管的相声。在之前我们自己的观察骨形态发生gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba在应力性骨折gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba,TrkA抑制导致受损血管组装。至少在本地骨架,有明显积极的监管入侵的轴突和血管生成之间的关系gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。我们的研究结果与gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba何氏模型中删除支持这种功能耦合的血管和神经。与最近开发的中和抗体临床观察神经生长因子显示骨坏死和快速进步的骨关节病的发病率高gydF4y2Ba^{76年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba77年gydF4y2Ba},这可能是另一个反映了受损的血管生成在生成对抗的背景下。的确,在组合,我们目前和出版工作建议的功能耦合的轴突,血管,和成骨间质,NGF-TrkA信号是一个主要机制,这些链接相关的细胞过程。gydF4y2Ba

本研究有几个额外的限制。首先,神经切除术导致显著减少损伤后骨形成,但持续的软骨被neurectomized动物之一。考虑到成熟的阶段HO在燃烧/固模型的性质gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}作为一名杰出的延迟,我们解释这些结果与神经切除术HO的形成。然而,我们并没有完全排除这种可能性,去神经完全废除骨软骨形成的独立的形成。第二,尽管我们的研究集中在高亲和性受体TrkA,我们注意到我(Ngfr)表达式中出现局部损伤,特别是在周/血管smc。这就提出了有趣的问题是否NGF-Ngfr信号介导HO的重要功能,如损伤血管生成。NGF-Ngfr信号的作用VEGF-mediated血管生成反应在其他情况下被观察到gydF4y2Ba^{78年gydF4y2Ba}。NGF-p75信号的潜在作用创伤何鸿燊为未来的研究是一个有趣的大道。第三,我们的研究集中在当地的潜在分子介质周围神经调节。然而,几项研究已经涉及雪旺细胞骨前体细胞在选择上下文中如数字提示再生gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba和治疗下颌骨gydF4y2Ba^{79年gydF4y2Ba}。周围神经的作用直接细胞HO贡献者需要进一步使用特定的转基因动物模型。gydF4y2Ba

几个临床特征表明我们的发现对人类疾病的相关性。首先,何鸿燊通常发生在靠近大周围神经纤维,特别是在他们的损伤,如骨折后的尺骨神经gydF4y2Ba^{80年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba}人工髋关节置换术后或坐骨神经gydF4y2Ba^{82年gydF4y2Ba}。第二,疼痛几乎总是先于HO的影像学证据。此外,患者普遍遭受慢性疼痛。我们的实验gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba删除演示一个潜在的通道信号通路研究临床翻译。中和抗体对晚期神经生长因子在骨关节炎的疼痛的临床开发,包括tanezumab fasinumab,可能有潜在的标示外使用的预防gydF4y2Ba^{76年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba77年gydF4y2Ba}。我们的聚合数据表明,抑制NGF-TrkA信号可能HO)患者的双重效用,既是HO疾病进展的镇痛和消极的监管机构。未来的研究必须明确神经生长因子拮抗作用的安全信号,特别是在我们的发现证明受损血管的组装的上下文中gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba基因缺失。gydF4y2Ba

动物使用gydF4y2Ba

所有动物动物测试程序符合道德的有关规定和研究,并进行了按照使用指南中提供的指导和护理的实验室动物实验动物研究所(ILAR, 2011)和机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)密歇根大学的约翰•霍普金斯大学(PRO0007390)或(MO16M226和MO19M366)。所有的动物都被安置在IACUC-supervised设施在18到22岁的°C, 50%相对湿度(±20%),和12 h光暗周期与随意获得食物和水,除非另有说明。野生型C57BL / 6 j小鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。NGF-eGFP老鼠Kawaja实验室捐赠的,表达eGFP的控制下鼠标gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba启动子gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba。与液氧小鼠神经生长因子等位基因中生成Minichiello实验室gydF4y2Ba^{83年gydF4y2Ba}。TrkAgydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}从Ginty实验室老鼠捐赠,这是纯合子phenylalanine-to-alanine点突变的外显子12鼠标gydF4y2BaNtrk1gydF4y2Ba基因(F592A)gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。这在TrkA点突变gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}小鼠呈现内生TrkA membrane-permeable激酶抑制敏感的小分子1 nmpp1gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。男女同校,6-8-week-old动物被用于所有的实验。只要可行,同窝出生仔畜分析而盲目的基因型。看到补充表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba的转基因线使用。gydF4y2Ba

