介绍

2型糖尿病(T2D)和心血管疾病(CVD)是主要的全球疾病负担的贡献者和过早死亡1,2。有针对性的主要代谢疾病风险防范需要pathway-specific生物标志物检测早期代谢改变,使发展这些常见疾病。Pathway-specific生物标志物可以帮助识别高危个体和发现的分子过程,揭露他们更高的代谢疾病风险。这种生物标记也可以帮助理解生活方式疾病风险的影响,使精确的疾病预防。

改变T2D的血脂成分是一种常见的代谢因素和心血管疾病3。在脂质、神经酰胺是至关重要的第二信使系统信号级联,引发代谢疾病的疾病4。在啮齿动物,神经酰胺代谢调节炎症信号,胰岛素抵抗,和细胞应激反应。神经酰胺代谢酶的基因改造动物保护或倾向严重的代谢障碍5,6。流行病学研究显示关联的神经酰胺和dihydroceramides CVD和T2D的风险7,8,9,10,11,这表明ceramide-dependent致病机制也活跃在人群。

同时,等离子体神经酰胺浓度易受生活方式的修改,包括饮食。相关的双盲随机对照试验表明,改性膳食脂肪酸(FA)的成分(更高的棕榈酸酯- vs罂酸性含量)单独增加肝脏脂肪含量和血浆神经酰胺水平12,13。此外,一个事后PREDIMED试验分析表明,心血管疾病预防和地中海饮食干预尤其是缓解主要心血管事件的风险更高参与者与干预前的神经酰胺水平升高14。

因此,习惯饮食的有益成分与代谢疾病发病率较低15,16,17,18。例如,我们和其他人已经表明,红肉和饮用咖啡与改变相关代谢疾病的风险19,20.,21,22,23和改变脂质代谢24,25,26,27,28。然而,实际的代谢途径,连接这些食物代谢疾病风险仍知之甚少。由于其潜在作用疾病因素和对膳食暴露敏感,神经酰胺代谢效应的介质之间合理的饮食对代谢疾病的风险。

神经酰胺代谢是复杂的,由40多个酶;这些酶受到多个监管流程和选择性相似的神经酰胺的合成或降解组酰基链29日。然而,目前还不清楚如何在神经酰胺代谢分子途径反映在循环神经酰胺概要文件。在这种情况下,数据驱动的网络可以提供生物信息驱动的相关结构依赖性lipidomics概要文件30.,31日。我们已经表明,偏相关代谢组学数据的网络重构的分子通路30.,31日。通过调整代谢组学网络邻居,我们的新NetCoupler-algorithm控制混杂的生物代谢密切相关。因此,分子标记的健壮的协会表示,假定的直接影响疾病风险,不应与其他代谢产物相关性32。

先进的高通量lipidomics屏幕为神经酰胺代谢产生前所未有的见解33。这里我们应用NetCoupler-algorithmceramide-profiling数据从一个大的人口研究,推断出特定的直接影响神经酰胺和dihydroceramides发展T2D和心血管疾病的风险。然后我们进行了全基因组关联研究(GWAS)在这些疾病有关的神经酰胺了解遗传生物因素和选择遗传工具后续孟德尔随机化研究。我们还执行存活率存在中介分析、估算与饮食相关的程度(dh)神经酰胺水平可以解释红色肉类消费的不利影响和有利影响咖啡的消费T2D的风险。

结果

数据分布和网络模型

我们使用以下符号短神经酰胺在整个手稿:CerXX:神经酰胺和dhCerXX: Y与XX dihydroceramides酰基链中碳原子和Y double-bounds(补充表1)。在35 EPIC-Potsdam试点研究参与者与两个血样~ 6周,我们评估了within-person协议(dh)神经酰胺的测量。组内相关系数(ICC)的飞行员表示公平良好的可靠性最ceramide-and大约一半的dihydroceramide测量。然而,一些神经酰胺的测量和大约一半的dihydroceramide测量显示可怜的可靠性(补充图。1)。

观察分析是基于测量12神经酰胺和13 (dh)磷脂质从一个大lipidomics数据集在两个case-cohort样本内嵌套前瞻性EPIC-Potsdam研究(775名参与者与事件T2D 1886名高危参与者,和551名参与者1671事件中CVD危险参与者)。在随机subcohort (n= 1137;baseline-prevalent T2D情况下除外),代表完整EPIC-Potsdam队列在代谢疾病风险,中位数等离子体浓度介于0.2 nM之间(Cer18:1)和42海里为神经酰胺(Cer24:0),和0.62 (dhCer14:0)和11 nM dihydroceramides (dhCer24:1)。平均总浓度(所有单化合物中的脂质类)是91海里(磷脂质差76 - 108 nM), 46海里(IQR 41-52海里)dihydroceramides(无花果。1)。对数变换和z-standardization浓度导致同样的比例,大约正态分布(图。1 b)。相关性分析显示中度到强烈的大多数(dh)天然保湿因子之间的相关性。部分相关性(所有其他条件(dh)神经酰胺)是平均弱和更具体的(补充图。2)。参与者与高总血浆神经酰胺浓度和高总等离子体dihydroceramide神经酰胺浓度同样往往年纪偏大,有一个更高的腰围,有不健康的生活习惯,和药物(补充表2和3)。同样,参与者与事件代谢疾病疾病后面更高水平的这些已知的危险因素相比,参与者保持代谢疾病随访期间无病(补充表4和5)。我们所有这些潜在的混杂因素调整的前瞻性分析。

图1:神经酰胺和dihydroceramide测量的分布。
图1

一个分布的绝对(dh)神经酰胺血浆浓度;请注意,x设在对数。B比较的z分数来自非转换和对数转换(dh)神经酰胺等离子体浓度。Cer神经酰胺,dhc dihydroceramide。

全尺寸图像

Dihydroceramide——ceramide-associated代谢疾病风险标准的Cox模型

首先,我们估计与每一个相关的T2D和心血管疾病风险(dh)神经酰胺不考虑其他可能的影响(dh)神经酰胺。在最低限度地调整模型(年龄和性别),9的12神经酰胺和13个dihydroceramides 11个T2D风险较高的统计上显著相关(罗斯福< 0.05)(补充表6)。进一步调整生活方式、人体测量学、药物,血压,和一般的脂质标记,包括总神经酰胺和dihydroceramide浓度,呈现与这些关联。然而,两个神经酰胺(Cer18:0 Cer22:0)和两个dihydroceramides (dhCer20:0 dhCer22:0)仍具有较高T2D显著相关风险,较低的Cer24:0 T2D风险经过多次测试修正(罗斯福< 0.05)。我们还观察到显著关联的所有12个神经酰胺和12 13 dihydroceramides更高的心血管疾病风险的最小调整模型。然而,在广泛confounder-adjusted模型,只有dhCer22:2与更高的心血管疾病的风险显著相关(罗斯福< 0.05)。最重要的心血管疾病协会所呈现的非重要调整总dihydroceramide血浆浓度和神经酰胺(补充表6)。

直接联系(dh)神经酰胺网络和代谢疾病的风险

神经酰胺代谢产物,这取决于他们的酰基链,是由不同的酶和展览不同的信号功能34。因此,我们感兴趣的直接影响特定(dh)神经酰胺代谢疾病风险,控制了潜在的混杂协会与其他疾病(dh)神经酰胺。我们的NetCoupler-algorithm利用调整为所有网络没有必要阻止潜在的混杂变量和间接影响在一个有条件的独立网络。调整直接网络邻居的一个子集(即。,the (dh)ceramides that are directly connected with an edge] is sufficient32,35,36。我们第一次学会了有条件的独立结构的图形表示,(dh)神经酰胺网络,从lipidomics数据随机EPIC-Potsdam subcohort(无花果。2)。在这个数据驱动的网络,大多数边缘反映已知product-substrate-relations在脂类代谢,如脂肪酸(FA)伸长步骤,FA稀释步骤,或稀释dihydroceramides神经酰胺。符合我们之前的报告30.,31日,network-encoded条件独立结构非常符合已知的生物关系。

图2:数据驱动的条件独立的网络(dh)神经酰胺。
图2

酒吧内节点显示network-adjusted代谢疾病疾病风险。左:T2D风险;右:心血管疾病风险;橙色:风险增加;蓝色:降低风险;数字:风险变化百分比1标准偏差(dh)神经酰胺浓度高。绿色:帧只T2D-associated;紫色:只有CVD-associated;布朗:T2D CVD-associated。CER神经酰胺,dhc dihydroceramide。

全尺寸图像

我们使用网络来估计具体的直接影响(dh)神经酰胺代谢疾病风险,应用Cox比例风险回归。为此,我们构建的Cox模型为每个(dh)神经酰胺time-to-disease发病率的端点。所有模型被广泛的潜在的混杂因素调整的,所有可能的组合的模型在每个组调整的直接接触的网络邻居——(dh)神经酰胺。我们分类(dh)神经酰胺具有直接影响如果他们一致,统计学上显著(P< 0.05),与疾病风险相关的所有基于网络的调整设置。

根据这些标准,三个神经酰胺(Cer18:0、Cer20:0 Cer22:0)和三个dihydroceramides (dhCer20:0、dhCer22:2 dhCer26:1)与T2D有关风险。当同时包含在一个联合Cox模型,包括调整为“预定义的设置和总神经酰胺和dihydroceramide浓度,Cer18:0, Cer22:0 dhCer20:0, dhCer22:2在统计学上显著(P< 0.05)与高和Cer20:0 dhCer26:1 T2D风险较低(表1和补充表7)。三个饱和FA (SFA)含有天然保湿因子密切相关的网络(图。2)。

表1直接循环(dh)天然保湿因子和代谢疾病风险之间的联系。
全尺寸表

的NetCoupler-algorithm还发现Cer16:0协会和dhCer22:2 CVD风险(补充表8)。confounder-adjusted联合模型,(dh)神经酰胺在统计学上显著(P < 0.05)与更高的心血管疾病风险(表相关联1)。在网络,Cer16:0与SFA-containing T2D-associated神经酰胺,而dhCer22:2与代谢疾病的风险更高端点(无花果。2)。

在敏感性分析,为脂蛋白胆固醇没有额外的调整最终的模型(补充表9)也不排斥的参与者在降脂药物的基线(补充表10)大大改变了影响T2D风险或心血管疾病风险的估计。同样,排斥的参与者与疾病发病率的前两年内后续生成定向一致估计T2D风险和心血管疾病风险对所有选中(dh)磷脂质,虽然协会dhCer20:0较高和较低的dhCer26:1 T2D风险被大大减弱(补充表11)。

全基因组关联研究在变异(dh)神经酰胺

我们进行了一次GWAS七疾病(dh)神经酰胺等离子体浓度的表型在所有参与者代表EPIC-Potsdam subcohort遗传和lipidomics数据(n= 1094)。然后,我们抬头SNP - (dh)神经酰胺在全基因组关联暗示显著性水平(p值< 10−5独立研究人群的)。为此,我们使用部分未发表的结果从先前的GWAS神经酰胺Cer18:0, Cer20:0, Cer22:0 EUROSPAN财团37,38(补充数据1从GWAS),结果在弗雷明汉心脏研究Cer22:0后代群体发布的Cresci et al。39。GWAS在这些外部军团支持协会的snpSPTLC3基因区域Cer22:0等离子体浓度(表2)。其他暗示GWAS信号(p值< 10−5)在EPIC-Potsdam不显著(罗斯福> 0.05纠正可用的snp数量复制)或在外部复制军团和提供的补充(补充数据2- - - - - -8)。

表2基因变异与代谢疾病相关疾病(dh)神经酰胺。
全尺寸表

浓缩ceramide-associated snp的代谢疾病疾病相关通路

基于所有p值在1094年从GWAS EPIC-Potsdam参与者,我们进行了基因集富集分析GSA-SNP2软件40。作为参考,我们认为是一个策划的T2D-related路径列表T2D-related (dh)神经酰胺40,我们生成一个策划的CVD-related路径列表CVD-related (dh)神经酰胺。我们选择在丰富基因集问值为0.25,标准截止基因集富集分析。T2D,我们观察到丰富的遗传关联T2D-associated,长链和长链SFA-containing (dh)神经酰胺(Cer18:0, Cer22:0、dhCer20:0 dhCer26:1)与葡萄糖自我调节有关的基因集,胰岛素信号和炎症。为very-long-chain FA-containing dhCer22:2, T2D和心血管疾病风险,浓缩在基因分析表明,群体的遗传关联集反映线粒体功能障碍以及信号级联参与止血(补充图。3)。未发现丰富信号CVD-related基因集的CVD-associated Cer16:0。外部数据的复制基因集富集分析目前还不清楚。

孟德尔随机化评估神经酰胺的因果作用

几个单核苷酸多态性的协会SPTLC3基因区域的等离子体浓度T2D-associated Cer22:0是单一暗示GWAS信号EPIC-Potsdam符合有限的可用数据外部复制。的单核苷酸多态性检测SPTLC3基因区域EPIC-Potsdam基本上同义(r2= 0.96 - 1,D '= 1.0)。协会的变异与Cer22:0 rs680379等离子浓度最低p价值在可用于外部复制EUROSPAN snp37,38弗雷明汉心脏研究的后代群体39,苏格兰民族党也可用在一个大型GWAS T2D(图)41。因此,我们使用rs680379作为一个单变量的遗传工具,两个示例孟德尔随机化研究(先生)。结果表明高T2D参与者的风险较高的基因预测Cer22:0等离子体浓度。使用相同的遗传工具,我们复制的SNP-phenotype协会的先生两个发表GWAS血浆磷脂质,我们用于查找37,39,发现先生估计也显著(表3)。我们没有进行与其他夫人(dh) ceramide-endpoint协会因为缺乏外部的数据复制。

表3单变量,两个示例孟德尔随机化研究利用基因代理估计Cer22:0对T2D的风险的影响。
全尺寸表

神经酰胺作为调停人的假定的diet-effects 2型糖尿病

习惯性的摄入红肉和咖啡消费都报道T2D的风险因素15,但可能潜在的分子机制尚不清楚。与T2D的关系风险的一个可能的解释是这些食物对脂质代谢的影响,可能涉及神经酰胺。测试协会在EPIC-Potsdam是否符合这一假说,我们首先评估如果红肉和饮用咖啡与T2D-related (dh)神经酰胺在定向和统计学意义的方式一致。在相互调整模型和占一套更广泛的潜在的混杂因素的生活方式,红肉摄入量与更高浓度的dhCer20:0 Cer18:0和低水平的Cer20:0 dhCer26:1(无花果。3)。红肉T2D风险EPIC-Potsdam(人力资源/ 2 SD高摄入1.31,95% ci 1.01 - -1.71)在很大程度上是减毒通过调整红色meat-associated神经酰胺(可辩解的比例62%,95%置信区间9%到100%)(图3 b)。饮用咖啡与低浓度的高风险dihydroceramide C22:2(无花果。3 c)。调整逆coffee-T2D协会(人力资源/ 2杯0.87,95% ci 0.78 - -0.98)为dhCer22:2减毒逆咖啡协会T2D风险43% (95% ci 10%到99%)(图3 d)。因此,我们的中介分析结果与假设是一致的不同影响神经酰胺代谢部分调解相反假定的红肉和饮用咖啡对T2D的影响的风险。

图3:中介分析。
图3

一个调整效果估计(β系数)的红肉T2D-related (dh)神经酰胺(关联方向符合中介假说;p值< 0.05,片面的t以及)。B衰减的假定的红肉对T2D的影响风险调整后红肉,T2D-related (dh)神经酰胺。C调整后的效果评估(β系数)的咖啡T2D-related dhCer22:2(中介协会一致的假说的方向;p值< 0.05,片面的t以及)。D衰减的假定的影响咖啡T2D风险调整后喝咖啡——T2D-related dhCer22:2。所有模型都广泛调整潜在混杂因素(年龄、性别、禁食状态,总能量摄入量,休闲体育活动,药物,吸烟,饮酒,和教育)。蓝色表明逆协会(即。,lower ceramide concentration or T2D risk), orange: positive association (i.e., higher ceramide concentration or T2D risk). Total effect is the confounder-adjusted hazard ratio (95% CI) per exposure unit: red meat, 2 SD (~1 portion per day); coffee, two cups (300 mL) per day. PE Proportion explainable, i.e., relative attenuation of the total effect through mediator-adjustment. Cer ceramide, dhCer dihydroceramide.

全尺寸图像

讨论

baseline-healthy在这个前瞻性研究,独立生存的人口,基于深神经酰胺代谢网络和dihydroceramide-profiling数据显示几个关联的特定(dh)神经酰胺代谢疾病疾病风险健壮与调整为其他(dh)神经酰胺。当同时包含在总神经酰胺和dihydroceramide-adjusted Cox模型,“Cer18:0等离子体浓度高,Cer22:0, dhCer20:0,和dhCer22:2 T2D的风险更高,而Cer20:0和dhCer26:1 T2D风险较低有关。高T2D风险Cer18:0 Cer22:0表明,这些化合物可能直接参与分子机制涉及到神经酰胺代谢T2D病因。孟德尔随机化估计符合Cer22:0 T2D的风险的影响,和基因集富集分析联想到有关Cer18:0胰岛素信号和天然保湿因子,细胞因子诱导的炎症。中介分析表明微分的影响高红肉和饮用咖啡对神经酰胺代谢,可能解释的假定的相反的影响两个食物T2D的风险。此外,当同时包括在相同的总神经酰胺和dihydroceramide-adjusted模型,“Cer16:0和dhCer22:2都与更高的心血管疾病风险相关。浓缩的分析表明,浓缩dhCer22:2-associated snp基因集的相关的规定止血和血小板聚集。

未来的人类研究显示神经酰胺的协会T2D风险和糖尿病引起的特征。在强心脏研究,Cer16:0、Cer18:0 Cer20:0, Cer22:0与胰岛素抵抗有关8。的FINRISK-cohort报道Cer18:0-to-Cer16:0-ratio T2D风险较高42的关系,表明Cer18:0短链前体作为T2D发病率的预测。相关的另一项研究(dh)神经酰胺T2D发病率在小鼠和人类,尤其是那些有18 - 22酰基链中碳原子43。尽管由于不同的异质性包括(dh)天然保湿因子和不同的建模方法,这些观测通常与我们的结果一致。基于我们的网络调整,我们与饱和LCFA-containing (dh)神经酰胺T2D风险链length-dependent方式和另外发现风险标记VLCFA-containing (dh)神经酰胺。在相互调整模型中,高水平的Cer18:0, Cer22:0, dhCer20:0,和dhCer22:2与更高的T2D风险相关,而Cer20:0 dhCer26:1和降低风险。

在细胞,神经酰胺信号协调non-esterified FAs的高浓度的代谢反应4。为此,神经酰胺诱导合成甘油三酸酯(例如,通过易位CD36的质膜和感应,如基因44,45,46),表达下调养分供应的差别(其中胰岛素脱敏和对这些脂类分解47,48,49,50,51,52),刺激FA-utilization(例如,通过减少线粒体效率,减少反馈抑制的机会53,54)。长期代谢的挑战下,磷脂质也链接细胞应激免疫反应,细胞凋亡55,56和纤维化57,58。因此,细胞内的浓度LCFA-containing神经酰胺作为营养传感器。因此,基因敲除Cer18:0-producing ceramide-synthase (cer) 1保护小鼠免受不利影响的高脂肪饮食对系统性葡萄糖体内平衡6。我们的研究一直联系Cer18:0强烈T2D风险升高,而其直接网络邻居Cer20:0 T2D中度负相关风险时同时包括在相同的Cox模型。我们的基因分析一致建议功能LCFA-containing神经酰胺代谢调节,特别是其与胰岛素信号通路。我们的结果明确表明Cer18:0与胰岛素敏感性的干扰,证明在动物模型中,与T2D独立生存的人类发展。

啮齿动物和人类的研究表明,神经酰胺信号部分介导的不利影响饮食FA成分代谢不利健康12,13,45。我们相关的高习惯食用红肉的不良饱和LCFA-signature天然保湿因子,特别是高水平的Cer18:0。此外,我们观察到显著影响衰减通过控制红肉T2D风险LCFA-containing神经酰胺,这表明高T2D发病率高的人食用红肉部分可辩解的饱和的红色meat-induced变更LCFA-composition神经酰胺。

定量最丰富的神经酰胺合成酶在人类肝脏CerS2,综合Cer22:0。小鼠基因消融CerS2抑制肝营养适应挑战。CerS2-knockout老鼠防止肝脏脂肪堆积和高血糖喂食过多的方案,但发达国家严重的肝脏疾病59,60。然而,肝细胞对lipid-induced CerS2-knockout小鼠的保护TNF-α/ NF-κB端依赖炎症和细胞凋亡61年。在我们的研究中,定量Cer22:0是等离子体中最丰富的天然保湿因子,它是最强的T2D风险标志。我们进一步联系Cer22:0 GWAS的结果NF-κB激活,孟德尔随机化建议,它可能在T2D发展发挥生物学作用。我们的研究结果表明,人类血浆浓度Cer22:0可能作为生物标志物代谢诱导细胞应激和炎症信号,使T2D。

我们还观察到协会dhCer22:2较高和较低的dhCer26:1 T2D的风险。基因集富集分析显示浓缩dhCer22:2-associated snp的线粒体function-related途径和dhCer26:1-associated snp在胰岛素信号和炎症相关的通路。其他的研究也将与22个碳原子链酰基dihydroceramides胰岛素敏感性和肝脏炎症但没有评估dhCer22:2浓度43,62年。我们建议dhCer22:2和dhCer26:1 network-adjusted分析作为新的独立T2D风险标记和外部验证。

在饮食因素中,咖啡是降低代谢疾病的风险19,20.,21,咖啡对肝脏脂质代谢的影响是一个潜在的解释。动物研究表明,咖啡和其组件影响脂质代谢的关键监管机构,包括SREBP1, CD36, PPARαPPARγ25,26,27,28,影响脂质吸收、排泄和FA-metabolism在肝脏。正如上面所讨论的,神经酰胺营养感应连接到细胞应激反应的调节;和我们的基因集富集分析表明dhCer22:2可能反映了代谢压力信号和线粒体功能障碍。我们发现dhCer22:2与低浓度的咖啡消费和调整生物标志物大幅减毒咖啡消费和逆协会T2D的风险。这些观察结果与假设一致的修改神经酰胺代谢可能部分解释对代谢疾病健康咖啡的有利影响。

一些研究表明,等离子体神经酰胺浓度预测心血管疾病风险7,9,10,14,63年,64年。除了源种类不同,不同的报道(dh)天然保湿因子和不同的建模策略复杂的比较研究。我们发现Cer16:0 dhCer22:2作为独立的心血管疾病危险标记,使用综合lipidomics概要文件和建模策略针对风险协会强劲对调整总神经酰胺和dihydroceramide浓度和其他(dh)神经酰胺。

先前的报道Cer16:0 Cer18:0-associations和更高的心血管疾病风险14,63年,64年符合我们的confounder-adjusted单(dh)神经酰胺模型,没有调整网络邻居和总dihydroceramide和神经酰胺浓度。然而,在我们的研究中,只有与心血管风险Cer16:0协会强劲对调整总神经酰胺和dihydroceramide浓度和网络邻居。

我们发现一个强大的协会dhCer22:2 EPIC-Potsdam CVD风险和不确定以前的CVD风险协会的报告。基因集富集建议可能参与免疫反应,血小板聚集,和交互参与止血。实验研究表明,VLCFA-containing神经酰胺连接血管病理炎症信号65年,66年。老鼠基因和药物抑制类型2-neutral鞘磷脂酶减少了循环VLCFA-containing lipid-induced神经酰胺浓度和预防动脉粥样硬化67年。一致,platelet-activating因子激活神经酰胺生产红细胞,导致他们的附着力68年。此外,VLCFA-containing神经酰胺在功能上参与necroptosis69年提供一个生物链接到血管健康和心脏细胞死亡。遗传学和观测结果表明dhCer22:2可能是一个生物标志物在脂类代谢的接口,炎症信号和心血管健康。

大量来自动物模型的证据支持一个因果作用的具体(dh)神经酰胺代谢疾病疾病发展5,6,44,70年,71年。人工干预的研究表明饮食成分对神经酰胺代谢产生影响12,13。在此背景下,我们的研究结果表明,干预研究(dh)神经酰胺分析有助于理解的分子基础代谢疾病健康膳食成分的影响。等离子体神经酰胺分析可以提供pathway-specific代谢疾病风险标记,与LCFA-ceramides可能反映代谢障碍5,6和VLCFA-containing神经酰胺可能反映了免疫反应,和交互65年,66年,67年,68年,69年。然而,我们的研究也表明,(dh)神经酰胺分子通路的特异性标记取决于同时评估和全面(dh)神经酰胺的建模概要文件。

我们的研究有局限性。虽然提供非常全面的lipidomics屏幕,制造商(该公司®)没有披露的技术指标方差为单一的脂质。我们一定程度上弥补这个缺乏透明度,评估单一的个体内变异脂质测量在几周一个试点研究,评估的时间稳定性(dh)神经酰胺测量。一些(dh)神经酰胺显示大量within-person方差超过几个星期。假设引入方差无关的疾病风险,可怜的可靠性预计偏见单一计量对零风险评估。因此,大多数变异(dh)神经酰胺公平良好的可以在我们的可靠性研究。

此外,观察到的关联可能因素共同作用引起的。结合实验数据,选择特定的链长(dh)神经酰胺对疾病风险有直接影响阐明分子机制是非常有用的。然而,对于其他应用程序,包括风险预测的总效应生物标志物更重要,它可能不是有利于调整为其他相关(dh)天然保湿因子或神经酰胺和dihydroceramides总水平。

的p基于价值的变量选择和推论在我们观察和遗传分析依赖于样本量,复杂的比较研究具有不同统计力量。特别是,GWAS神经酰胺的风险标记在统计学意义上并没有太强的说服力。外部GWAS数据来验证SNP-lipid协会在独立军团并没有对大多数神经酰胺和所有dihydroceramides可用。通路富集分析生成合理的生物学见解从较不严格的遗传关联意义被切断,但数据集复制我们的结果目前还不清楚。

GWAS的统计能力有限也可能部分只占检测的一个可靠的仪器研究Cer22:0先生T2D风险,使用单一的SNPSPTLC3基因区域,阻碍检查水平基因多效性。在这个基因的遗传变异区域也涉及其他脂质和代谢特征。然而,单核苷酸多态性与基因编码鞘脂类的生物合成的关键酶的亚基,和先生与SNP-phenotype协会从独立群体间的结果。不过,静脉注射的多效性的影响必须假设其他神经酰胺,Cer22:0和归因的影响取决于我们的network-adjusted观测分析的有效性。因此,先生估计在因果关系本身不提供确凿的证据但补充观测估计由于不同来源的偏见。我们的发现鼓励更大的GWAS神经酰胺,也可能产生更多的遗传工具先生的研究。中介分析观测数据证明因果关系但不生成可测试的假设,即保证在对照试验验证。

最后,我们的研究表明,代谢疾病风险(dh)神经酰胺等离子体浓度取决于包含酰基链,特别是模型条件对其他疾病(dh)天然保湿因子和神经酰胺和dihydroceramide浓度。这些观察结果与假设一致的特定(dh)神经酰胺参与不同的代谢疾病分子机制疾病病因,这正好与来自动物模型的证据。我们的基因分析的含义还建议疾病(dh)神经酰胺代谢疾病疾病分子通路。此外,我们表明,调整了几个T2D-related (dh)神经酰胺明显减毒的不利影响红肉和饮用咖啡T2D风险的保护作用,与假设一致的是,影响神经酰胺代谢部分介导这些食物T2D的风险的影响。总之,这些结果表明,循环(dh)神经酰胺档案集成信息暴露在遗传和环境代谢疾病危险因素和可能应用pathway-specific对代谢疾病的健康生物标志物。

方法

生物医学研究所有EPIC-Potsdam参与者给予知情同意使用他们的数据,和研究伦理委员会批准勃兰登堡,德国72年。研究参与者没有收到货币补偿。执行所有的工作按照《赫尔辛基宣言》。

研究人群

EPIC-Potsdam

未来的EPIC-Potsdam队列研究包括27548名参与者(16644名女性和10904名男性)年龄35 - 65年内招募从1994年和1998年之间的普通人群72年。然后参与者积极联系发送问卷,如果有必要,通过电话每2 - 3年,每后续轮反应率在90%至96%之间73年。

嵌套病例建立了有效的研究进入分子表型和疾病的风险。case-cohort设计依赖于随机吸引子样品(subcohort)和过采样的事件全部人群中疾病病例在研究期间提高统计能力。统计核算过采样的情况下,这种设计提供无偏风险估计整个队列74年。subcohort (n= 1137;baseline-prevalent T2D情况下除外)从所有参与者在基线(提供血液n= 26437)。此外,对于每一个端点,满队列中的所有事件情况下,直到指定的审查日期包括(心血管疾病:551事件情况下,28 subcohort;T2D:随机subcohort) 775例,26岁。

T2D的审查日期是31日圣2005年8月的事件(820例)。糖尿病与失踪的后续信息,不包括参与者后普遍在招聘、血液标本,不足或non-verifiable信息糖尿病发生率,分析样本由1886名参与者(1000名女性和886名男性),其中包括775名参与者事件T2D从他26是subcohort的一部分。T2D的平均随访时间为6.5年(四分位范围6.0 - -8.7年)。

对于心血管疾病,审查日期是30th2006年11月,583事件主要心血管事件发生在研究过程中。后相当于除外(使用普遍,non-verifiable糖尿病心血管疾病而不是排除标准),心血管疾病样本由1671名参与者(892名女性和779名男性),其中包括551名参与者事件CVD(283只心肌梗死,257只中风,11)从谁28 subcohort的一部分。心血管疾病的平均随访时间为8.4年(四分位范围7.6 - -9.2年)。

基线评估

基线检查包括人体测量和血压测量,个人访谈和问卷调查流行疾病和社会人口和生活方式特征(包括体力活动、教育和药物治疗),和一个验证半定量食物频率问卷(FFQ)。在其他食物中,习惯性的摄入量未加工和加工红肉和咖啡是评估75年,76年。我们定义总红肉的和未加工的红肉和加工肉类。红肉的定量重复评估之间的相关性,加工肉类,和咖啡消费分别为0.73,0.77,和0.70从FFQs 6个月分开,表明良好的重现性77年。人体测量数据和物理考试由训练有素的医务人员。计算BMI在公斤体重除以身高(米平方。腰围测量低肋缘和上级之间的中途前棘到最近的0.5厘米78年,79年。血压测量标准化过程与示波的设备(孙BOSO-Oscillomat,博世& Jungingen,德国),第二和第三的意思是阅读使用80年。

在基线,血液样本被吸引在标准条件下对室温根据研究协议和存储在液态氮(−196°C)或冰柜(−80°C)。每个参与者,30毫升的血液收集,其中20毫升填写Monovettes含有柠檬酸。样本分离血清,血浆,淡黄色的外套,和红细胞和整除0.5毫升吸管详细如前所述81年。

实验室测量

为所有实验室测量,样品被随机分布在批量情况下独立的地位,和所有实验室和数据处理步骤进行盲目的状态。

脂质分析

(dh) ceramide-profiling数据生成与该公司使用该公司(Morrisville,美国)®复杂的脂质。平台生成分子物种浓度和完整的脂肪酸组成每个覆盖脂类,包括13 dihydroceramides和12神经酰胺。从等离子体样品,在甲醇提取脂质:二氯甲烷,集中在氮、和重组醋酸铵二氯甲烷:甲醇(50:50)。提取直接注入到电离源Sciex SelexION®5500−QTRAP质谱仪。电离后,脂质经过SelexIon微分迁移谱(DMS),电压的应用,有选择地只允许通过一个特定的类脂类在任何给定的时间。DMS过滤后,脂质进入多反应监测(MRM),脂质和其特点分段测量。该公司的®复杂的脂质包括> 50 isotopically标签内部标准介绍了生物样品在过程的早期,允许准确定量的脂质和内部类。据该公司®,变异系数(CVs)脂类的含量都低于10%,简历中位数的物种在血清或血浆中浓度1嗯~ 5%。在前面的分析,我们估计组内相关系数(可以重复采集的血液样本几周。国际刑事法院与个体内的人之间变化,表明生物稳定的测量,我们可以使用Rosner的分类(ICC < 0.40再现性差;刑事法院从0.40 - -0.75公平良好的再现性;ICC > 0.75出色的再现性)82年。

遗传学

我们只考虑随机subcohort参与者的遗传分析,排除普遍T2D和CVD例(n= 1094)。DNA提取使用chemagic DNA巴菲从淡黄色的外套大衣装备特殊chemagic磁选模块我(PerkinElmer Chemagen技术,Baesweiler,德国)根据制造商的指示。合格的样本基因分型与三个不同的基因序列不同的一部分基因分型项目:Human660W-Quad_v1_A (n= 328),HumanCoreExome-12v1-0_B (n= 587)和Illumina公司InfiniumOmniExpressExome-8v1-3_A DNA分析BeadChip (n= 179)。基因分型和质量控制Human660W-Quad_v1_A和HumanCoreExome-12v1-0_B芯片的描述83年。使用pcr Illumina公司InfiniumOmniExpressExome-8v1-3_A DNA分析BeadChip进行生活和大脑中心在波恩,德国。这个数组包含约960 000个基因变异,使基因型77%的人类基因组中所有常见的基因变异。此外,250 K高价值的外显子组的内容,通过外显子组测序研究,发现是由芯片。DNA处理根据制造商的指示使用自动化,LIMS控制工作流和数组终于扫描使用Illumina公司iScan珠阵列读者。基因型的要求和质量控制样品在所有1094个样本进行共同使用Illumina公司GenomeStudio v2011.1软件套件。协议建议的财团84年,安德森等。85年和郭et al。86年。被用来获得最终的数据集。zCall阈值的七个应用87年提高基因型呼吁罕见变异。样品与调用率低,不和谐的性信息(F值在0.2和0.8之间),相关的或重复的个人(IBD > 0.185),不同血统的人,或不清楚样品分配被排除在进一步分析(n在排除= 1094)。逐步进行使用和归责密歇根归罪服务88年。单体型参考联盟(1.1版本)作为参考面板89年。在归责之前,使用Eagle2预研阶段应用90年,91年。归罪在四个分开进行数据集(一个为每个基因分型芯片或两个HumanCoreExome-12v1-0_B芯片)使用minimac388年。预处理和post-imputation工具(hrc - 1000 g -检查bim.v4.2.9 icv.1.0.5)检查数据质量是应用92年。四个使用bcftools估算文件合并93年,保持4个合并文件的最小R2得分。之后,单核苷酸多态性被R过滤2,让那些值> 0.6。数据在22个常染色体而不是为性染色体。

有针对性的生物标志物

自动ADVIA 1650分析仪(德国西门子医疗、埃朗根)是用来评估血浆总胆固醇和甘油三酯的水平,我们应用一个性别校正与柠檬酸稀释1.17(1.16校正因子为妇女和男性)94年。

情况确定

T2D

系统的信息来源T2D的发病率是诊断的自我报告,T2D-relevant药物,或饮食治疗随访期间由于T2D诊断。此外,从肿瘤死亡证书和信息中心,医生或诊所提供评估其他诊断筛查事件T2D的象征。参与者分为潜在的情况下,基于这些信息,一个标准的调查形式被送往治疗医生。只有physician-verified病例诊断为T2D(国际疾病分类(ICD)和相关健康问题-10代码:E11]和诊断日期后基线检查被认为是确认的事件T2D病例。

化学汽相淀积

心血管疾病事件被定义为非致命性的发病率和致命的心肌梗死(MI)和中风(icd - 10编码:I21急性心肌梗死,I63.0 I63.9缺血性中风,I61.0 I61.9颅内和I60.0 I60.9蛛网膜下腔出血,和I64.0 I64.9不明中风)。心血管疾病的发病率是由参与者评估自我评定或基于信息从死亡证书。自我报告的发病率是验证通过联系治疗的医生,包括评估结果代码,发生日期,进一步的信息在莫妮卡研究中使用的症状和诊断标准。心肌梗死的诊断标准包括临床症状、心电图、心脏酶和冠心病。中风的诊断是基于既往症,临床症状,CT /捷运,血管造影,腰椎穿刺,超声心动图,多普勒,和心电图,加上成像技术可用。参与者和沉默的心血管事件发生后28天内没有记录被排除在外,non-verifiable病例分析。

统计数据

数据准备

中等分数的covariable信息不见了(腰围,n失踪= 2;身体质量指数,n失踪= 12;血脂、n失踪= 82;血压,n失踪= 148)。单一的归责被用来转嫁这些缺失值,应用“预测意味着匹配法”从SAS过程PROC MI。”预测意味着匹配法”将信息从其他covariables预测缺失值,与线性回归相比,通常产生更合理估算变量分布95年。下列变量导致缺失值的预测:事件案例(T2D / CVD)随访期间(是的,没有),性别、年龄、身高、吸烟、休闲体育活动(运动、骑自行车、园艺),药物治疗(降压、降脂、阿斯匹林),普遍的疾病状态(T2D CVD),总能量摄入量,摄入的全麦面包、谷物片,谷类,牛奶什锦早餐,新鲜水果,生蔬菜,煮熟的蔬菜,坚果,咖啡,高能量饮料,鱼,红肉和加工肉类,酒精消费总量和受教育程度。

吸烟在四类建模(从不吸烟,烟民,当前吸烟者< 20单位/天,当前吸烟者≥20单位/天)。饮酒是建模在六个性别摄入量类别。人的酒精消费大类:饮酒,0 - 6 g / d > 6 - 12 g / d > 12 - 24 g / d > 24-60 g / d, > 60 - 96 g / d, > 96 g / d。酒精在女性消费大类:饮酒,0 - 6 g / d > 6 - 12 g / d > 12 - 24 g / d > 24-60 g / d, > 60 g / d。咖啡摄入量每天建模为杯(150毫升)和肉类的摄入量是克每一天。受教育程度在三类建模(或没有职业培训/职业培训,技术大学学位,大学学位)。休闲体育活动建模为周平均工作时间。禁食状态被建模为一个二进制变量(≥8 h, yes / no)。

失踪的一些参与者(dh)神经酰胺值(dhCer14:0三张,5 dhCer18:1和20:1每个参与者总计13日)被排除在分析,包括这些变量。(dh)往往是right-tailed神经酰胺浓度。因此,我们对数转换(dh)神经酰胺的浓度,导致近似正态分布,z-scaled对数转换值。因此,所有回归估计每SD报道。

Prentice-weighted Cox模型(dh) ceramide-cardiometabolic case-cohort风险分析

之间的关联(dh)神经酰胺和疾病风险评估在Cox比例风险随着年龄增长回归模型作为基本的时间尺度。研究出口是由糖尿病或心血管疾病的诊断,辍学,或审查时间,哪个是第一位的。case-cohort设计被普伦蒂斯占权重96年。

的NetCoupler-algorithm

我们旨在估计(dh)的直接影响神经酰胺代谢疾病疾病风险,不可能简单地归咎于相关神经酰胺代谢产物的影响。因此,我们开发了一个图形化的基于模型的方法,NetCoupler-algorithm32。在第一步,我们估计一个网络模型条件的依赖性,边表示两个之间协方差(dh)磷脂质,不能解释为调整其他的子集(dh)神经酰胺。为此,我们应用一个因果结构学习PC-algorithm order-independent实现36,97年。由此产生的网络图形编码的家庭产生的因果模型,可以观察到有条件的独立结构,即。的骨架数据生成DAG。这种有条件的独立网络被用来检测单个代谢物和发病率之间的联系,不能解释为混杂的影响通过其他(dh)神经酰胺。根据定义,至少一个子集的直接邻居就足以阻止混杂整个网络35。然而,足够调整集不能被明确地从图像读取因为边缘没有导演。因此,NetCoupler-algorithm遍历每个代谢物通过调整所有可能的组合的直接网络邻居。代谢物就只分为直接效应与发病率是否健壮的所有这些子模型(补充图。4)。与发展的实现进行了分析(根据客户要求提供)。我们提供详细的文档和现成的软件实现的NetCoupler-algorithm在GitHub (R统计编程语言https://github.com/NetCoupler)。

任何可能对神经酰胺之间的边缘检测是基于依赖的α水平0.05,其他天然保湿因子的调节在任何子集学习网络。评估每个神经酰胺与发病率的直接联系,迭代使用Cox模型。因此,每个神经酰胺与time-to-disease-incidence,调整神经酰胺的所有可能组合的直接邻居网络。所有模型都是另外调整总神经酰胺和总dihydroceramide浓度,在岁(地层变量),性别、身高、腰围、休闲体育活动,禁食状态,抗高血压药物,降脂药物,阿司匹林,总能量摄入量,吸烟、饮酒、教育、等离子体浓度的甘油三酯,总胆固醇,收缩压和舒张压;baseline-prevalent T2D病例被排除在糖尿病风险模型,和心血管疾病风险调整的模型。神经酰胺是定向一致和统计上显著(α< 0.05)与疾病相关联的端点在所有neighbor-adjusted模型归类为直接影响。因为他们只能混杂因素而不是调停者,每一个新发现的直接效应神经酰胺是包含在固定调整设置,并重复这个过程,直到没有进一步直接影响被检测到。最后,对于每个端点,选择直接变异(dh)神经酰胺同时包含相同的Cox模型,调整上述定义的全套covariables,呈现相互调整疾病风险比率。

全基因组关联研究

软件QCtool v1.4被用来过滤的SNP SNP缺失率(删除≥0.05),最小等位基因频率(加)(删除区间[0.05 - -0.5]),和哈迪温伯格平衡(−log10(删除p值)≥3)。然后,我们使用SNPtest v2.5.2探索性单变体协会分析(n~ 5339213标记),曝光和对数转换z-standardized (dh)神经酰胺作为一个结果。我们认为p值低于10−5提示地重要。我们假定一个频率论的加性遗传模型(方法预期:基因型剂量),根据招聘年龄和性别进行调整。变量映射到运用注释版84 (GRCh37)98年,我们运用变异效应预测用于注释99年。

GWAS的Cer18:0、Cer20:0 Cer22:0,我们执行查找与部分未发表的研究结果从EUROSPAN(欧洲特殊人群研究网络:定量和利用遗传变异基因的发现,n= 4034),涉及五个欧洲人关注的一个财团的基因组学> 300表型包括lipidomics,测定在临床化学和实验室医学研究所,雷根斯堡大学医学中心(德国)、使用电喷雾电离串联质谱谱/ MS)在正离子模式。遗传协会测试脂质和等位基因之间的剂量使用混合模型方法进行了实现“mmscore”选项在GenABEL软件。五个人口的结果结合使用方差倒数加权固定后果模型荟萃分析使用金属软件。其他(dh)天然保湿因子与代谢疾病相关的风险在EUROSPAN EPIC-Potsdam并不可用。挑逗性的我们也比较重要的GWAS结果在EPIC-Potsdam Cer22:0发表SNP-Cer22:0从弗雷明汉心脏研究的后代群体协会(n= 2217)。为此,我们提取β和估计p值从表2在出版Cresci et al。39。其他(dh)天然保湿因子与代谢疾病相关的风险EPIC-Potsdam在弗雷明汉心脏研究的后代没有可用的队列。

我们汇总的数据用于协会ceramide-associated snp T2D经糖尿病基因复制和荟萃分析(图)财团,包括32研究共有898130人(74124年T2D和824006没有)的欧洲血统41。资源,单体型参考财团参考面板用于所有组件研究除了解码,这是估算使用特定人群参考面板(30440冰岛单)41。我们使用BMI T2D数据没有调整。EPIC-Potsdam GWAS数据包含在EPIC-Interact财团,贡献GWAS数据用图表分析。EUROSPAN和FHOCS军团没有贡献的图数据利用出版41。

通路富集分析

我们使用GSA-SNP2软件基于GWAS的基因集富集分析p值40。这个工具使用Z随机集的统计模型。我们使用了一个20千碱基窗口上游和下游基因的SNP基因注释和删除相邻基因在欧洲人口高度相关。我们使用途径MSigDB C2的注释。CP(curated canonical pathways) version 5.2 databaseOne hundred.,其中C2规范化路径数据库,它由1329年策划基因集代表了领域专家编制的生物过程101年,102年。从这个知识的来源,我们选择途径与T2D(以前发表的黄金标准T2D的途径40)和心血管疾病(由我们定义的路径,在统计学上显著富集的心电图GWAS数据(42335例心血管疾病病例和78240例对照))103年。途径与问值< 0.25被认为大大丰富。

孟德尔随机化

我们进行了单变量两个示例研究先生与Cer22:0表型和T2D的结果41。我们只进行了一次先生在假定的Cer22:0影响T2D的风险,因为它是唯一的神经酰胺挑逗性的全基因组显著snp检测EPIC-Potsdam和复制在一个独立的研究。我们选择最强的SNP Cer22:0协会EPIC-Potsdam可用在复制数据集作为一个单变量的工具变量先生和协调数据的方向影响表型和端点之间的关联。我们使用r程序“TwoSampleMR”(v0.5.5) MR-Base平台104年和“MendelianRandomization”(v0.5.0)生成特定SNP沃尔德比率(SNP-endpoint估计除以SNP-phenotype估计)phenotype-endpoint关联。

中介分析

我们使用食用红肉和咖啡消费的潜在影响T2D风险探索(dh)神经酰胺作为潜在的作用介质对代谢疾病风险的生活方式的影响。这些曝光选择因为他们导致T2D-prediction以外的其他风险因素建立EPIC-Potsdam研究105年,106年,107年,假设这些曝光行动通过修改生物脂质代谢是合理的。在第一步中,我们选择潜在的利益由回归ceramide-mediators食物所有T2D-related天然保湿因子,调整了潜在的混杂因素(年龄、性别、T2D-related膳食暴露除了曝光(设置的红肉和加工肉类,咖啡,和全谷物),禁食状态,总能量摄入量,休闲体育活动,药物(降压和降脂药物),吸烟(四类,不,前、当前<每天20单位、当前>每天20个单位),饮酒,和教育)。T2D-related神经酰胺被选为潜在的调停者,如果他们在统计学上显著和定向一致(片面p值< 0.05)相关的风险。

然后,我们估计可辩解的比例(PE)的衰减百分比之间的关系曝光(食品集团或人体测量特征)和结果(T2D风险)Cox模型调整为选定的神经酰胺相比,相同的模型没有神经酰胺的调整,使用增量方法24,108年,109年。PE的偏差纠正引导95%置信区间由的bcajack-function bcaboot包(CRAN.R-project.org/package=bcaboot) 1000年复制和三分之二的抽样比例。

软件

统计分析系统(SAS)的企业指导与SAS 7.1版本9.4 (SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)是用于管理和准备数据集和改变脂质值。的pcalg-package R(3.5.2版(2018年12月20日))和发展版本的NetCoupler-package(可以从M.B.S.和漫画请求)被用来生成代谢物网络和联系他们疾病的发病率。QCtool v1.4, SNPtest v2.5.2110年被用于GWAS脂质。先生进行了研究使用“TwoSampleMR”(v0.5.5) MR-Base平台104年和“MendelianRandomization”(v0.5.0)111年包R(3.6.3版本(2020年2月29日)。中介分析进行了R(3.5.2)(2018年12月版)。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与这篇文章有关。