TNF-α-mediated米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改ELMO1触发定向迁移的间充质干细胞在强直性脊柱炎gydF4y2Ba

强直性脊柱炎(AS)是一种常见的风湿性疾病,影响0.1全球-0.5%的人口gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。spondyloarthropathy的主要组成部分,特点是慢性炎症和异位骨化entheses,这是有别于其他风湿性疾病gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。然而,慢性炎症的机制和异位骨化和这两个特性之间的关系仍然需要进一步调查。gydF4y2Ba

间充质干细胞(MSC)是一种多功能成年干细胞体内发现gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}。作为的主要来源成骨细胞和免疫细胞的关键调节器,MSC发挥重要作用的桥梁连接骨骼的新陈代谢和免疫内稳态gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。以前,我们的研究以及锦绣二重唱刘的结果,表明MSC的异常增强成骨分化能力从病人(AS-MSC)导致病理性骨生成和syndesmophyte形成gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。此外,我们进一步证明AS-MSC分泌相对大量的CCL2在增强成骨分化过程中,增强单核细胞迁移,增加促炎巨噬细胞极化和增强TNF-α分泌enthesis现场gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。然而,是否TNF-α由巨噬细胞分泌,进而影响AS-MSC仍然是一个悬而未决的问题。gydF4y2Ba

定向迁移到一个特定的位置确保MSC施加强大的功能gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。因为正常的MSC移植有助于组织再生和免疫调节,就不足为奇了定向迁移的功能失调的MSC在疾病发展的结果。迁移过程受到多种因素的调控gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。吞没和细胞活性蛋白1 (ELMO1),这被称为CED12gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba,是一个核心分子参与细胞迁移gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。ELMO1功能结合奉献者的胞质分裂(码头)蛋白质,然后通过Rac1激活调节细胞骨架的重排,参与各种生理功能,如定向迁移,吞没的凋亡细胞,神经系统发育和癌症细胞的入侵gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}。以前的研究已经表明的异常表达ELMO1大大地参与几种疾病,包括糖尿病肾病炎症性关节炎和炎症性肠病gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。ELMO1在MSC定向迁移的作用及其影响发病机理仍然是模棱两可的。gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba-methyladenosine (mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba),目前大约三到五个网站/ mRNA转录(腺苷的0.1 - -0.4%)在哺乳动物细胞中,是最丰富的内部mRNA修改gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改调节基因表达,广泛参与细胞的功能和发展gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。甲基转移酶的微分表达式如METTL3和METTL14或demethylases包括FTO和ALKBH5导致特定基因的异常表达,最终导致疾病的发展gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。然而,米的效果gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改在发病机理从来没有被调查。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们表明,高水平的TNF-α诱导较强的定向迁移AS-MSC MSC与健康对照组相比(HC-MSC)通过增加ELMO1表达式。进一步的研究表明,这种现象是由于METTL14介导mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba的修改gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTR AS-MSC TNF-α治疗后。高表达的ELMO1 AS-MSC enthesis还发现的病人体内。此外,注入Av-ELMO1大大改善了热议小鼠炎症和异位骨化作为spondyloarthritis模型。本研究不仅可能导致的发病机理的说明也为临床治疗提供洞见。gydF4y2Ba

TNF-α诱导增强AS-MSC体外定向迁移gydF4y2Ba

AS-MSC隔绝15病人在活动期间,和HC-MSC获得15健康献血者年龄和性别相匹配(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。以前,我们证明了AS-MSC增强单核细胞迁移和增加M1炎性巨噬细胞极化gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。在这项研究中,迁移化验显示彩色迁徙AS-MSC的数量远远大于那些HC-MSC当cocultured与巨噬细胞(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这种差异是由TNF-α纠正中和抗体,但不是一个anti-IL17或anti-IL23中和抗体,与同等水平观察AS-MSC和HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),这表明macrophage-secreted TNF-αAS-MSC提高迁移能力的影响。治疗后与100 ng / ml TNF-α,彩色迁徙AS-MSC的数量远远大于HC-MSC。没有区别HC-MSC和AS-MSC观察有或没有TNF-α刺激在低浓度(0、10和50 ng / ml)(图gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。愈合试验一致,如图所示,AS-MSC处理100 ng / ml TNF-α更大迁徙的面积百分比比HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。进一步研究定向迁移能力,μ-slide趋化性分析。细胞跟踪显示,AS-MSC更有可能比HC-MSC向着TNF-α迁移。迁移指数、速度和方向都是高AS-MSC比HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。这些结果表明,在一个相对较高的浓度导致TNF-α增强AS-MSC体外定向迁移。gydF4y2Ba

TNF-α加速AS-MSC体内的定向迁移gydF4y2Ba

进一步调查TNF-α-induced AS-MSC体内迁移,我们移植MSC /美国和TNF-α注入裸鼠,其次是生物发光的性能测定和免疫组织化学分析(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。MSC移植领域所表现出的生物发光分析逐渐从第0天增加到第五天。在3和5 MSC注射后,AS-MSC的生物发光面积比HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。此外,免疫组织化学分析如图所示,迁徙AS-MSC,认同了反HLA抗体,是比这更大的迁徙HC-MSC TNF-α注射部位(图gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。这些结果表明,AS-MSC有较强的迁移能力比HC-MSC高浓度TNF-α治疗。gydF4y2Ba

在AS-MSC TNF-α导致ELMO1表达升高gydF4y2Ba

整个六HC-MSC六AS-MSC的转录组测序,无民事行为能力人或者100 ng / ml TNF-α刺激,。共有2631个差异表达mrna HC-MSC被确定,和4680年发现差异表达mrna在前后AS-MSC TNF-α刺激。当比较HC-MSC AS-MSC 100 ng / ml TNF-α刺激后,共有1780个差异表达mrna(补充图中被发现。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。Clustergram分析显示显著差异之间的观察MSC治疗没有TNF-α和AS-MSC和HC-MSC对待TNF-α(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。一致,PCA证实AS-MSC处理100 ng / ml TNF-α有不同的表达谱比HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

之间的差异表达的mrna HC-MSC(或AS-MSC)之间没有TNF-α和TNF-α-treated AS-MSC和HC-MSC基因被认为是至关重要的。通过维恩图解分析,489年确定了关键的差异表达mrna(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。由去分析,这489 mrna在炎症反应,丰富趋化性和chemokine-mediated信号通路在趋化因子的生物过程类别和丰富活动分子和细胞因子活动功能类别(补充图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。此外,“cytokine-cytokine受体相互作用”,“趋化因子信号通路”,“细胞粘附分子”前3丰富通路通过KEGG分析(图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。深入分析这些通路的38个差异表达mrna,其中ELMO1最大的褶皱变化(4.16倍调节AS-MSC相比HC-MSC TNF-α治疗后),中央交点趋化因子信号通路(图gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

与测序数据一致,PCR结果表明ELMO1表达MSC增加TNF-α治疗后,其表达TNF-α-treated AS-MSC远远高于TNF-α-treated HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。这些结果也证实蛋白质水平的免疫印迹(无花果。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)。细胞免疫荧光检测显示ELMO1 TNF-α刺激后的荧光强度AS-MSC高于HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba)。关于其他艾尔摩及其结合蛋白码头,ELMO3 DOCK8并不表示在MSC,和没有ELMO2差异或DOCK1, 2、4、5之间观察HC-MSC和AS-MSC(补充图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

研究已经证明,ELMO1激活Rac1绑定到码头的蛋白质,促进趋化作用的其他细胞gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。活跃的MSC Rac1水平也提高TNF-α浓度增加。值得注意的是,活动AS-MSC Rac1水平显著高于HC-MSC处理100 ng / ml TNF-α(无花果。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。此外,蛋白质-蛋白质之间的关系确定使用Co-IP和质/ MS分析表明ELMO1主要绑定DOCK1 DOCK4,船坞,ELMO2, NCKAP1 MSC,这是类似于其他细胞之前报道的相互作用,这些相互作用是相同的在HC-MSC和AS-MSC(补充图。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba和补充表gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。此外,抑制DOCK1,但不是DOCK4和5,中和活性Rac1 ELMO1水平调节的超表达,表明ELMO1绑定DOCK1 TNF-αMSC治疗促进Rac1激活(补充图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

TNF-αELMO1表达介导促进MSC移植gydF4y2Ba

然后,我们调查的角色ELMO1与TNF-αMSC移植治疗。三个siRNAs特定ELMO1设计,siRNA2,最高的效率,是用来构造Lv-ELMO1;的抑制效率Lv-ELMO1也证实了基因和蛋白质水平(补充图。gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba)。没有区别在增殖能力观察数控和Lv-ELMO1集团(补充图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)。在抑制ELMO1 AS-MSC处理100 ng / ml TNF-α,彩色transwell迁移细胞的数量分析和迁徙的愈合化验结果都是平等HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。此外,生物发光面积Lv-ELMO1-transfected AS-MSC裸体小鼠也减少比Lv-NC-transfected AS-MSC并显示没有区别于HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。下游活跃Rac1水平Lv-ELMO1-transfected AS-MSC对待TNF-α也明显减弱为水平相当于HC-MSC对待TNF-α(无花果。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一个OE-ELMO1向量构造,超表达效率也证实基因和蛋白质水平(补充图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba的增殖能力,F)。数控组和OE-ELMO1组(补充图。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。当HC-MSC ELMO1表达增加,他们的迁移能力,如图所示transwell和愈合化验,显著地改善了100 ng / ml TNF-α刺激,几乎达到AS-MSC(图的能力。gydF4y2Ba4 egydF4y2Baf)。这些结果进一步证实了评估生物荧光迁徙区域(图。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)。类似于AS-MSC, OE-ELMO1-transfected HC-MSC活跃Rac1水平高于控制HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)。这些结果表明,ELMO1促进MSC移植,异常ELMO1 upregulation由TNF-α刺激导致增强AS-MSC迁移。gydF4y2Ba

ELMO1作为治疗目标gydF4y2Ba

Enthesis得到从9个患者和9匹配许可期间患者腰椎手术(补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)。ELMO1表达式(如图所示的免疫荧光分析和量化的平均荧光强度)CD105gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMSC在enthesis样本是高于控制enthesis样品(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。然后,热议老鼠接受3毫克、农业通过一个腹腔内注射诱导功能,和Av-ELMO1建于治疗。Av-ELMO1注入后,关节炎评分显著降低,发病率时间被推迟注射组与对照组相比(图gydF4y2Ba5 bgydF4y2Bac)。此外,炎症是通过监测临床表现和执行)染色,显示和异位骨化的微ct检查所示,也提高了Av-ELMO1(图。gydF4y2Ba5 d-fgydF4y2Ba)。当关注局部组织的脚踝enthesis,迁徙CD105的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMSC Av-ELMO1组明显减少。此外,CD68的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞和表达TNF-α也减少了Av-ELMO1热议老鼠(无花果。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