外科手术gydF4y2Ba

伤害HO实现通过完全横断跟腱伴随全身30%面积部分背的厚度燃烧,导致软骨内骨化的腱网站在9周时间内,按照我们以前的报告gydF4y2Ba^{34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

在选择实验中,外科去神经的同时执行HO归纳。通过侧大腿近端进行坐骨神经切除术切口。钝性剥离了通过暴露坐骨神经的股二头肌。坐骨神经是断掉的近端神经反射和缝合的三根分叉部神经假肢的附近半腱肌肌肉,防止神经移植术。控制,虚假的神经损伤是外科手术暴露坐骨神经横断。切口缝合关闭了5 Vicryl缝合。gydF4y2Ba

为了实现gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba删除在何鸿燊的网站,一个腺病毒编码Cre重组酶(Ad-Cre, 1045 - ht、病媒生物系统莫尔文,PA)或GFP (Ad-GFP, 1060 - ht,向量生物系统公司)在小鼠经皮注射gydF4y2Ba神经生长因子gydF4y2Ba液氧等位基因gydF4y2Ba^{83年gydF4y2Ba}。病毒的主干5型腺病毒是人类腺病毒和巨细胞病毒启动子。总共1×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba造孔粒子单元被稀释在50μl生理盐水注射手术前48小时和1 h后手术。在选择实验中,重组的空间分布是评估使用相同的协议Ad-Cre注入的mT / mG的动物gydF4y2Ba^{84年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

为了实现颞TrkA TrkA催化活性的抑制gydF4y2Ba^{F592AgydF4y2Ba}使用动物,小分子1 nmpp1gydF4y2Ba^{85年gydF4y2Ba}马里兰州巴尔的摩(极光分析,LLC)。纯度(99.2%)证实了HPLC-UV254,描述由质子核磁共振(400 MHz,二甲亚砜gydF4y2BadgydF4y2Ba6 (DMSO -gydF4y2BadgydF4y2Ba6)与结构是相一致的。股票的解决方案是准备在溶解1 nmpp1在DMSO 200毫米。1 nmpp1管理、腹腔内注射进行24小时之前,前2 h和24 h后损伤的剂量使用5毫米解决方案17μg / g体重。在所有情况下,DMSO-containing车辆是用于控制治疗。动物之后保持1日nmpp1包含饮用水(40μM 1在ddH nmpp1gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO磷酸盐(PBS) -Tween-20)为1%。gydF4y2Ba

为了实现系统性抑制TrkA C57BL / 6 j动物,TrkA抑制剂AR786使用gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}博尔德(数组生物制药有限公司,美国)。股票的解决方案是准备在750毫克/毫升的AR786在DMSO)和玉米油resuspended 2% DMSO /玉米油的混合物。AR786管理、执行口服填喂法和老鼠有100µl混合物的每日剂量为60毫克/公斤3周。在所有情况下,100µl 2% DMSO /玉米油被用于车辆控制治疗。gydF4y2Ba

RNA-seq-10×单细胞基因组学gydF4y2Ba

当地受伤网站microdissected基线(gydF4y2BatgydF4y2Ba0)和天3、7和21日和组织1型胶原酶消化的45分钟0.3%和0.4% Dispase II (Gibco)在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)介质在37°C下恒定在120 r.p.m风潮。消解时随后淬火10%胎牛血清的边后卫RPMI和40μm无菌过滤器过滤。细胞被洗在PBS 0.04% BSA,清点,resuspended ~ 1000个细胞/μl浓度。细胞生存能力评估和台盼蓝排斥女伯爵二世(热费希尔科学)自动计数器和只有样本> 85%可行性处理进一步测序。gydF4y2Ba

单细胞进行10×3′库代基因组铬控制器后,v2试剂盒制造商的协议(美国10倍基因组学,,而CA)。细胞悬浊液被加载到一个铬单细胞芯片以及逆转录反应混合液和单细胞3′凝胶珠,目标2000 - 6000细胞每通道。在这个实验中,8700个细胞被封装成乳液液滴的浓度700 - 1200细胞/μl,目标5000单个细胞预期的多重态率为3.9%。后一代的单细胞凝胶bead-in-emulsions(宝石),进行逆转录和由此产生的邮政GEM-RT产品清理使用DynaBeads MyOne硅烷珠子(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。互补DNA(互补)放大,SPRIselect(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)清洗,并量化,然后保持酶的支离破碎和大小选择使用SPRIselect珠子优化图书馆建设之前互补脱氧核糖核酸扩增子的大小。额外的双面撒珠清理结束后进行修复和撤离。另一个单面适配器结扎后清理完成。索引中加入PCR扩增和最后一个双面撒清理了。库被Kapa量化qPCR Illumina公司适配器(罗氏)和大小是由安捷伦tapestation D1000磁带。读1底漆,读2底漆、P5 P7,每标准和样本指标(SIs)合并宝石生成和图书馆建设通过修理结束,撤离,适配器结扎,PCR。 Libraries were generated with unique SIs for each sample. Libraries were sequenced on a HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) using a HiSeq 4000 PE Cluster Kit (PN PE-410-1001) with HiSeq 4000 SBS Kit (100 cycles, PN FC-410-1002) reagents, loaded at 200 pM following Illumina’s denaturing, and dilution recommendations. The run configuration was 26 × 8 × 98 cycles for Read 1, Index and Read 2, respectively. Cell Ranger Single Cell Software Suite 1.3 was used to perform sample demultiplexing, barcode processing, and single-cell gene counting (alignment, barcoding, and a unique molecular identifier (UMI) count) at the University of Michigan Biomedical Core Facilities DNA Sequencing Core.

总共有~ 40亿读10倍产生的基因组测序分析15复制(四天复制为0、7和21;三个复制天3)。使用10倍基因组学测序数据第一次预处理软件细胞管理员(10倍基因组Inc .,而钙、美国)和对齐mm10基因组。使用修下游分析步骤进行。每个复制最初被认为是独立的。细胞umi < 500个基因,> 60000,或表达的一小部分线粒体umi > 0.1,被过滤后的质量控制。每个时间点分为四个时间点的样本集。基因存在于< 3细胞每集被丢弃。每个时间点设置,包括下游分析提取高度可变基因,规范化,缩放(对每个细胞的基因数回归,UMI每个细胞,线粒体UMI的分数,和细胞周期基因)。质量控制后,时间点集与典型相关分析合并基于变量的交叉基因的四个时间点集(3228、5561、12686和5136个细胞数天0,3,7日和21日,分别)。无监督聚类(鲁汶算法)是用来确定细胞群。 To subcluster the pericyte/SMC cluster (1273 cells), the same procedure described above was followed after filtering out the cells not belonging to the cluster. The subclustering procedure extracted three clusters, labeled as pericytes (868 cells), SMCs (381 cells), and uncharacterized (24 cells). The uncharacterized cluster was discarded from the analysis. Repeating the analysis after discarding the uncharacterized cluster retrieved again the pericyte and SMC clusters.

额外的实验进行坐骨神经切除术和虚假scRNA-seq样本(gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 3每组样品,8042年和8781年细胞为虚假的和神经切除术,分别获得7天后下分析如上所述受伤)。间充质subclusters分析(分别为虚假的1559和1700个细胞和神经切除术)、增生性集群被确认,不能正确地集成通过使用S -回归和G2M-phase分数和之前被进一步分析。计算细胞增殖,修拉的CellCycleScoring功能使用的应用程序更严格的筛选的0.1 S。分数或G2M。分数构成细胞增殖。通路分析,KEGG途径和人工注释用于生成基因通路活化剂的列表。平均计算为每个基因表达和细胞神经切除术后的相对表达与虚假的量化。gydF4y2Ba

μCT成像和分析gydF4y2Ba

鼠标突起物收获和成像9周后损伤(力量MicroCT, 35μm决议和357μA / 70 kV /梁)。扫描被蒙蔽运营商手动分析花键加工在异位组织和计算量在多个阈值(通用电气医疗集团v.2.2视差创新rc18): unthresholded体积对应总异位组织除了800 Hounsfield单位(胡)。gydF4y2Ba

组织学和免疫组织化学gydF4y2Ba

标本采集和放置在4%多聚甲醛在4°C 24 h。在PBS×3顺序洗后,样本在14% EDTA脱钙(1:20体积,Sigma-Aldrich) 14-28天在4°C。跟腱的矢状部分得到使用cryosections 10或50µm厚度。薄片(10µm)是用于所有组织化学染色和免疫组织化学。厚的部分(50µm)被用于神经纤维的免疫组织化学染色。cryosections,样本cryoprotected 30%蔗糖在一夜之间嵌入在10月前在4°C (Tissue-Tek 4583托兰斯,CA)。矢状部分是安装在胶幻灯片(Matsunami TruBond 380年,贝灵汉,佤邦)。组织化学染色包括常规圆),修改戈德纳的三色的,红色染料O /快速绿色。免疫组织化学,部分被洗在PBS×3 PBS洗了10分钟。50µm部分使用时,部分下permeabilized 0.5% Triton X 30分钟。接下来,5%正常山羊血清申请30分钟,然后孵化在初级抗体在一夜之间在4°C调湿室(见补充表gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。第二天,幻灯片在PBS洗,孵化在适当的二次抗体,A594-Goat Anti-Rabbit免疫球蛋白,或山羊Anti-Mouse免疫球蛋白g, 1 h 25°C,然后安装4′,6-diamidino-2-phenylindole安装解决方案(Vectashield h - 1500,向量实验室,伯林盖姆,CA)。数字图像的这些部分被抓获×10 - 100目标使用直立荧光显微镜(徕卡德国马克,徕卡微系统公司,布法罗格罗夫,IL)或共焦显微镜(蔡司LSM780 FCS,卡尔蔡司显微镜GmbH,耶拿,德国)。gydF4y2Ba

12例人类HO nongenetic确认在我们的手术病理档案的形式formalin-fixed,石蜡包埋块(约翰霍普金斯大学),和人类的病理标本的使用符合所有相关的伦理规范。所有物料编码,以保护个人健康信息的机密性,并获得在约翰霍普金斯大学与知情同意制度审查委员会批准。综述了所有情况下由骨病理学家检查诊断准确性(A.W.J.)。总结患者的人口提供了补充表gydF4y2BaS4gydF4y2Ba。Ten-micrometer-thick石蜡部分是准备和使用二甲苯和不同浓度的乙醇。抗原检索是由使用胰蛋白酶酶抗原检索解决方案(猫。不。ab970 Abcam)在室温15分钟(RT)。在PBS洗涤后,部分孵化在3%过氧化氢为20分钟,清洗与PBS紧随其后。接下来,幻灯片被封锁山羊血清(5%的猫。不。s - 1000、向量实验室)30分钟,然后对PBST稀释为0.1%与相应的抗体在一夜之间在4°C。第二天,主要的抗体被冲洗掉0.01% PBST和幻灯片对PBST稀释0.01% anti-rabbit 1:200浓度的免疫球蛋白1 h。 After applying both VECTASTAIN^®gydF4y2BaABC工具包和轻拍过氧化物酶底物(猫。不。sk - 4100,样本向量实验室)、可视化。在某些情况下,双免疫组织化学是下一个。在PBS幻灯片被彻底冲洗后粘连BIOXALL内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶屏蔽解决方案(猫。不。sp - 6000,向量实验室)10分钟,然后2.5%正常马血清20分钟后沿后粘连的幻灯片,0.1% PBST-diluted鼠标anti-PDGFRA主要应用。PBS洗后,ImmPRESS™美联社Anti-Mouse免疫球蛋白(猫。不。mp - 5402,向量实验室)申请在RT 30分钟然后向量红碱性磷酸酶底物工具包(猫。 No. SK-5100, Vector Laboratories) was applied for red color visualization.

的可视化S100进行基准超Autostainer(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。简单地说,幻灯片deparaffinized和温和的燥热引起抗原决定基检索是实现在95°C CC1解决方案(EDTA, pH值9;950 - 224年,罗氏诊断)。一只老鼠对S100单克隆抗体(克隆4 c4.9;predilute;790 - 2914年,罗氏诊断)孵化为4分钟,其次是检测streptavidin-biotin iView检测设备(760 - 091年,罗氏诊断)。执行的可视化SM31徕卡债券III(徕卡生物系统,位于德国)。简单地说,幻灯片deparaffinized和孵化15分钟用鼠标对Neurofilament-H单克隆抗体(克隆SMI-31 1:20,000稀释;NE1022 EMD微孔,伯灵顿,MA),紧随其后的是债券聚合物完善检测设备(DS9800,徕卡生物系统)。gydF4y2Ba

微阵列gydF4y2Ba

从人类脊柱韧带细胞微阵列数据从公开获得基因表达综合GSE5464 (GEO)数据集。在这项研究中,人体脊柱韧带细胞从OPLL患者和正常对照组是生长在一个可变形的硅胶室和受到周期性拉伸9 hgydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。所有生物信息学分析和R Bioconductor包:数据规范化和总结使用健壮的multiarray平均和随后的PCA可视化。线性模型的微分表达式使用标准执行包括Bioconductor包gydF4y2BalimmagydF4y2Ba包通过R,如前所述gydF4y2Ba^{86年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba87年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba88年gydF4y2Ba}。所有数据进行日志2转换,gydF4y2BapgydF4y2Ba值调整使用Benjamini-Hochberg过程错误发现率。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

标本收集、碎和细胞溶解在寒冷里帕缓冲区(热费希尔科学)和蛋白酶抑制剂(细胞信号技术,丹弗斯,MA)。蛋白质分离用4 - 20%梯度钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。吸水后,PVDF膜直接屏蔽5%脱脂牛奶在PBS 0.1% Tween-20 (PBST) 30分钟在RT然后孵化主要抗体(补充表gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。接下来,涂抹与PBST膜进行清洗三次,孵化了辣根peroxidase-conjugated二级抗体1 h rt,膜是用一个ChemiDoc成像系统(Bio-Rad大力神,CA)。Uncropped图像提出了补充图。gydF4y2BaS16gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

ELISAgydF4y2Ba

pro-NGF水平(Cusabio生物技术,武汉,中国;猫。不。CSB-EQ027721MO)受伤跟腱和受伤的跟腱受伤后3天至7天测量以下制造商的指示。每个的光密度是由使用一个微型板块读者与吸光度设定在450海里。gydF4y2Ba

冯·弗雷测试gydF4y2Ba

行为测试•冯•弗雷灯丝刺激和肢体进行撤军gydF4y2Ba^{89年gydF4y2Ba}。老鼠被放置在一个透明塑料监禁custom-manufactured金属网平台允许完全访问所有的爪子。老鼠被允许平衡周围至少15分钟。目标刺激是mid-plantar离开后爪,与日益激烈的冯·弗雷丝垂直的爪子。撤军的后肢在介绍或立即除去头发被认为是积极的反应。多重刺激后,50%的响应阈值计算gydF4y2Ba^{89年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

开放田地活动测试gydF4y2Ba

视频跟踪(ANYmaze Stoelting有限公司美国)开放田地活动测量四个相邻的小隔间有机玻璃领域(46×46厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba面积)10分钟(适应周期开始之前的记录。老鼠在家里笼从住房空间运输过程的房间。每个鼠标然后被耳标,与床上用品放在单独的笼子里只剩下和原状了20分钟。每个象限的地板是用70%乙醇擦拭,并允许晾干5分钟。四只老鼠被单独放置在四个领域之一。所有四个领域占领,录了协议就开始了。最后的协议,老鼠回到家里笼子。地面的象限是清除的杂物,用70%乙醇擦拭,允许晾干5分钟。这个过程被重复,直到所有的老鼠在会话中都被记录下来。开放田地活动测试重复了两次4天之间的过程。gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

何鸿燊感应手术后,周围的软组织损伤部位从肌肉之间的腔室解剖跟腱的起源和跟骨插入指定的时间点。组织1型胶原酶消化的45分钟0.3%和0.4% Dispase II (Gibco) RPMI介质在37°C下常数在120 r.p.m风潮。消解时随后淬火的边后卫RPMI 10%和40μm无菌过滤器过滤。标本被封锁与anti-mouse CD16/32随后使用以下抗体染色:FITC: Ly6C, BV510: CD11b, APCH7: Ly6G BB700: F4/80(见补充表gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)。染色,洗样本运行在一个细胞排序或LSRFortessa FACSAria II进行分析(BD)和分析使用FlowJo软件。看到补充图。gydF4y2BaS15gydF4y2Ba为进一步的流式细胞仪控制策略信息。gydF4y2Ba

组织学图像分析和histomorphometrygydF4y2Ba

所有图像量化得到与正直的荧光显微镜(徕卡德国马克,徕卡Microsystems Inc .)或共焦显微镜(蔡司LSM780 FCS,卡尔蔡司显微镜GmbH)围绕着远阿基里斯腱的网站。TUBB3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维,CGRP怎样gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维和THgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经纤维被量化使用Photoshop CC的魔棒工具,2017的宽容30 (Adobe,圣何塞,CA)使用每样5随机×40显微镜领域或伊万里瓷器的三维体积分析软件v.9.3(英国牛津仪器,贝尔法斯特)使用八个系列字段/在受伤的组织样本。使用一个标准化的地区集中在远端肌腱(1000像素宽,2100像素高),其中包括远端站点和腱立即周围组织。纵向截面幻灯片都沾染了红色染料O-Fast绿色评估C。Ar,沾戈德纳)和修改评价B.Ar三色的。进行了分析在整个跟腱OsteoMeasure histomorphometry分析系统(美国OsteoMetrics迪凯特,GA)。短暂,彩色幻灯片图像转移从显微镜摄像头Osteomeasure软件评估C。基于“增大化现实”技术和B。基于“增大化现实”技术通过手动绘制软骨组织和骨组织的总面积,分别。量化和数据生成由Osteomeasure完成与自动测量软件。gydF4y2Ba

Reactome大卫基因列表分析gydF4y2Ba

Reactome是一个免费的、开源和同行评议的通路数据库详细分子事件和层次关系的广泛交叉引用外部数据库包括运用基因本体,PubMed, ChEBI UniProt,人类和许多其他人gydF4y2Ba^{90年gydF4y2Ba}。分子的参与者为亩骶神经生长因子和TrkA绑定,可视化,导出使用Reactome通路分析web查看器。合成基因列表提交大卫(数据库进行注释、可视化和综合发现)的功能分类和注释gydF4y2Ba^{91年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

定量数据表示为均值±1 SD与单个数据点显示,除非另有说明。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001被认为是重要的,和调整不了多重比较。样品的数量还表示在图传说。Shapiro-Wilk测试正常进行所有的数据集。证实了同质性比较的差异测试。参数数据分析使用一个适当的双面的学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试两组相比较时,或一个双边单向方差分析时使用超过两组比较,紧随其后的是一个事后图基的测试比较两组。Mann-Whitney非参数的数据进行了分析gydF4y2BaUgydF4y2Ba测试两组相比较时或者当克鲁斯卡尔-沃利斯单向分析两组比较多。样本大小的计算进行了实验在无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba是基于预期效应的大小范围2.66 - -3.75,使用我们先前公布的数据在成年老鼠吗gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。对于这个场景,每组有三个样品,两个示例gydF4y2BatgydF4y2Ba测试将提供80%功率检测效果大小至少2.0假设一个双边0.05水平的意义。无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,样本量计算基于1.75的预期效果的大小根据我们之前数据TrkA老鼠。对于这个场景,每组有5个样品,两个示例gydF4y2BatgydF4y2Ba测试将提供80%功率检测效果大小至少1.5假设一个双边0.05水平的意义。所有样本大小的计算是由使用G *功率版本3.1.9.2(弗朗兹·福尔、基尔大学、德国)。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba