文摘
临床的布鲁顿的酪氨酸激酶(对)杀人案抑制剂ibrutinib,目标B细胞抗原受体(BCR)控股integrin-mediated保留growth-supportive淋巴器官的恶性B细胞微环境,提供淋巴瘤和白血病治疗的重大突破。不幸的是,相当一部分的病人或获得抵抗ibrutinib内在的抵抗力。这里,发现新药,我们提出一个无偏loss-of-adhesion CRISPR-Cas9淘汰赛筛查方法确定蛋白质参与BCR-controlled integrin-mediated附着力。说明我们的方法的有效性,几个激酶建立BCR-controlled粘附作用,包括对和PI3K杀人案,临床应用抑制剂,目标都是在前点击我们的屏幕。我们预计,药理抑制剂的发现目标,如。PAK2和PTK2B / PYK2,可能有很大的潜在临床治疗淋巴瘤和白血病患者。此外,这个筛选平台高度灵活,可以很容易地适应识别细胞adhesion-regulatory蛋白和信号通路对其他刺激,粘附分子和细胞类型。
介绍
在过去的十年中,B细胞抗原受体(BCR)的引入signalosome inhibitors-viz。布鲁顿的酪氨酸激酶(对)杀人案和PI3K inhibitors-provided重大突破在B细胞恶性肿瘤的治疗中,客观反应率为70 - 90%1,2,3,4,5,6,7,8。在许多B细胞恶性肿瘤,如慢性淋巴细胞白血病(CLL),套细胞淋巴瘤(制程)和Waldenstrom巨球蛋白血(WM),这些药物并不直接细胞毒性,而是导致动员保护性的淋巴器官的恶性B细胞微环境的循环,导致细胞死亡由于缺乏生长和存活的信号2,3,4,5,6,7,9,10,11,12,13。
慢性淋巴细胞白血病的保留、制程和WM淋巴细胞环境是由整合素介导的粘附分子,由BCR信号控制。BCR信号在正常和恶性B细胞被激活的同源抗原在淋巴组织,并唤起增殖,生存和分化信号,通过粘着斑以及保留在淋巴组织复杂的形成。以前,我们和其他人证明针对BCR-controlled integrin-mediated粘连基础BCR-signalosome抑制剂在慢性淋巴细胞白血病的临床疗效,制程,WM9,10,11,12,13。
目前最常见的临床应用BCR-signalosome抑制剂对抑制剂ibrutinib杀人案,acalabrutinib, zanubrutinib。在长期治疗,然而,一个病人发展抵抗这些抑制剂的重要子集14,15,16停药后,ibrutinib慢性淋巴细胞白血病患者中位总生存期只有3个月17。最常的耐药性是由获得突变对或其衬底PLCγ2杀人案16,18,19,20.,21,22,23,24,25,证明BCR-signaling BCR-integrin轴(可能)不轻易绕过其他途径在这些B细胞恶性肿瘤。虽然PI3Kδ抑制剂idelalisib(δ)duvelisib(γδ)和copanlisib(αδ)也显示良好的临床活动B细胞恶性肿瘤,特别是前两个药物可能会导致严重的副作用26。因此,有一个未满足的需要新型制药的目标。
无偏CRISPR-Cas9淘汰赛屏幕在癌症研究中是一个伟大的附加值为特定的肿瘤类型,找到漏洞克服耐药性,找到合成致命的交互。到目前为止,大多数的这些功能屏幕对细胞生长和生存能力评估生物效应。这里,我们目前的发展loss-of-adhesion CRISPR-Cas9淘汰赛筛选方法来识别目标参与BCR-controlled integrin-mediated恶性B细胞的粘附。展示屏幕的有效性和质量,几个已知目标BCR-controlled integrin-mediated附着力,如对,杀人案PI3K,麦克米兰也跻身前10支安打的屏幕。我们应用CRISPR屏幕提供见解BCR-controlled integrin-mediated监管(恶性)B细胞的粘附,此外,确定几个淋巴瘤治疗的目标。此外,开发筛选平台可以很容易地用于功能基因组研究旨在识别细胞adhesion-regulatory蛋白质其他刺激,粘附分子和细胞类型。
结果
代的稳定Cas9-expressing细胞
为loss-of-adhesion CRISPR屏幕,我们使用B细胞系Namalwa,因为本质特征的重要性我们的屏幕,这个细胞行显示优秀BCR-stimulated integrin-mediated粘附纤连蛋白,与其他B细胞系,并不依赖于BCR信号对细胞生长和生存10,27。达到一个最优的转导效率CRISPR-guide图书馆,我们使用一个对偶向量系统,包括lentiCas9和lentiGuide-derived库28。在与LentiCas9转导,选择Namalwa克隆最佳BCR-stimulated粘附能力分析(补充图。1),Cas9表达式和活动,通过慢病毒Cas9-reporter决定29日(补充图。1罪犯)。Cas9活跃于99%以上的细胞克隆# 10,这是汇集筛选的关键。
BCR-controlled loss-of-adhesion CRISPR屏幕与kinome-centered CRISPR-Cas9图书馆
识别激酶参与抗原/ BCR-integrin轴,我们执行一个loss-of-adhesion CRISPR屏幕与慢病毒厂商激酶组,(比如)为本CRISPR-guide库。图书馆并在选择Cas9-expressing Namalwa克隆(克隆# 10)感染复数为0.3,表示至少有1000次库大小(图。1)。嘌呤霉素选择2天后,转导细胞培养,直到可行性恢复> 90%(6天)。立即在粘附实验之前,pre-adhesion样本。粘附的屏幕我们使用纤连蛋白作为整合素配体自粘附纤连蛋白是由α介导的4 -和α5整合蛋白而粘附血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)仅限于α4整合蛋白,由于VCAM-1与纤连蛋白不同,有一个非常狭窄的浓度窗口最佳附着力。细胞在一个实验的手臂被刺激αIgM(模仿antigen-induced BCR结扎)并允许坚持fibronectin-coated井。在第二个手臂,细胞被刺激与phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA),甘油二酯模拟激活PKC远侧地的BCR signalosome(见图。2),也可以坚持纤连蛋白。后删除非或弱粘细胞广泛的洗涤,即。,until unstimulated cells in control wells were completely removed, the adhered cells were harvested by EDTA-mediated detachment (integrin-mediated adhesion is calcium and magnesium dependent).
一个试验装置的loss-of-adhesion CRISPR屏幕。Namalwa细胞转导与该厂商在莫伊kinome-centered图书馆0.3和代表性>库大小的1000倍。嘌呤霉素选择后,细胞生长直到可行性恢复(> 90%)。细胞被刺激αIgM或PMA,并允许坚持fibronectin-coated表面。广泛洗涤后,强烈坚持与EDTA细胞被分离。从这些细胞基因组DNA是孤立的,导游的存在是由条形码PCR和Illumina公司下一代测序(门店)。与DESeq2αRRA(从MAGeCK),分别统计得到指导和基因水平。有关详细信息,请参阅在线方法部分。模型是由MFM de罗阿。bNamalwa屏幕结果指导和基因水平。左:马情节,平均归一化读计数参考样本(x设在)和褶皱的变化(y设在);右:火山地块,中隆指导每个基因的改变(x兑αRRA设在)depeletion/αRRA浓缩分数(y设在)要么αIgM-induced附着力相对于pre-adhesion(上),PMA-induced附着力相对于pre-adhesion(中心)和αIgM-induced附着力相对于PMA-induced附着力(底部)。3的屏幕进行独立的复制。源数据作为源数据文件提供。
一个BCR信号通路。蛋白质由导游在布鲁内库所示黑色。相对应的指导激酶(相关的)基因编码的蛋白质在黄色字母明显减少αIgM-induced粘连和PMA-induced附着力,在蓝色的字母相对应的指导蛋白质显著减少αIgM-induced PMA-induced粘连,在白色的字母和相对应的指导蛋白质既不显著减少的。Ag)抗原(αIgM) BCR B细胞受体,皮普2phosphatidylinositol-4 5-diphosphate,皮普3phosphatidylinositol-3 4 5-triphosphate, DAG甘油二酯,IP3inositol-1 4 5-triphosphate, Ca2 +胞质钙离子、PMA phorbol-12-myristate-13-acetate GMP / GDP三磷酸鸟苷guanosine-mono / di /三磷酸盐。模型是由MFM de罗阿。b比较药理抑制剂与相应的积极的和消极的控制指导BCR-controlled附着力。情节:Namalwa细胞使用100 nM ibrutinib(对抑制剂杀人案),1μM fostamatinib麦克米兰抑制剂),100 nM渥曼青霉素(pan-PI3K抑制剂),50μM pd - 98059 (MEK1/2抑制剂),2.5μM mk - 2206 (AKT1/2/3抑制剂),或DMSO控制,与αIgM或PMA刺激,可以坚持fibronectin-coated表面。酒吧图表给出了归一化意味着+ SEM(100% =未经处理的αIgM-stimulated细胞)。P调整值P值从双向方差分析之后,图基HSD事后考验(双尾和配对设计),7个独立的实验中每个化验一式三份。底情节:马块αIgM-induced附着力相对于PMA-induced附着力;指导相应的基因靶向抑制剂的情节突出显示。三个独立的屏幕进行复制。统计数据与DESeq2执行。源数据作为源数据文件提供。
量化的指导和post-adhesion样本是由运用基因组DNA条形码PCR,紧随其后的是下一代测序30.,31日。从读、条形码和引导序列被确定及其丰度决定。DESeq2管道32应用于指导水平获得统计计数表。其次是αRRA(从MAGeCK管道33)获得的统计数据在基因层面的指导统计(图。1)。屏幕3独立执行复制,pre-adhesion,αIgM-induced粘连,PMA-induced粘附样本配对。的R平方之间的每个条件的独立复制的阅读数量是85.5 - -92.2%(补充图。2),证明高重现性和良好的维护图书馆的复杂性。
验证屏幕的正面和负面的控制基因,包括建立介质BCR-controlled整合素激活
解决我们的屏幕的性能,我们首先确定负控制基因的行为。消极的控制,通过类比哈特等人所定义的非必需基因功能基因组杀伤力屏幕34指南中,我们采用基因代表图书馆但不表达Namalwa(补充图。2 b)。马的情节,这些负面的分布控制指导属于云与褶皱log2规模的变化通常在-0.5和0.5之间(图。1 b)。基因参与细胞生存能力被确定通过比较阅读项pre-adhesion样本库的分布(补充图。2摄氏度)。细胞line-specific控制行为类似于(有限)Hart-defined必需和非必需的控制34(补充图。2 c, d)。正如所料,生存能力的基因强烈影响αIgM和PMA-stimulated附着力(无花果。1 b),如不能存活的细胞就粘不住。
通过对比αIgM——PMA-stimulated手臂,造成的“噪音”指导,减少可行性强烈减少(图。1 b底部面板)。重要的是,在这个比较对,杀人案PI3K,麦克米兰,代表BCR signalosome的建立至关重要的激酶9,10,11,12,13,27(无花果。2),排名在前10名贫基因(见图。4);他们显然分开火山云的情节(无花果。1 b),罗斯福< 0.1。与之形成鲜明对比的是,指导针对MEK和一种蛋白激酶激酶,曾被证明不参与抗原/ BCR-integrin轴10,27(无花果。2),没有耗尽(图。1 b)。的能力(或残疾)抑制αIgM-induced粘附药理抑制剂对这些目标很好地反映了导游的损耗(或不)针对相应的基因(图。2 b)。值得注意的是,我们确定了PIK3R1,编码p85调节亚基的催化PI3K子单元p110αp110δ,作为一个积极的监管机构的附着力。相比之下,p110α或p110δ没有显著减少αIgM / PMA比较,表明在Namalwa功能冗余。这是在协议与我们的研究结果与药理抑制剂:具体PI3Kδ抑制剂idelalisib没有抑制BCR-controlled Namalwa附着力,与制程细胞株的抑制观察JeKo-1,但pan-PI3K抑制剂渥曼青霉素抑制粘附(补充图。3)。
其他蛋白质参与BCR信号的识别
BCR结扎,林恩介导激活信号,如磷酸化的CD79A / B ITAM动机,麦克米兰,对(图杀人案。2)。然而,它还教唆负面的反馈信号,通过磷酸化immunoreceptor tyrosine-based抑制动机抑制性受体,导致招聘磷酸酶船和SHP1/2等35。在我们的屏幕上,指南针对林恩没有显著减少(图3),这表明激活信号通过林恩是多余的。符合这个概念,而丧失突变对导致免疫缺陷,杀人案的功能丧失的突变林恩,而导致自身免疫36。酪氨酸激酶埋头,SRC家族的一个重要负调节激酶等林恩(无花果。2)37在αIgM手臂,退出明显强于PMA臂(图。3)。这表明,林恩的负反馈调节埋头BCR-controlled粘连可能是重要的。有趣的是,埋头也遭到ibrutinib IC50低摩尔范围38。
指南的目标PRKCB,ACTR2,GUK1显著减少在两αIgM——以及PMA-stimulated附着力(无花果。3)。事实上,这些基因编码的蛋白质的功能更多的远侧地抗原/ BCR-integrin轴(无花果。2)。PKCβ-isoform (PRKCB)参与αIgM PMA-induced粘连,而ε-isoform PKC (PRKCE)更重要比PMA-inducedαIgM附着力(无花果。3)。ARP2/3 (ACTR2)是参与肌动蛋白聚合,这是重要的粘着斑复杂,GUK1参与三磷酸鸟苷生物合成,这是很重要的对于integrin-regulatory gtpase RAP1等ρ,和RAC(无花果。2)。然而,这些基因减少临床潜在的因为他们的普遍表达式。此外,在长期的杀伤力屏幕的淘汰赛GUK1和ACTR2在测试我们所有的细胞系是致命的,在公共场合CRISPR屏幕来自depmap.org的数据。
监管机构的识别BCR-integrin轴
识别蛋白质参与(近端)BCR-integrin轴,我们选择的基因与罗斯福< 0.1αIgM / PMA的比较。我们称为20重大打击,其中4基因(PAK2,PKM,CRKL,PTK2B)具有类似或更好的褶皱变化的积极控制基因(BTK,PIK3R1,麦克米兰)(图。4和补充图。4)。重要的是,指导对这些基因的辍学不是由于受损细胞生存能力(补充图。5)。想象他们的具体影响αIgM-controlled粘附而不是PMA-controlled粘连,我们从αIgM策划中隆的变化——与PMA-controlled附着力:20个基因的通用云和距离显著低于斜(无花果。4 b)。从上述4大2基因克隆的最佳指南,根据退出屏幕,验证影响αIgM——PMA-controlled Namalwa附着力。基因敲除证实了免疫印迹分析(补充图。6)。一般来说,一个好的个人褶皱变化之间的相关性观察的指导CRISPR屏幕和验证实验的相对粘附水平(无花果。4摄氏度和补充图。6 b)。的验证PKM(丙酮酸激酶M1/2)发散的屏幕,最有可能造成的直接细胞毒性由于受损的糖酵解,导致在PMA-stimulation粘附水平低于预期,以及竞争的产物PKM精通细胞(由于在坐标系indels或subclonally CRISPR-Cas9活动)不足,导致在αIgM-stimulation粘附水平高于预期。
一个Log2褶皱变化指南(蓝线)针对所有重要的近端BCR-integrin信号。重要退出基因识别从αIgM / PMA Namalwa屏幕上的数据。αRRA基本分数损耗分数。图表显示的结果αIgM-induced附着力相对于pre-adhesion(左),PMA-induced附着力相对于pre-adhesion(中间)和αIgM-induced附着力相对于PMA-induced附着力(右)。b褶皱中值的变化中8指导基因kinome-centered布鲁内库从PMA-induced粘附的手臂被谋害的αIgM-induced粘附的Namalwa屏幕3独立执行复制。黑色所示的重要基因,点的大小对应于αRRA的倒数损耗分数。c个人的褶皱变化指南从Namalwa屏幕(DESeq2计算最大似然估计(企业)来确定褶皱的变化从3独立复制)被谋害的平均附着水平验证分析(n图所示S6B)。黑暗的灰色区域表示95%置信区间,和浅灰色区域95%的预测区间。sgNT代表的新指南,sgNEG指导对非/ BRDT non-expressed基因。dNamalwa和JeKo-1细胞表明淘汰赛中或1 h与表示药物预处理,αIgM或PMA刺激,可以坚持fibronectin-coated表面。的平均抑制粘附(∆粘连),而DMSO溶液治疗或控制指南(sgNEG)独立的附着力检测提出了一个热图(n和P值显示在无花果S6B)。源数据作为源数据文件提供。
接下来,我们调查了4点击率最高JeKo-1细胞,一个制程的细胞系BCR-controlled附着力(无花果。4 d和补充图。6 a、b)。因为淘汰赛PAK2和PKM在JeKo-1有毒,PMA-induced附着力也影响和淘汰赛功效是次优的,由于精通细胞的选择性的产物(补充图。6 a、b)。因此,为了进一步调查的作用PAK2我们采用药理PAK2抑制剂AZ13705339和FRAX597。在Namalwa AZ13705339抑制αIgM-controlled粘附而不是PMA-induced粘连,类似于CRISPR-mediated的效果PAK2淘汰赛和ibrutinib治疗,FRAX597也抑制αIgM-controlled附着力,结合弱毒性,而两个PAK-inhibitors并不影响αIgM-controlled JeKo-1细胞的粘附(补充图。6 b)。这一打击BCR-integrin JeKo1轴心是守恒的CRKL:淘汰赛CRKL是非常有效的,而不是有毒,αIgM-controlled粘附强烈受损,而PMA-controlled附着力(图未受到影响。4 d和补充图。6 a、b)。此外,基因敲除的PTK2B(也称为PYK2或FAK2)还没有在JeKo-1有毒,并降低αIgM-controlled附着力弱而不影响PMA-stimulated附着力(无花果。4 d和补充图。6 b)。此外,PTK2B被发现中发挥突出作用WM细胞系BCWM.1 BCR-controlled粘连(补充图。6摄氏度)。最后,我们研究一个重要的打击从屏幕上小褶皱的变化,脂质激酶PIKFYVE采用药理YM201636 PIKFYVE抑制剂。Namalwa不出所料,预处理,而且JeKo-1αIgM-controlled YM201636显示一个小的减少粘连,而PMA-controlled粘连(图的影响。4 d和补充图。6 b)。综上所述,这些药理和CRISPR-based研究充分证明CRISPR屏幕识别蛋白质的角色BCR-controlled integrin-mediated附着力。
讨论
在这项研究中,我们已经开发出一种无偏CRISPR筛选平台,积极的和消极的细胞的识别adhesion-regulatory蛋白质和信号通路,我们已经成功地进行了一次loss-of-adhesion CRISPR屏幕识别激酶参与抗原/ BCR-integrin轴。我们的屏幕是高质量的,因为我们发现所有已知激酶参与抗原/ BCR-integrin轴,两个近端激酶,如对,杀人案PI3K,麦克米兰,以及远端激酶(相关的)的蛋白质,如PKC和ARP2/3(参与肌动蛋白聚合)1,27。注意ARP2/3不是一个激酶复杂,但ARP2包含一个腺苷结合域的atp酶活性。我们已经表明,药物抑制这些激酶损害BCR-controlled integrin-mediated粘连体外,符合慢性淋巴细胞白血病的临床观察淋巴球增多,制程,和WM病人,反映了动员保护性的淋巴器官的恶性肿瘤细胞微环境的循环,导致剥夺关键增长生存因子,其次是淋巴瘤回归2,3,4,5,6,7,9,10,11,12,13。
除了已知的BCR signalosome蛋白质,我们确定的几个监管机构BCR-integrin轴。最重要的在近端BCR-signaling(αIgM / PMA)PAK2(p21-Rac1激酶激活2)。PAK2徒RAC1下游参与肌动蛋白重塑39,并可能参与BLNK-VAV-RAC1-PAK2-paxilin轴。自PAK2敲除或者药物抑制并不影响BCR-controlled附着在每个B细胞系,这个信号的手臂似乎是一个修饰词途径而非规范的途径。第二个影响是PKM(丙酮酸激酶M1/2)参与糖酵解。淘汰赛的糖酵解PKM和PGK1(排名# 9),负责细胞ATP生产,只有αIgM-controlled附着力的影响,而淘汰赛GUK1参与三磷酸鸟苷生产,影响了αIgM PMA-controlled粘连。这将支持对小型gtpase主导作用,需要三磷酸鸟苷,而不是蛋白质激酶,需要ATP, PKC的下游(无花果。2)。因为三磷酸鸟苷和ATP是同样重要的组件在RNA合成和代谢,淘汰赛GUK1,PKM,PGK1将高致命性的长期;因此,这些基因在附着力的作用很难验证CRISPR-mediated击倒,但他们也有低的临床潜力。额外的点击率最高的Namalwa CRISPR屏幕是适配器的分子CRKL(CRK-like原癌基因)和non-receptor蛋白质酪氨酸激酶PTK2B(又名PYK2和FAK2)。两个蛋白质与RAP1 B细胞的信号40,41,提供了一个潜在的分子与整合素活动(图。2)。此外,这两个蛋白被发现调解BCR-controlled粘附在其他B细胞系。
确定了多个基因参与(近端)BCR信号和BCR-controlled integrin-mediated附着力,我们的研究结果提供慢性淋巴细胞白血病的治疗目标,制程,和WM依靠BCR-controlled恶性细胞的粘附在淋巴组织保留和生存。更具体地说,这些目标可能在患者的主要临床潜力(内在)ibrutinib-resistance或者与ibrutinib联合治疗,进一步提高淋巴组织的动员居民恶性B细胞和/或避免或克服的发展二级(收购)ibrutinib阻力。
虽然个别指导的褶皱变化在大多数杀伤力屏幕不一样高24指数增长,每个细胞分裂原因退出之间的叠化和非功能性指南,DESeq2紧随其后αRRA还是很健壮的识别的重大打击。此外,中隆改变一个特定基因的指南是高度预测的抑制程度验证分析。CRISPR干扰因素粘连屏幕是生存基因以一种间接的方式会影响附着力。一般来说,除了杀伤力屏幕,这将阻碍解释所有功能CRISPR屏幕的功能可能受到损伤细胞的生存能力,如信号屏幕。为了克服这个问题,可以过滤掉这些基因与远端刺激包括额外的实验机构——在我们的例子中手臂PMA-stimulation——和计算褶皱的变化与此示例参考。如果这是不可能的,我们建议执行并行杀伤力屏幕识别基因细胞生存能力的关键。
这里描述的筛选技术可以很容易地适应研究其他细胞,细胞adhesion-promoting刺激(例如,趋化因子,生长因子或细胞因子),细胞粘附分子(如其他整合蛋白/子单元,钙粘蛋白,或selectins)及其配体(细胞或细胞外基质),而且还可以识别的细胞adhesion-regulatory信号通路在培养环境潜在的未指明的信息交互。举个例子,我们最近使用这个平台进行成功loss-of-adhesion CRISPR屏幕整合素α4β1多发性骨髓瘤细胞介导粘附在刺激VCAM-1趋化因子受体CXCR4的趋化因子CXCL12。
总之,我们已经开发出一种功能强大且灵活的loss-of-adhesion CRISPR筛选平台识别和分子解剖信号通路(s)潜在的细胞粘附,包括BCR-controlled integrin-mediated附着力。这个途径对antigen-controlled保留至关重要的恶性细胞保护和促生长微环境中各种类型的B细胞恶性肿瘤,如慢性淋巴细胞白血病、制程和WM9,10,11,12,13。类似于对抑制剂如ibrutinib杀人案,治疗抑制剂对额外的目标抗原/ BCR-integrin轴可能提供伟大的淋巴瘤和白血病患者的临床疗效。
方法
材料
以下试剂被用于这项研究。质粒:psPAX2 (Addgene # 12260), pMD2。G (Addgene # 12259) pGFP-N3 (Clontech) lenti-Cas9-BSD (Addgene # 52962), Cas9-reporter (Addgene # 67980), lenti-Guide-Puro布鲁内激酶组库(Addgene # 1000000082)。抗体:鼠标anti-Cas9(克隆7 a9-3a3 # ab191468 Abcam), phycoerythrin-conjungated山羊F (ab)2anti-mouse IgG1(多克隆,# 1072 - 09年,南方生物技术),山羊F (ab)2反IgM勒/ AF(多克隆,# 2022 - 14,南方生物技术),鼠标anti-CRKL(克隆32 h4, # 3182,细胞信号技术),兔子anti-PAK2(# 2608多克隆,细胞信号技术),兔子anti-PKM2(# 3198多克隆,细胞信号技术),兔子anti-PTK2B(# 3292多克隆,细胞信号技术),鼠标anti-BTK(克隆53 /对,杀人案# 611117,BD转导实验室),鼠标anti-β-actin(克隆AC15, # A1978 Sigma-Aldrich),鼠标anti-β-tubulin(克隆D66, # T0198 Sigma-Aldrich)、山羊anti-mouse-HRP(多克隆,# P0448 DAKO)和鼠标anti-rabbit-HRP(多克隆,# P0260 DAKO)。药理抑制剂:ibrutinib idelalisib、FRAX597 YM201636 (Selleck化学物质),R406和mk - 2206 (MedChem表达),pd - 98059和渥曼青霉素(Sigma-Aldrich)和AZ13705339 (Tocris生物科学)。杂项:BsmBI(新英格兰生物学实验室),嘌呤霉素(Sigma-Aldrich),灭瘟素盐酸盐(ThermoFisher),牛血清白蛋白分数V(罗氏),人类血浆纤连蛋白和poly-L-lysine氢溴酸盐(Sigma-Aldrich),线性表面进行25 K (Polysciences), ethylenediamine-tetraacetic酸(默克公司)。
细胞培养
Namalwa (DSMZ # ACC24) JeKo-1 (DSMZ # ACC553)和BCWM.1(请提供……Treon)培养在IMDM补充10%胎牛血清(HyClone)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素。hek - 293 t / 17(写明ATCC # CRL11268)是培养与10%胎牛血清的DMEM补充谷氨酰胺和青霉素和链霉素。身份验证的细胞系及其派生Cas9克隆是由STR分析(Promega Powerplex 16日)其次是DSMZ在线STR匹配分析。细胞培养是定期检测支原体污染为阴性42。Cas9-expressing细胞是现成的。
图书馆放大
,1μg质粒库是electroporated(基因脉冲发生器,Biorad) 1瓶ENDURA electrocompetent细胞(强光油灯)和恢复1毫升SOC中1 h在37°C。从999年μl, 400毫升磅与氨苄青霉素接种,和4 midipreps (Macherey-Nagel)进行和汇集。从1μl,连续稀释(10−3-10年−6镀)。第二天,殖民地被量化。我们的经验法则是殖民地至少1000倍的数量独特的指南在图书馆(kinome-centered布鲁内库28> 6.2×106殖民地),保持图书馆的复杂性。这个库包含6204指导目标763激酶(相关的)基因,其中518蛋白质激酶,20脂质激酶,和225年其他激酶或kinase-related基因(含有ATP绑定域),每个由8指南,以及100年的新控制指南。
克隆
LentiGuide-Puro消化BsmBI和纯化了凝胶萃取(Macherey-Nagel)。单链寡核苷酸(σ)包含引导序列和25元重叠与消化LentiGuide-Puro两侧(补充表1与吉布森)克隆克隆工具(内)。Chemo-competent Stbl3细胞(Thermofisher)被热休克与吉布森产品转化。在minipreps (Macherey-Nagel),质粒被桑格(ABI)测序验证。
病毒生产和转导
hek - 293 t / 17细胞培养在6-well confluency板至80%。总之,1μg psPAX2 0.5μg pMD2。0.1 G,μg pGFP-N3, 2μg转移质粒与8μg混合表面进行400年μl无血清DMEM, 15分钟后,在室温下孵化这种混合添加到细胞。第二天,HEK细胞检查GFP的表达。如果> 50%的HEK细胞GFP阳性,介质被刷新,孵化16 h,过滤(0.45μm)并存储在−80°C。图书馆转导,HEK细胞生长在五T175培养瓶,转染混合物是扩大相对于培养瓶的表面积。
总之,0.5×1062毫升IMDM细胞培养24小时,和转导与100年µl (Namalwa)或500µl (JeKo-1和BCWM.1)慢病毒上清液。第二天中被刷新和转导细胞选择10μg /毫升blasticin 1周,或2.5μg /毫升嘌呤霉素2 - 3天。只有Namalwa-Cas9细胞无性生殖排序(索尼SH800)获得克隆背景附着力较低。所有其他转导细胞多克隆用于防止克隆差异。病毒的效价CRISPR图书馆第一次滴定。筛选、细胞的生存能力的病毒效价(由FSC / SSC番石榴流式细胞分析仪)相对于30%转导细胞没有嘌呤霉素治疗的可行性(因此感染复数(MOI) 0.3),是用于主要细胞单个病毒整合31日(这是通常与lentiGuide-derived 1:30 Namalwa转导的库)。
Cas9胞内流式细胞仪
总之,2×105细胞(Cas9-transduced和亲代细胞)是固定的(解决缓冲区,BD Phosflow) permeabilized(烫缓冲三世,BD Phosflow)和孵化anti-Cas9紧随其后PE-conjugated anti-mouse-IgG1。染色测定FACScanto II流式细胞分析仪系统(美国BD生物科学,圣何塞,CA)界面上的流式细胞仪天后软件(v6.0),并分析了与流乔(v7.6.5)。
Cas9记者
总之,2×105细胞(Cas9-transduced和亲代细胞)相互作用Cas9-reporter慢病毒(pKLV2-U6gRNA5 (gGFP) -PGKBFP2AGFP-W)29日。Cas9活动导致损失GFP的表达,而不是家庭津贴计划”的表情。6天后转导津贴计划”和GFP表达测定FACScanto II流式细胞分析仪系统(美国BD生物科学,圣何塞,CA)界面上的流式细胞仪天后软件(v6.0),并分析了与流乔(v7.6.5)。
附着力试验
的酶进行了化验如前所述10,27。详细、粘连化验都是一式三份96 -好高绑定板块(格林尼)涂在一夜之间与PBS包含在4°C, 2.5μg /毫升纤连蛋白,或15分钟37°C和1毫克/毫升poly-L-lysine,阻塞1 h在37°C和4% BSA RPMI 1640。细胞被使用100 nM ibrutinib 1μM fostamatinib (R406)。100海里渥曼青霉素,50μM pd - 98059,或2.5μM mk - 2206在37°C的1 h RPMI BSA为1%。消极的抑制剂控制,pd - 98059和mk - 2206,被用于浓度强烈阻止分别BCR-controlled ERK和一种蛋白激酶磷酸化27,43。随后,细胞被刺激与100 ng / ml山羊F (ab)2反IgM或50 ng / ml phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)和1.5×105100年细胞立即镀μl / 37°C,孵化出了30分钟。经过广泛的洗板RPMI含有1% BSA移除non-adhered细胞贴壁细胞被固定为10分钟10%戊二醛在PBS和随后染了45分钟了。0.5%的20%的乙醇结晶紫。广泛的洗水后,染料在乙醇和筛选了40分钟后吸光度测量在570 nm分光光度计(ClarioStar)。吸光度由于非特异性粘附,确定井涂以4% BSA-which总是< 10%的吸光度anti-IgM-stimulated细胞减去。最大粘连(100%)是由细胞应用到井涂上poly-L-lysine,没有固定前洗井。粘附的non-pretreated anti-IgM刺激细胞规范化和酒吧代表的意思是+ 100% SEM七个独立的实验中,每个化验一式三份。并给出了数据点以成对的方式从左到右。故事情节在Python中生成(Anaconda3)。
筛选
屏幕3独立执行复制,pre-adhesion, anti-IgM和PMA粘附样本配对。保持图书馆的复杂性,最少的细胞应该至少1000倍的独特的指南在图书馆(kinome-centered布鲁内库28> 6.3×106细胞)。每复制60×106Namalwa细胞转导与lentiGuide厂商kinome-centered图书馆在感染复数(MOI)为0.3。嘌呤霉素后选择在同一细胞密度(untransduced细胞包括嘌呤霉素控制),细胞培养到> 90%的细胞是可行的,和可行的细胞的数量> 80×106Namalwa嘌呤霉素选择后(6天)。12×10的细胞球6细胞被存储在−20°C pre-adhesion样本。总之,30×106细胞被刺激与100 ng / ml山羊F (ab)2反IgM或50 ng / ml phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) IMDM无血清细胞密度为1.5×106/毫升,100μl / (1.5×105细胞)在fibronectin-coated立即镀在37°C井和孵化30分钟(两个96孔板/样本),预期的粘附率为50%。经过广泛的洗板IMDM含有1% BSA移除non-adhered细胞贴壁细胞分离有5毫米EDTA / PBS和细胞颗粒被存储在−20°C。基因组DNA是孤立的细胞球(快速DNA miniprep工具包,Zymo研究)和DNA含量测定量子位氟量计。我们的复苏通常50 - 70%,经验法则的6 pg每个细胞的基因组DNA。
PCR和下一代测序
pcr进行基本描述30.,31日。详细,从每个样本40μg基因组DNA (~ 6.5×106细胞)是用于40 PCR反应(总共2毫升)与Phusion高保真聚合酶(热费希尔)。第一个正向引物PCR包含12个条形码,30.,31日Illumina公司两引物测序引物序列,需要21个周期。40个PCR反应池,从这个池2μl 15周期执行的第二个PCR引物包含Illumina公司P5和P7反向引物序列和条形码。30.,31日质粒测序的图书馆,1 ng质粒用于单一PCR反应第一PCR(50µl)。PCR分析了产品在琼脂糖凝胶和纯化柱(凝胶和PCR净化装备,Macherey-Nagel)。DNA浓度的纯化PCR产品由量子位氟量计。克分子数相等的数量的DNA汇集并受Illumina公司下一代测序。HiSeq2500车道通常包含~ 200×106读取,布鲁内kinome-centered图书馆(6204独特的指南)最多30样品池。
CRISPR屏幕分析和统计
从fastq文件(SRR16971271用Perl)计数表生成。总之,从每个读取条形码和指导序列测定。排序了读取条形码(样品)和独特的指南被数。这些计数表是图书馆的参考表一致。条形码的决心不匹配是允许的,和引导序列的决心没有允许不匹配,但最大的转变三核苷酸被允许(indels造成的合成PCR引物)。
在R中,DESeq2管道32(包括收缩欠褶皱的变化和当地适合估计色散)之后获得统计数据从计数表指导水平。马从这些结果复制的阴谋,阴谋,和指导折叠情节生成变化。获得统计数据在基因层面上,αRRA(从MAGeCK管道33褶皱的变化,指导排名,α-criterionp值)进行DESeq2数据。在好几个屏幕,我们获得了最强劲的结果与这些设置。基于中值指导每个基因的褶皱变化DESeq2数据,从αRRA枯竭和浓缩分数(−log10ρ(耗尽或丰富),火山情节生成。情节在Python中生成(Anaconda3)。(强烈的)生存基因决定通过比较阅读项pre-adhesion样本分布的图书馆(重要:罗斯福< 0.1 DESeq2αRRA)紧随其后。基因与小于1记录每百万(TPM)被定义为在Namalwa non-expressed基因。从Namalwa RNAseq数据(Broad研究所,SRR8615345),从NCBI下载。sra文件转换成一个fastq文件的fastq-dump sra工具包(https://github.com/ncbi/sra-tools,读修剪seqtk (https://github.com/lh3/seqtk),映射到与HiSat2基因组44,映射读取文件(sam)组装和计算Rsubread (featureCounts)45。基因注释和biomaRt测定46,基因数量规范化记录每百万(TPM)。
免疫印迹
蛋白溶菌产物(RIPA-buffer全细胞提取物)分离在螺栓™4 - 12% Bis-Tris +凝胶(表达载体),随后PVDF-membrane涂抹。这些墨迹被封锁在5%牛奶/ TBST和孵化表示主要抗体。主要与山羊anti-mouse-HRP或鼠标anti-rabbit-HRP抗体检测,其次是检测使用皮尔斯™ECL免疫印迹基质(热科学)。所有抗体被用于一个1:1000稀释,除了β-actin 1:5000。
统计和再现性
附着力化验分析R的双向方差分析(方差分析)其次是图基诚实显著差异(HSD)事后测试,使用一个配对设计(res_aov <——自动阀(附着力~刺激*抑制剂+复制,数据=数据);res_thsd < - TukeyHSD (res_aov);padj < - res_thsd刺激:抑制剂的美元),和调整P值显示。方差分析是单侧的性质和图基HSD测试是双尾。
没有统计方法用于预先确定样本容量。没有数据被排除在分析之外。实验并不是随机的。调查人员没有被分配在实验和结果评估。
报告总结
进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与这篇文章有关。
数据可用性
原始CRISPR屏幕数据可用在NCBI SRA数据库加入数字”SRR16971271”。RNAseq Namalwa细胞来自”数据SRR8615345”(Broad研究所)。所有其他相关数据支持这项研究的重要发现都包含在这篇文章,其补充文件或信息从相应的作者在合理的请求。源数据本文提供的。
代码的可用性
R, Perl和Python脚本可以在公众GitHub库(https://github.com/MFMdeRooij/CRISPRscreen/https://doi.org/10.5281/zenodo.6342853)。
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确认
作者感谢软木Lieftink, Roel Kluin, Jan Koster生物信息学的提示和技巧和Marjolein Lansbergen Chayenne Veerman生成一些淘汰赛的细胞。这项工作是荷兰癌症协会的赠款支持(7873 #,10275 #),Lymph&Co和国际Waldenstrom巨球蛋白血基金会(选址)/白血病和淋巴瘤协会(那)硕士和荷兰癌症协会授予R.L.B. (# 12539)
作者信息
作者和联系
贡献
M.F.M.d.R.设计研究,进行实验,生物信息学,分析数据,设计了数据,和写的手稿;Y.J.T.设计研究、进行实验和分析数据;含硝酸钠进行实验;R.L.B.和S.T.P. cosupervised部分的研究;和硕士监督学习和写的手稿。所有作者回顾了手稿。
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相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
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de罗阿,M.F.M.因此,Y.J.而言,N。et al。一个loss-of-adhesion CRISPR-Cas9筛选平台识别细胞adhesion-regulatory蛋白和信号通路。Nat Commun132136 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41467 - 022 - 29835 - y
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