减少METTL14表达会导致较低的mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改和RNA的降解gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba在TNF-α-treated AS-MSCgydF4y2Ba

之前的研究确定mRNA稳定性和表达可以消极由mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个修改gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。在此,我们发现mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改的gydF4y2BaELMO1gydF4y2BaMSC TNF-α浓度增加和减少,100 ng / ml TNF-α治疗后gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba米gydF4y2Ba^6gydF4y2BaAS-MSC修改水平远远低于HC-MSC(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2BaELMO1gydF4y2BamRNA的半衰期AS-MSC是超过100 ng / ml的HC-MSC TNF-α刺激,表明更好的mRNA的稳定AS-MSC(无花果。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Bac)。然后,我们发现m的表达水平gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个相关的甲基转移酶和demethylases。结果表明,METTL3 ALKBH5, FTO表达增加,METTL14和WTAP表达式TNF-α治疗后有所下降。当处理100 ng / ml TNF-α,AS-MSC比HC-MSC METTL14表达较低。没有观察到显著差异在其他mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个相关的甲基转移酶和demethylases(无花果。gydF4y2Ba6 d, egydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba)。一致,METTL14 CD105的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMSC在明显低于enthesis样本,在控制enthesis样品(图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)。这些结果表明,较低的METTL14表达TNF-α-treated AS-MSC比HC-MSC可能导致较低的mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba水平和退化的速度慢gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

抑制METTL14表达式增加ELMO1表达式和促进MSC定向迁移gydF4y2Ba

选择最有效的siRNA特定METTL14构造Lv-M14(补充图。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)。的抑制效率Lv-M14被确认在蛋白质水平,和抑制METTL14 MSC ELMO1表达明显增加,但并不影响MSC增殖(无花果。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba)。此外,m的结果gydF4y2Ba^6gydF4y2BaRIP PCR表明,mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改的gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba在Lv-NC-transfected Lv-M14-transfected MSC的显著低于MSC(无花果。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)。此外,在MSC长期抑制METTL14表达式gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna半衰期(图相比,控制治疗。gydF4y2Ba7 cgydF4y2BaMSC, d)。活动Rac1水平也是调节Lv-M14转染后(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae)。然后,我们调查是否抑制METTL14 MSC的迁移能力的影响。正如所料,彩色迁徙MSC和迁徙区域的数量在一个愈合试验Lv-M14组远高于Lv-NC组(无花果。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Bag)。此外,生物发光面积Lv-M14-transfected MSC在裸小鼠(图也增加了。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

METTL14过度会使ELMO1水平和抑制MSC定向迁移gydF4y2Ba

进一步研究METTL14 ELMO1表达式和MSC的角色迁移,OE-M14,及其对MSC增殖效率和效果验证(补充图。gydF4y2Ba4 j, KgydF4y2Ba)。增加METTL14表达明显抑制ELMO1 MSC(图中表达。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个修改gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba在METTL14-overexpressing MSC增加(图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。此外,gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna在MSC半衰期缩短后OE-M14转染(无花果。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Bad),活跃的Rac1 OE-M14-transfected MSC降低相比,在控制MSC(无花果。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)。METTL14过表达时,MSC在体外的迁移能力,Transwell迁移和愈合分析如图所示,在体内,由生物发光面积测量,如图所示(图是被抑制的。gydF4y2Ba8 f-hgydF4y2Ba)。结果显示在无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表明METTL14增强gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改和加速gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna变性,从而降低ELMO1表达抑制移植MSC。gydF4y2Ba

METTL14作用于特定的mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改网站gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTRgydF4y2Ba

我们进一步研究了METTL14加速退化率的机理gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna。CLIP-PCR结果显示gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba更丰富的METTL14组比免疫球蛋白组,表明METTL14专门绑定到吗gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna转录MSC(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。一项研究表明,METTL14主要是绑定到3′UTR mRNA和提升mRNA变性gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。dual-luciferase记者分析,荧光素酶报告质粒的活动gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTR显著减少野生型但不突变METTL14相比对照组(图。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)。此外,记者与突变质粒gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTR阐明mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改网站的gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)。只有记者和突变质粒的荧光素酶活动1gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTR恢复到正常水平在对照组。记者与突变质粒的荧光素酶活动2和3gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTR等于记者的活动与野生型质粒gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba3′UTR(无花果。gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba)。通过剪辑化验,gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna被发现绑定YTHDF2和YTHDF3但不是YTHDF1 YTHDC1或YTHDC2(补充图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。此外,抑制YTHDF2或YTHDF3减少gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna退化率,表明METTL14调节gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna通过mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一位读者酶YTHDF2和YTHDF3(补充图。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

是一种常见的风湿性疾病患病率高的0.1 - -0.5%的高成本的疾病gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。不同于其他风湿性疾病,临床特征称为enthesitis标志,这是慢性炎症的病理基础和异位骨化gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。然而,enthesitis的发病机制和慢性炎症和异位骨化的关系仍不清楚。的主要来源成骨细胞和免疫细胞的关键调节器,MSC发挥重要作用的骨代谢和免疫内稳态之间的桥梁gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。先前的研究已经表明,在MSC时点为风湿性疾病的发展作出贡献gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}。我们的工作和其他的研究团队已经确定,AS-MSC拥有一个增强成骨分化能力,这是一个关键的致病过程的异位骨化gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。此外,AS-MSC进行成骨分化展览功能障碍的能力调节巨噬细胞,导致局部炎症表现为高浓度的TNF-αgydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。这些结果表明,MSC障碍可能是慢性炎症之间的联系和异位骨化。gydF4y2Ba

广泛被称为中央的炎性细胞因子,TNF-α已经证明大大有助于慢性炎症和异位骨化gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。然而,高浓度的TNF-α是否结果AS-MSC障碍在骨生成,进而影响AS-MSC仍然是未知的。先前的研究表明,TNF-α提升MSC移植gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}。此外,MSC的异常迁移能力由TNF-α骨疾病的发病机理gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。在这项研究中,我们从15孤立AS-MSC病人在活动期间和HC-MSC来自15个健康的捐赠者。我们发现AS-MSC有较强的迁移能力比HC-MSC cocultured M1时巨噬细胞和,这种差异可以纠正anti-TNF-α中和抗体但不是anti-IL17或anti-IL23中和抗体。此外,在刺激的背景下与100 ng / ml TNF-αAS-MSC定向迁移的能力表现出强于HC-MSC体外和体内。这些结果表明,M1 macrophage-derived TNF-α,反过来,导致增强AS-MSC定向迁移。gydF4y2Ba

一些炎性细胞因子的水平包括TNF-α升高局部病理组织的gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba。值得注意的是,增强的定向迁移AS-MSC观察只有在一个相对高浓度的TNF-α(100 ng / ml),指示一个病态的而不是TNF-α体内的生理水平。因此,我们建议这个增强的定向迁移潜力可能只存在于局部炎症TNF-α浓度较高的位置,而不是在整个身体的病人。这种猜测可能的原因之一参与如enthesitis在特定网站。gydF4y2Ba

如何TNF-α介导增强的定向迁移AS-MSC我们旨在回答的关键问题。为了解决这个问题,RNA序列HC-MSC AS-MSC执行。治疗后与100 ng / ml TNF-αAS-MSC的基因表达谱明显不同于HC-MSC,共有489个差异表达mrna。进一步的生物信息学分析确定这489生物过程中的关键信使rna是丰富趋化因子趋化性和分子功能活动,和趋化因子信号通路是一个最显著的强化途径KEGG分析。因此,尽管TNF-α影响MSC的各个方面的功能,增强定向迁移AS-MSC最重大的一个障碍是由高浓度的TNF-α引起的。此外,在489个差异表达mrna,我们确定ELMO1最重要的分子最大的褶皱变化,进一步证实了在基因和蛋白水平,以及病人在细胞和组织水平。ELMO1函数绑定到码头,是一个核心在趋化作用区间的分子和趋化因子信号通路gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。据报道,具体来说,ELMO1绑定到DOCK2然后激活Rac1,调节细胞内的肌动蛋白动力学gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba。除了参与生理过程,涉及ELMO1在肿瘤侵袭和局部炎症等病理条件时异常表达gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。在我们的研究中,抑制ELMO1增强定向迁移的AS-MSC纠正这些细胞在体外和体内,和提升ELMO1表达HC-MSC导致迁移障碍AS-MSC相似。因此,我们得出结论,ELMO1参与的中央机制增强定向迁移TNF-αAS-MSC诱导的。gydF4y2Ba

值得注意的是,其他几个趋化因子,如亚兰和CCL13也差异表达在AS-MSC TNF-α刺激。据报道,这些趋化因子调控MSC迁移gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。然而,我们关注ELMO1不仅因为它有最大的褶皱变化也是一个中央交点的趋化因子信号通路的作用。这意味着针对这些趋化因子几乎影响了他人的功能,但大多数趋化因子的调节ELOM1可以控制的范围内。体内实验证实了这一假设在我们的研究中。使用热议的老鼠,特性是引起腹腔内注射、农业,我们发现该病发病率时间被推迟,活动后明显减少得罪ELMO1。此外,炎症和组织学变化改善脊柱和热议老鼠Av-ELMO1注射后的脚踝。虽然我们不能得出Av-ELMO1是否影响细胞除了MSC, Av-ELMO1迁徙CD105的数量明显减少gydF4y2Ba^+gydF4y2BaMSC和CD68gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞及其分泌TNF-α水平在当地组织的热议老鼠。我们建议针对ELMO1可以抑制增强AS-MSC迁移,因此macrophage-mediated改善炎症和随后的组织病理变化。这些结果不仅强调的关键角色ELMO1 AS-MSC增强定向迁移的的发病机制,但也预示着ELMO1的有前途的应用的临床治疗。gydF4y2Ba

另一个关键问题是:如何TNF-α诱导AS-MSC ELMO1表达升高。最近的研究表明,细胞因子在相对较高的浓度会导致异常RNA修改和后续的基因表达谱的变化,从而导致组织炎症和自身免疫性疾病gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}。在我们的研究中,我们注意到增加ELMO1表达AS-MSC发生后的第一个在mRNA水平高浓度TNF-α刺激,这表明RNA可能参与修改这个问题。最近,TNF-α被调停m决心抑制MSC分化gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改特定的信使rnagydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。此外,米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改调节基因表达,从而影响细胞迁移gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba。米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba信使rna,最丰富的内部修改,可以加速mRNA变性和负面影响基因表达,广泛参与细胞的功能与发展gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。此外,m异常gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改在风湿性疾病的发病机制中扮演重要角色,包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}。与100 ng / ml TNF-α治疗后,mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一定程度的gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba在HC-MSC AS-MSC显然低于。此外,变性的gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna在AS-MSC低于HC-MSC,符合程度的增加gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna表达在AS-MSC TNF-α刺激。在此,我们证明了m的至关重要的作用gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改ELMO1和随后的高表达增强AS-MSC定向迁移。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba受特定的甲基转移酶和demethylases修改gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。这些米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba相关蛋白参与调控MSC功能gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。在此,虽然大多数m的表达gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba相关的蛋白质改变TNF-α刺激后,是一个区别AS-MSC和HC-MSC被发现只有METTL14 TNF-α治疗后的浓度100 ng / ml。此外,METTL14表达MSC从enthesis组织异常下降相比,从控制的组织。此前,METTL14, mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba甲基转移酶,证明通过m调控乳腺癌细胞迁移gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个修改gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。此外,抑制METTL14 MSC降低了mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一定程度的gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba然后调节ELMO1表达蛋白水平,从而促进MSC在体外和体内的迁移能力。Overexpressing METTL14产生逆导致MSC,确认METTL14负调节ELMO1表达式通过mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改与TNF-αMSC刺激。因此,METTL14 ELMO1导致增强的关键中介AS-MSC定向迁移。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改调节特定基因表达的增加或减少mRNA的稳定性。的不同效果gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改取决于主要的mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba甲基转移酶或demethylases及其绑定gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一位读者酶gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。一项研究表明,METTL14的mRNA稳定性的影响gydF4y2BaMYBgydF4y2Ba和gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba通过mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改,最终抑制造血干细胞分化gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。在我们的研究中,我们发现gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba信使rna半衰期是负相关的gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba水平和METTL14表达水平。此外,在我们的实验系统中,我们确定METTL14主要约束YTHDF2 YTHDF3,两米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba读者主要促进信使rna降解酶gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。我们得出的结论是,METTL14 YTHDF2和YTHDF3下降gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba米后mRNA稳定和提高其降解率gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改,导致较低的表达式的ELMO1 TNF-αMSC治疗。gydF4y2Ba

功能区分从其他风湿性疾病,慢性炎症和异位骨化entheses中央的病态特征,存在以外的骨头gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。然而,众所周知,位于骨髓MSC。尽管我们已经表明,多个障碍在AS-MSC导致的发病机制gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba},目前尚不清楚如何MSC移植并参与enthesis病变。正常MSC迁移到特定网站和参与组织再生和免疫调节(42),MSC的迁移能力异常导致病理病变,有助于疾病的发展,如类风湿性关节炎等gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。因此,重要的是要照亮AS-MSC在特定条件下的迁移能力。以前,微孔,连接与骨髓观察entheses皮质骨和骨髓组织被证明渗入entheses通过这些漏洞,MSC移植提供解剖学依据gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}。在这项研究中,我们表明,在高浓度TNF-α刺激,AS-MSC展出一个增强的定向迁移能力通过METTL14-mediated mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个修改gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba。总结以前的和现在的结果gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}我们建议三步的恶性循环,是很难打破的entheses存在患者:(1)TNF-αenthesis相对高浓度的诱发AS-MSC的定向迁移,从骨髓招募AS-MSC enthesis网站。(2)这些迁徙AS-MSC显示一个增强成骨能力参与异位骨化。(3)AS-MSC随后分泌大量CCL2在成骨分化过程中,增强单核细胞迁移,增加促炎巨噬细胞极化,提高TNF-α分泌enthesis现场。尽管争论关于慢性炎症之间的关系和异位骨化gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba的密切关系,我们的研究增加了支持这两个特性通过MSC和TNF-α的恶性循环。然而,当前可用的证据没有透露这种恶性循环的起源,但一项研究显示,早期应用TNF-α阻滞剂抑制脊髓影像学进展可能意味着TNF-α上游角色gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。最近的研究表明各种因素,包括机械应变和肠道微生物群,可能会触发TNF-α水平的高度gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba},但这需要进一步的调查。gydF4y2Ba

我们的研究可能为临床治疗提供洞察力。成功打破上述恶性循环通过瞄准关键分子可以明显改善。基于我们的体内实验中,我们发现针对ELMO1可以显著改善小鼠热的临床表现和组织损伤。最近,一种小分子抑制剂的码头叫CPYPP被用来对抗ELMO1 /码头Rac1 GEF活动gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。这抑制剂针对ELMO1 /码头/ Rac1表现出极大的能力释放炎症gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba},可能有很大的应用潜力。ELMO1的治疗效果需要在未来进一步的研究。gydF4y2Ba

总之,我们证明了TNF-α加速通过METTL14-dependent AS-MSC m的定向迁移gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba一个修改gydF4y2BaELMO1gydF4y2Ba。这项研究可能有助于理解不仅发病,但也的诊断和治疗。一些问题,如引发的恶性循环和炎症和骨化的前后顺序,尚不清楚,在未来需要解决。gydF4y2Ba

研究批准gydF4y2Ba

这项研究符合赫尔辛基宣言,并经伦理委员会批准的第八个附属医院,中山大学,广州,中国。批准的实验小鼠中山大学动物保健和使用委员会制度,广州,中国。所有试验程序对老鼠进行了严格遵守道德的规则和指导方针在研究中使用动物。gydF4y2Ba

细胞隔离和文化gydF4y2Ba

总共15患者和15人被招募为健康对照组。所有的患者诊断根据1984年纽约修改标准gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。在被告知可能的风险和并发症的骨髓穿刺,所有患者和健康对照组签署知情同意表格。研究对象的特点,提出了补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。MSC是立即分离和纯化骨髓样本使用密度梯度离心法。MSC在杜尔贝科resuspended修改鹰中补充10%胎牛血清,然后播种到25厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba烧瓶和培养37°C公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。悬浮细胞被移除,媒介是每三天更换一次。当文化融合达到了90%,MSC是用0.25%胰蛋白酶消化包含0.53毫米EDTA和受移植者的玻璃瓶;这些细胞被扩大,用于实验。gydF4y2Ba

HEK293T细胞培养在high-glucose DMEM补充剂有10%的边后卫在37°C下5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。融合在80 - 90%,HEK293T细胞消化0.25%胰蛋白酶包含0.53毫米EDTA和受移植者的玻璃瓶。gydF4y2Ba

MSC移植化验Transwell系统gydF4y2Ba

使用聚碳酸酯膜Transwell MSC迁移进行了分析gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba插入(8.0 -μm毛孔,24-well板;康宁公司)。简单地说,共有2×10gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}100年MSCμl DMEM被播种在上部腔体,和600年μl DMEM没有或TNF-α浓度从10到100 ng / ml钱伯斯被加入到低。在图的分析。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和补充无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、2×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba从CD14巨噬细胞分化gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞分离外周血样本600年暂停μl DMEM然后播种下室没有或0.5μg /毫升anti-TNF-α,0.05μg /毫升anti-IL-17或0.5μg /毫升anti-IL-23中和抗体。coculturing 24 h后,心房被洗了三次磷酸盐(PBS)和4%多聚甲醛固定。然后,上部腔体沾0.1%结晶紫,持续15分钟。室的迁徙MSC在较低的一边拍摄,算作意味着数量的细胞每10个随机领域每室两个独立的实验。gydF4y2Ba

愈合化验gydF4y2Ba

使用IBIDI愈合进行化验gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba对self-insertion culture-Inserts 2。每个插入12-well板放置在一个好。MSC (5×10gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}200年μl DMEM被播种的插入。插入被移除,DMEM没有或TNF-α浓度从10到100 ng / ml补充道。经过12 h的迁移,迁移地区使用ImagePro + 6.0计算。迁徙的百分比区域被定义为MSC迁徙面积的比例在12 h到主伤口面积由插入在0 h。gydF4y2Ba

μ-slide趋化性试验gydF4y2Ba

使用IBIDI定向迁移进行了分析gydF4y2Ba^®gydF4y2Baμ-slide趋化作用。获得理学硕士学位悬架(6μl 3×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞)被播种到μ-slide室的中心通道。经过12 h的孵化,DMEM包含TNF-α添加到左侧中型水库,和DMEM TNF-α添加到正确的一个水库。细胞迁移跟踪捕捉每10分钟24 h与BioTek勇士™外汇自动活细胞成像增强显微镜™。细胞跟踪分析使用手动跟踪执行插件ImageJ 1.51和趋化性迁移工具根据IBIDI协议。gydF4y2Ba

细胞免疫荧光检测gydF4y2Ba

细胞免疫荧光试验,5×10gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}MSC在1毫升DMEM被播种在每个12-well板,然后处理或没有100 ng / ml TNF-α24 h。然后,PBS的细胞被洗,固定用4%多聚甲醛和孵化Triton x - 100年的1%。MSC被封锁在山羊血清,然后用一个孵化anti-ELMO1抗体(1:50 0)一夜之间在4°C。这些细胞被洗和孵化fluorescein-labeled二级抗体(Alexa萤石gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba647;1:3000)1 h,其次是与DAPI染色法(热费希尔)10分钟。所有图片是使用一个获得LSM 5励磁机共焦成像系统(卡尔蔡司)。gydF4y2Ba

体内迁移分析gydF4y2Ba

MSC与一个慢病毒转染编码荧光素酶(OBiO技术)如下所述(MSC /美国)。老鼠住在中山大学实验动物中心在特定的无菌条件下,用12 h在温度(光/暗周期(22±2°C)和湿度室(60%)和免费的水和食物。八周大BALB / c-nuν雌性老鼠(中山大学实验动物中心)麻醉通过腹腔内注射氯胺酮和甲苯噻嗪。总共5×10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaMSC /美国在20μl DMEM的背侧皮下注入BALB / c-nu /ν老鼠。20毫升的TNF-α500 ng / ml的浓度是在在MSC的4个部位注射点的距离0.5厘米。注入的MSC /美国人观察使用新创建Xenogen光谱系统(卡尺生命科学,Inc .)天0,1,3,5后腹腔内注射3毫克D-Luciferin钾。分析了生物发光区域使用2.12和6.0 ImagePro +生活图像。注射后7天,老鼠牺牲,和组织TNF-α注射部位免疫组织化学分析得到如下所述。gydF4y2Ba

RNA提取、逆转录定量实时PCRgydF4y2Ba

总RNA分离MSC使用试剂盒和转录成使用PrimeScript互补gydF4y2Ba^TMgydF4y2BaRT试剂盒根据协议。LightCycler定量实时聚合酶链反应进行gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba480 PCR系统结核病(罗氏)使用绿色gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba预混料Taq交货gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba。每个基因的相对表达水平进行了分析使用2gydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCtgydF4y2Ba}方法。每个基因的正向和反向引物补充表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

RNA序列和数据分析gydF4y2Ba

MSC是镀和治疗有或没有100 ng / ml TNF-α24 h。RNA提取如上所述。互补脱氧核糖核酸库建设和排序进行的北京基因组研究所使用bgiseq - 500平台。SOAPnuke 1.5.2的测序数据过滤和清洁读取映射到参考基因组使用HISAT2 2.0.4。使用Bowtie2 2.2.5对齐后,每一个基因的表达水平被RSEM 1.2.12计算,和微分表达式分析了使用DESeq2 1.4.5与褶皱的参数变化≥2和调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba值≤0.001。测序数据分析,包括集群的热图,主成分分析(PCA),维恩图的创建、基因本体论(去)分析,和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)分析,进行使用BGI博士汤姆2.0。gydF4y2Ba

蛋白质提取和免疫印迹gydF4y2Ba

MSC细胞溶解在里帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。离心机在1100×溶解产物gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟,溶解产物蛋白质浓度测定用皮尔斯BCA蛋白质化验设备。immunoprecipitants获得在Co-IP分析如下所述。与样本加载缓冲区,沸腾后等量的蛋白质提取或immunoprecipitants分离使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,随后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔)。PVDF膜被封锁和孵化一夜之间在4°C主要抗体GAPDH, ELMO1, ELMO2, ELMO3, METTL3, METTL14, FTO, ALKBH5, WTAP, DOCK1, DOCK2, DOCK4,船坞,DOCK8或Rac1 (1:1000)。洗涤三次后,PVDF膜是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(1:3000)。具体antibody-antigen复合物被发现使用西方化学发光底物合止动剂。平均强度比率确定和分析使用UVP ChemStudio +系统和ImagePro + 6.0。gydF4y2Ba

Rac1激活试验gydF4y2Ba

Rac1激活与活跃Rac1 MSC检测通过销售税下拉化验检测设备根据设备的协议。短暂,蛋白质提取MSC治疗或没有TNF-α如上所述。树脂含有谷胱甘肽琼脂糖珠被加入到自旋杯与集合管和清洗三次。GST-Human PAK1-PBD添加到自旋杯,其次是蛋白质溶解和孵化1 h在4°C温柔的摇摆。洗后,自旋杯含有琼脂糖珠与减少样品在室温下缓冲孵化2分钟,和筛选了离心收集的样本。GTP-Rac1筛选了蛋白质分数检测用免疫印迹分析如上所述。MSC-derived蛋白质没有销售税下拉是用来检测总Rac1和GAPDH水平。gydF4y2Ba

Coimmunoprecipitation (Co-IP)和液相色谱仪(LC)质谱(MS) /女士gydF4y2Ba

执行Co-IP试验使用Dynabeads™蛋白质免疫沉淀反应设备根据设备的协议。短暂,MSC蛋白质提取是孵化anti-ELMO1抗体(1:10 0)或免疫球蛋白控制在4°C一夜之间,其次是增加G蛋白琼脂糖珠和孵化为另一个4 h。然后,收集immunoprecipitants质/ MS和免疫印迹。质/女士是由上海应用蛋白质技术有限公司有限公司数据分析使用蛋白质组发现者1.4 UniProt数据库(gydF4y2Bahttps://www.uniprot.org/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

慢病毒建设和转染gydF4y2Ba

三个ELMO1、METTL14 DOCK1 DOCK4,船坞,YTHDF2,设计并合成YTHDF3-specific siRNAs OBiO技术。中所示的序列是补充表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba。核被用来使转染MSC使用Lipofectamine RNAi马克斯根据协议,和最好的siRNA可拆卸的效率被选为构建慢病毒编码短发卡RNA(成分)具体ELMO1 (Lv-ELMO1)或METTL14 (Lv-M14) OBiO技术。ELMO1——METTL14-overexpression慢病毒(分别OE-ELMO1和OE-M14)和矢量控制也由OBiO技术。慢病毒(10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba你/毫升)和5μg /毫升聚凝胺被加入DMEM和孵化MSC 24 h的感染复数50。实验进行转染后第四天。腺病毒编码的shRNA特定ELMO1 (Av-ELMO1)或控制腺病毒(Av-NC)老鼠实验也从OBiO技术建造和购买。gydF4y2Ba

细胞增殖实验gydF4y2Ba

MSC与Lv-ELMO1转染(或OE-ELMO1)及其数控控制在96孔板被播种。检测细胞增殖能力使用细胞计数Kit-8根据协议。中没有细胞作为消极的控制。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6gydF4y2BaRNA免疫沉淀反应(RIP)gydF4y2Ba

mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba撕裂试验进行了使用麦格纳MeRIP™m6A装备根据制造商的指示。短暂,RNA提取然后化学分散成200个核苷酸片段或更少。RNA片段与anti-m孵化gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba抗体或IgG-conjugated蛋白质在4°C / G磁珠过夜。然后,收集磁珠,mgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改后的RNA存在分析筛选了如上所述。等量的nonimmunoprecipitated RNA片段被用作输入控制。每个目标基因的褶皱浓缩是由下面的公式计算。gydF4y2Ba

相对折叠浓缩计算了正常化的褶皱浓缩HC-MSC没有TNF-α刺激。gydF4y2Ba

RNA的稳定性分析gydF4y2Ba

MSC被播种在12-well板和放线菌素D处理20μg /毫升的浓度为0,1,2,3 h。治疗后,MSC RNA立即被提取,存在化验进行如上所述。每个目标基因的周转率和半衰期计算如先前所述的研究gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

交联和RNA免疫沉淀反应(夹)测定gydF4y2Ba

MSC治疗150 mJ /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba短波紫外线照射40年代的254海里。执行的剪辑分析当时使用EZ-Magna RIP™rna结合蛋白免疫沉淀反应设备根据制造商的指示。短暂,MSC使用RIP裂解缓冲细胞溶解,溶解产物是孵化与抗体METTL14, YTHDC1, YTHDC2, YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3(1:50)或免疫球蛋白控制蛋白质在4°C / G磁珠过夜。磁珠固定,然后immunoprecipitant包含特定蛋白的RNA结合筛选了和治疗中存在的蛋白酶k .剩下的RNA提取分析如上所述。等量的nonimmunoprecipitated RNA片段被用作输入控制。%的输入是由下面的公式计算。gydF4y2Ba

Dual-luciferase记者分析gydF4y2Ba

METTL14表达式矢量及其突变体(METTL14-R298P),以及荧光素酶记者向量包含ELMO1 c端DNA片段的或与突变的突变gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改网站(T)所取代,被OBiO合成技术。可能的米gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba修改网站被m6AVar预测数据库gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。HEK293T细胞被播种在12-well盘子,然后1.5μg荧光素酶记者向量,1.5μg METTL14或其变异向量,和1.5μg Renilla荧光素酶记者向量cotransfected进HEK293T细胞使用Lipofectamine 3000转染工具根据制造商的指示。转染48 h后,使用Dual-Luciferase荧光素酶活性检测gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba记者分析系统工具包(Promega)根据协议。相对美国人/ Rluc活动被正常化计算Renilla萤火虫荧光素酶的活性的荧光素酶。gydF4y2Ba

鼠标感应、治疗和得分gydF4y2Ba

雄性老鼠从克丽购买产品的日本公司,如上所述。所有的老鼠都依照批准的动物保健指南中山大学动物保健和使用委员会制度。疾病在8周的年龄诱导使用3毫克、农业由腹腔内注射。热议的老鼠被随机分为三组:PBS组,Av-NC集团和Av-ELMO1组。热议老鼠Av-ELMO1组服用5×10gydF4y2Ba^10gydF4y2BaAv-ELMO1通过静脉尾静脉注射时疾病感应,和热议老鼠Av-NC组或PBS组分别用等量的治疗控制腺病毒或PBS。临床特征的老鼠每周监测两个独立观察人士对治疗组也不清楚。分数标准被定义为之前报道gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba:0 =没有肿胀或发红,0.1 =肿胀和发红的位数,0.5 =轻度肿胀和/或发红的手腕或脚踝关节,和1 =严重肿胀的大关节。感应和治疗后8周后,小鼠牺牲和组织获得的微ct检查,苏木精和伊红染色()),免疫组织化学分析和免疫荧光如下所述。gydF4y2Ba

ct机扫描gydF4y2Ba

ct机的结构进行了分析脊柱和脚踝。获得组织和4%聚甲醛固定,然后扫描使用西门子Inveon 19μm CT扫描仪的分辨率。图数据使用辐射DICOM观众5.0.2软件进行了分析。gydF4y2Ba

他走时染色gydF4y2Ba

收获的脊柱和脚踝组织样本和4%的聚甲醛固定24小时,在20% EDTA脱钙14天,然后嵌入在石蜡切片。与苏木精染色的部分为5分钟。与PBS 10分钟,洗后3分钟的部分与伊红染色。然后,部分脱水并使用显微镜观察。gydF4y2Ba

组织免疫组织化学分析gydF4y2Ba

热议的老鼠组织免疫组织化学分析,部分在10毫米孵化柠檬酸缓冲和微波抗原检索的750 W 30分钟。的部分处理3% HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba20分钟和屏蔽5%正常山羊血清1 h。然后,部分分别与anti-CD68孵化,anti-TNF-α或anti-CD105一夜之间(1:10 0)抗体在4°C。二次抗体(1:50 0)孵化和颜色开发使用SP兔子和老鼠进行合民建联设备根据设备的协议。鼠标从体内迁移试验,组织的免疫组织化学分析进行如上所述,除了人类HLA抗体特定类1使用ABC。gydF4y2Ba

组织免疫荧光试验gydF4y2Ba

人类enthesis组织免疫荧光测定,9名患者和9许可患者招募。那些将要动手术的骨化的enthesis被证实通过图像分析和视觉观察期间手术。骨化的腰椎手术期间组织了。研究对象的特点,提出了补充表gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba。被先后获得的组织样本固定、脱钙和嵌入在石蜡。部分是deparaffinized、水分和孵化1% Triton x - 100 / PBS。抗原后检索在山羊血清柠檬酸缓冲和阻塞,部分与anti-CD105孵化,anti-ELMO1或anti-METTL14抗体(1:10 0)一夜之间在4°C。部分被洗和孵化fluorescein-conjugated二级抗体(1:400)与DAPI 1 h,然后另一个10分钟。所有图片是使用一个获得LSM 5励磁机共焦成像系统(卡尔蔡司)。平均荧光强度量化使用ImagePro + 6.0。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有结果确定基于至少三个独立的体外实验包含至少一式三份样品。Shapiro-Wilk正常测试用于检查数据的正常,和数据Shapiro-Wilk检验P > 0.05被认为是符合正态分布。两组比较使用2-tailed学生的进行gydF4y2BatgydF4y2Ba以及,和比较三个或更多不同的团体是由单向方差分析,其次是Bonferroni的事后比较。数据表示为±标准差的手段。与SPSS统计分析(SPSS Inc .)。的gydF4y2BangydF4y2Ba在每个实验值表明个体的数量。假定值小于0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba