NAFLD和减肥手术对肝脏和脂肪组织线粒体生物发生和呼吸的影响gydF4y2Ba

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与肥胖和2型糖尿病(T2DM)等代谢失调密切相关，已成为世界大部分地区慢性肝病的最常见原因之一gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}．在NAFLD中，脂肪在肝细胞内积聚，但该疾病的病谱广泛，并导致各种表型，从相对良性的非酒精性脂肪性肝(NAFL)，到侵袭性非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最终可能发展为肝硬化gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．尽管进行了广泛的研究，但对驱动不同表型的NAFLD的病理生理学仍然知之甚少gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．然而，肝线粒体功能障碍被认为与NAFL向NASH和纤维化的进展有关gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}与NAFL患者的OXPHOS相比，肥胖和NASH患者的肝组织样本中线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)能力降低gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

内脏(VAT)和皮下脂肪组织(SAT)炎症、-脂肪因子失调和-胰岛素抵抗是肥胖的重要定义特征，也是肥胖相关代谢并发症(包括NAFLD)发展的主要原因gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．例如，在NAFLD中，胰岛素抵抗脂肪组织释放的游离脂肪酸是脂质积聚在肝脏中的主要来源gydF4y2Ba^{17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}脂肪组织炎症先前与NAFLD严重程度相关gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

先前对人类和啮齿动物的研究表明，线粒体生物发生受到抑制gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba，编码线粒体呼吸复合物产物的基因下调gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba呼吸/氧磷降低gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba肥胖中的脂肪组织。gydF4y2Ba

线粒体功能不佳可能与脂肪组织失调直接相关gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba以及代谢疾病的发展gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．此外，来自小鼠的数据甚至表明，脂肪细胞线粒体功能受损与脂联素(一种公认的保护肝脏和抗纤维化脂肪因子)下降之间存在联系gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba})水平，脂联素合成降低gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba，以及肝脏脂肪变性gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

如果脂肪组织OXPHOS反映了脂肪组织代谢失调，那么线粒体呼吸水平可能反过来影响NAFLD的严重程度。此外，SAT和VAT的线粒体呼吸能力并不相同，VAT的呼吸储备能力比SAT小gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．因此，由于潜在的脂质过氧化和细胞损伤以及随后通过门静脉向肝脏释放炎症细胞因子/脂肪因子，VAT中氧化底物的能力下降可能间接地对肝脏产生负面影响。此外，脂质氧化能力的减弱可能导致FFA释放到门静脉的增加，从而促进肝脏脂肪变性。然而，没有研究测量增值税gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNAFLD患者的SAT线粒体呼吸能力与肝细胞线粒体呼吸能力此外，减肥手术引起的体重减轻对肝脏OXPHOS的影响尚不清楚。gydF4y2Ba

我们使用高分辨率呼吸测量(HRR)分析VAT、SAT和肝脏组织样本，这些样本来自肥胖和不同阶段的NAFLD患者，他们接受了减肥手术，而对照组研究对象没有肥胖(CON)。gydF4y2Ba

我们预测，VAT和SAT中的线粒体呼吸反映在肝组织中，并反映了NAFLD的严重程度，在NASH患者中，所有三种组织中OXPHOS最低。gydF4y2Ba

此外，我们还研究了减肥手术对术后12个月肝脏OXPHOS能力的影响。gydF4y2Ba

在这里，我们报告NAFLD严重程度对肥胖患者的肝脏OXPHOS没有影响，肥胖导致脂肪组织呼吸减少，但在减肥手术后12个月，肝脏OXPHOS和肝脏线粒体生物发生显著增加。gydF4y2Ba

受试者基线时的特征(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

NAFLD (NAFL−、NAFL+和NASH)组的体重、BMI和腰臀比相似。NASH组的受试者更有可能患有T2DM (gydF4y2BaPgydF4y2BaNASH组HOMA-IR的中位数(四分位范围，IQR)较高(7.8(6.2─10.0)，NAFL组为−4.0(2.9─5.4)，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)和NAFL+(5.3(4.4─6.4)，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.057)。谷丙转氨酶(ALT)水平在NASH组(32 U/L(30-52)高于NAFL−组(26 U/L(20─31))，gydF4y2BaPgydF4y2BaNAFL+组(27(22─39);gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

肝脏活检和脂肪组织中线粒体含量在CONs组和NAFLD组中无差异(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba描述示意图的研究设置。gydF4y2Ba

肝组织氧通量(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 a + bgydF4y2Ba及补充资料SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

一般来说，两者都是质量特定的(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)、柠檬酸合成酶(CS)活性(图;gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)和mtDNA/nDNA校正的氧通量(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)在底物抑制剂方案1 (SUIT P1)的肝组织中遵循特定的模式，NAFL +在所有底物步骤中表现出最高的数值呼吸速率，NASH和NAFL−具有中等通量率，CON具有最低的氧通量率。然而，这在四组之间是不显著的。gydF4y2Ba

首先，我们校正了CS水平变化的质量特异性肝通量(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，并没有改变SUIT P1的呼吸或显著性模式(图1)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．两组间呼吸频率仍无显著性差异(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

当调整mtDNA/nDNA(图;gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba、表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba及补充资料SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba) OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}pr. mtDNA/nDNA (GMOSgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)，代表最大偶联氧化磷酸化的步骤，与CON相比，NAFL+显著增加了55% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，与NAFL−和NASH相比，分别提高23%和18%(尽管不显著)。各组间最大不耦合呼吸(FCCP)无显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.054)， gmgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba能力(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.047，但在多重比较校正的两两比较中失去了意义)或GMOgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba能力(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.070)。gydF4y2Ba

P/E(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和RCR(图;gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)在四组中也相似。gydF4y2Ba

在回归分析中，没有选择的八个预测因子(BMI, HOMA-IR，脂肪变性等级，气球等级，VAT OXPHOS)gydF4y2Ba_{马克斯,gydF4y2Ba}血浆瘦素、脂联素和丙氨酸转氨酶)与肝脏OXPHOS显著相关gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}/ CS。gydF4y2Ba

BMI是肝脏OXPHOS的唯一重要预测指标(在上述8个指标中)gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}每mtDNA/nDNA(未标准化gydF4y2BaβgydF4y2Ba: 0.0013;95% CI: 0.0004─0.0021，调整后gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.128,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。在肝脏OXPHOS的多元线性回归中gydF4y2Ba_{马克斯,gydF4y2Ba}利用四个自变量从简单线性回归中得到最低的gydF4y2BaPgydF4y2Ba-values (BMI，瘦素(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.050)， Alt (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.081)和脂肪变性等级(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05))，均与肝性OXPHOS呈正相关gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}，)，但只有BMI被证明是一个重要的预测因素(未标准化gydF4y2BaβgydF4y2Ba: 0.0013;95% CI: 0.0004─0.0021，调整后gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.127,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.004)。在事后多元线性回归分析中，男女(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.634)， T2DM状态(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.258)状态或年龄(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.214)与肝脏OXPHOS显著相关gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}每mtDNA/nDNA, BMI仍有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.002) (gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在底物抑制剂方案2 (SUIT P2)中(图2)。gydF4y2Ba2b d fgydF4y2Ba及补充资料SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)呼吸通量(质量特异性、CS和mtDNA/nDNA调整)在各组间相似。然而，与NAFL−和NASH相比，加入鱼藤酮(复合I呼吸抑制剂)后，NAFL+显示出略高的mtDNA/nDNA调节通量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01，gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别< 0.01)(图;gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．加入抗霉素A(阻断复合物III的电子)后，NAFL+的mtDNA调整通量再次明显高于NASH (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

内脏脂肪组织(图;gydF4y2Ba3 a + cgydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba4 a + bgydF4y2Ba及补充资料SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

NAFL+和NASH在大多数步骤中表现为质量比氧通量降低(GMgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba,转基因gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba和OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}和FCCP)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．NAFLD组间无差异。虽然mtDNA拷贝数在两组之间没有统计学差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.624)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，当修正mtDNA/nDNA含量的通量时，呼吸通量不再有显著差异(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

sCD163，一种血浆巨噬细胞标记物，是与VAT OXPHOS负相关最强的因子gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}但在单变量模型(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.042,gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.055)，与BMI、sCD163、脂联素和HOMA-IR (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.048,gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.054)，显著性水平设置为<0.006。gydF4y2Ba

皮下脂肪组织(图;gydF4y2Ba3 b + dgydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba及补充资料SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

在SAT中，质量特异性OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}与CON相比，NASH、NAFL+和NAFL−分别降低39%、35%和35% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001和gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。最大未耦合呼吸降低39%，37%和36% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba所有NAFLD组与CON组比较< 0.001)(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)，分别在NASH、NAFL+和NAFL−中。在调整mtDNA/nDNA后，CON组和NAFLD组之间的显著性仍然存在(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

高BMI不能预测低sat OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}每mtDNA/nDNA为单变量(未标准化gydF4y2BaβgydF4y2Ba: 0.0000136, 95% CI:−0.000110至−0.000010，经调整gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.097,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.009)或与BMI、sCD163、脂联素或HbA1c进行多变量分析(未标准化gydF4y2BaβgydF4y2Ba: 0.0000136(−0.000116 ~−0.000010)，已调整gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.093,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.02)，根据0.006的严格显著性水平。gydF4y2Ba

增值税和SAT P/E(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)在组间相似，但显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)，与肝组织P/E比较，说明AT中的呼吸储备能力小于肝组织。gydF4y2Ba

增值税和SAT的RCR(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)的水平相当，但显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba

T2DM患者和非T2DM患者的VAT和SAT呼吸通量相当(补充数据SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)和T2DM、年龄和性别是事后回归模型中VAT/SAT OXPHOS的不显著预测因素(gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba)．在逻辑回归模型中，没有OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}或最大不耦合呼吸(FCCP) (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.449,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.515)或SAT(0.445, 0.713)预测肥胖患者肝组织中存在NASH。gydF4y2Ba

12个月随访(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba及补充资料SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

术后12个月，大部分临床和生化指标改善。BMI从43.3 kg/m下降gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(37.9─45.7)~ 32.5公斤/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(27.3─37.5)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。HOMA-IR(基线:4.4(3.5─7.2),12个月:1.9(1.4─2.4)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)下降，血浆炎症特征明显改善(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．NAS中位值降低2个点(0.5─2)，脂肪变性、炎症和肿胀显著减少(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

术后12个月肝脏最大电子传递能力明显增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，以非耦合呼吸容量为证。OXPHOS的增加gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}并不显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.099)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，但整体上导致本益比大幅下降(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)，表明在减肥手术后12个月肝脏呼吸储备能力增加，这与CON组的能力没有差异。gydF4y2Ba

12个月后，与基线相比，特异性复合物II和IV(但不包括复合物I)的活性分别显著增加了23%和80% (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．肝脏mtDNA/nDNA中位数从481(441─527)增加到660(431─753)，显著增加32%(- 12%至51%)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.012)(图gydF4y2Ba6 a + bgydF4y2Ba)．当粗通量除以mtDNA/nDNA以估计“每mtDNA的呼吸作用”时，纯复合物IV的呼吸作用仍显著较高(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.043)(图gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

中位P1/P2质量特异性比率和每mtDNA/nDNA P1/P2通量在SG和RYGB手术个体之间无显著差异。gydF4y2Ba

在一个简单的线性回归分析中，总体重减轻与每mtDNA/nDNA呼吸的delta变化无关(最低gydF4y2BaPgydF4y2Baδ复合体II活性= 0.091。UnstandardisedgydF4y2BaβgydF4y2Ba=−0.003,95% CI:−0.007至0.001，调整后gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.205)。手术类型和delta NAS (NAFLD的改善)也不是呼吸增加的显著预测因素(gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这项研究有三个主要发现。首先，我们发现NAFLD患者(包括NASH患者)的肝脏呼吸频率保持不变。其次，我们发现NAFLD组的质量特异性SAT和VAT呼吸频率显著降低。第三，我们发现在减肥手术后12个月，肝脏线粒体呼吸能力显著增加，肝脏mtDNA/nDNA含量也显著增加，这似乎主要是由线粒体生物发生的大幅增加所驱动的。gydF4y2Ba

对于肝组织线粒体呼吸能力的测量，我们采用了两种不同的“SUIT”方案(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，在每个患者的两个不同标本中产生线粒体呼吸的独立测量结果。因此，我们对我们的结论有信心，纳什不会导致任何评估参数的变化(泄漏(GM)， GMgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba, OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}， ETS (FCCP)， RCR或P/E)与CONs比较，这与我们早期对合并T2DM和不合并T2DM的肥胖患者的观察一致gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．虽然NASH患者的呼吸频率数值上低于NAFL +组，但两组间无显著性差异，且NASH的数值通量持续高于CON。然而，与CON相比，NAFL +组患者的OXPHOS确实显著增加gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，但仅当通量校正mtDNA，而不是CS。gydF4y2Ba

我们的数据表明，人类肝脏组织中的线粒体呼吸功能不受NASH的影响，在NAFL+患者中也没有明显增强。这一发现总体上与以往研究得出的结论不一致gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}，但在这一主题的文献中几乎没有共识gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．有人提出，肝脏能量代谢包括线粒体呼吸随着脂肪变性的发展而增加gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}，而一旦出现NASH，则显著下降gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．Koliaki等人。gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba他们从与目前相似的队列中获得的CS校正通量数据中得出了后一个结论，尽管在NASH组中包括较少的患者。gydF4y2Ba

我们的结论是线粒体呼吸作用gydF4y2Ba不是gydF4y2Ba与Koliaki等人得出的结论相矛盾，他们报告说，与NAFL+和NAFL−相比，NASH患者的内在呼吸(每CS呼吸量)显著降低gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．值得注意的是，与CON组相比，NASH患者的呼吸没有下降。然而，作者推测，相对于NAFL+和NAFL−，NASH的内固有呼吸降低是由于NASH肝组织中的“代谢适应性”降低，并反映了线粒体功能障碍gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们的研究与Koliaki及其同事的研究之间出现了一些差异，最重要的是，他们记录了与CON、NAFL−和NAFL+ -组相比，NASH组的线粒体质量高出30-50%(以每毫克蛋白质的CS模式测量)。因此，在Koliaki等人的研究中，NASH组的呼吸减弱完全是由报道的线粒体含量增加引起的。在本研究中，我们完全没有观察到用CS模式测量线粒体质量的差异(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．特别是，我们发现在NAFLD亚组中CS水平相似。为了验证我们的线粒体质量相似的发现，我们还量化了mtDNA/nDNA含量，再次发现两组之间线粒体质量没有显著差异(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，CS和mtDNA/nDNA的调整都没有改变我们的结果和结论(图。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

第二个主要发现是与CON组相比，NAFLD组VAT和SAT的呼吸频率降低(图2)。gydF4y2Ba3模拟gydF4y2Ba)，对于SAT，调整mtDNA/nDNA比值后，这种差异仍然显著。这表明了SAT中线粒体能力的降低，这不仅是由定量(线粒体减少)解释的，而且是由线粒体功能的定性损害解释的。gydF4y2Ba

我们小组之前通过HRR模式比较了肥胖患者全组织VAT和SAT的氧化特性，并报道了与目前相似的结果gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们不知道在NAFLD患者中进行的其他AT线粒体呼吸研究可用于比较。在涉及肥胖个体的研究中，数据主要是在SAT中获得的gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}有研究通过线粒体基因表达谱的模式来评估线粒体功能gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}有报道称线粒体生物发生受损和表达减少，例如编码电子传递链产物的基因。一些研究在转录水平上比较了VAT和SATgydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba在功能水平上，在分离的线粒体中使用基于酶的方法gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}．结合在肥胖动物和实验模型中获得的数据，肥胖可能与脂肪组织线粒体氧化能力和线粒体生物发生的降低有关的证据是相当有力的gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}．然而，线粒体功能的改变/氧化能力的降低是与肥胖相关的代谢后果(胰岛素抵抗，T2DM)的原因还是次要原因，这是一个持续的争论。gydF4y2Ba

关于这场争论，我们研究中一些有趣的观点值得注意。首先，NAFLD严重程度似乎没有影响VAT或SAT固有呼吸能力(每mtDNA/nDNA的通量)，尽管有证据表明代谢恶化加剧，例如NASH组的高HOMA-IR。其次，我们没有证明AT OXPHOS与肝脏OXPHOS之间有任何相关性。第三，当研究对象是否存在T2DM分层时，我们也没有发现OXPHOS有显著差异(补充数据SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)或当T2DM是多元线性回归分析中的一个变量时(gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba)．因此，AT呼吸降低的罪魁祸首似乎与肥胖有关，而不是NAFLD或全身/组织特异性代谢恶化，如胰岛素抵抗，NAFLD反映了这一点。gydF4y2Ba

这与骨骼肌中HRR模式测量的线粒体固有呼吸能力相似gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba和肝组织gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba胰岛素抵抗2型糖尿病患者与健康对照组比较。这些发现也与Chattopadhyay等人得出的结论一致。gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba他们从肥胖个体的SAT样本中分离出的线粒体中发现呼吸链活性降低(酶测)，而没有2型糖尿病的任何额外影响。gydF4y2Ba

与我们最初的预测相反，令人惊讶的是，CON和NAFLD亚组之间线粒体呼吸的最大差异在SAT中发现，而不是在VAT中，后者传统上被认为是与包括NAFLD在内的代谢疾病关联最强的脂肪库gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}．此外，与CON相比，NAFLD亚组中VAT和SAT中的CD68+巨噬细胞水平确实有所增加，这表明脂肪组织存在持续炎症，但NAFLD组和组织中的巨噬细胞数量相似(VAT vs. SAT)，组织学脂肪组织炎症程度与低VAT或SAT的OXPHOS无显著相关性gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}在回归模型中。因此，与我们最初的假设相反，我们没有发现一侧脂肪组织OXPHOS的降低与另一侧脂肪组织炎症或NAFLD严重程度(包括NASH的存在)之间的联系。gydF4y2Ba

脂肪组织OXPHOS的减少是否主要是由于脂肪细胞大小的增加，这是一个无可争议的观察，从肥胖个体的肥胖VAT和SAT样本gydF4y2Ba^{40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}在本研究中也有报道(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．因此，在OBE和CON中，每毫克湿组织中的AT细胞更少，可能导致用于呼吸的线粒体更少。据报道，脂肪细胞的大小对两者都有影响gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba不影响gydF4y2Ba^21gydF4y2BaVAT和SAT线粒体OXPHOS能力。然而，mtDNA/nDNA含量对AT呼吸通量的调整，在组间相似，接近于“每个细胞”的呼吸，在NAFLD组中，SAT呼吸仍然显著降低。因此，我们得出结论，在SAT中，呼吸的减少确实是内在的或定量的减少。gydF4y2Ba

第三个主要发现是，减肥手术后12个月，粗复合体II呼吸以及粗复合体IV呼吸和mtDNA/ ndna校正复合体IV呼吸以及ETS (FCCP)显著增加(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．此外，P/E在12个月后显著下降(图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)，这意味着在减肥手术后的12个月内，肝线粒体获得了额外的储备能力。事实上，P/E接近CON中所见(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)，尽管与CON相比，OBE仍然是肥胖个体(BMI 32.5 kg/mgydF4y2Ba^2gydF4y2BaVs. 24.5 kg/mgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba分别)。报道的肝脏呼吸的增加似乎是由肝脏mtDNA/nDNA含量显著增加~30%所驱动的，这表明在减肥手术后的基线和12个月之间发生了大量和增强的线粒体生物发生。gydF4y2Ba

我们不知道有任何用于比较的人体研究。在使用不同于我们自己的方法来评估线粒体功能的小鼠/大鼠模型中，RYGB和随后的体重减轻已被证明可以增加线粒体呼吸链的容量gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba， CS活性gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba，呼吸链复合物的基因表达gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba减少氧化应激gydF4y2Ba^{46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}但肝脏mtDNA无显著增加gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

肝呼吸的增加与两种手术方式、NAS的改变和体重减轻程度无关，然而，由于只有21名研究对象，我们不能在更大的研究队列中排除这些参数中的一个或多个的影响。值得注意的是，一方面体重减轻和组织学改善之间缺乏相关性，另一方面呼吸增加也可能部分原因是数据的一致性(所有受试者体重减轻程度相同，组织学上NAFLD改善相同)，而不是手术后12个月研究对象数量相当少。在我们之前发表的40例患者的肝脏组织学配对数据中，在减肥手术后12个月，我们也无法得出NAFLD改善的预测因素gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

而横断面数据比较有许多潜在的混杂因素(例如，表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)， 12个月后的前瞻性配对比较具有明显的优势，使得结论相当可靠，即减肥手术后肝脏线粒体呼吸能力和mtDNA/nDNA含量增加。随着质量特异性肝通量和通量/mtDNA的增加，可以认为增强的呼吸是通过增加线粒体生物发生/线粒体质量和增加“每个”线粒体的内在能力的结合而带来的。总而言之，我们的数据表明，在减肥手术的反应中，人类肝脏的代谢具有很大的灵活性。这一发现的临床重要性增加了对人类肝脏广泛再生潜力的现有知识，因为我们在这里表明，这种能力存在于线粒体水平，是所有代谢过程的基本基础。gydF4y2Ba

这项研究受益于来自71名研究对象的配对肝脏和脂肪组织样本的大型数据集，并在减肥手术后12个月重新评估肝脏线粒体氧化能力和mtDNA/nDNA含量，这在以前从未在人类中进行过。该研究的另一个优点是其分析方法，基于对同一研究对象的配对组织活检中线粒体活性的直接测量。gydF4y2Ba

的确，线粒体呼吸的体外测量只能是对真实生物功能的估计。目前还没有一种方法可以在体内测量线粒体呼吸，其细节程度可以与HRR获得的相同。对于骨骼肌，可将HRR活检测量的耗氧量与核磁共振测量的磷酸肌酸-肌酸系统进行粗略比较。读数是不一样的，但Layec等gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．两种方法的读数变化方向相同。gydF4y2Ba

对于肝脏，底物代谢可在体内测量，例如，31磷核磁共振，氧消耗动态氧17 (gydF4y2Ba^17gydF4y2BaO)核磁共振波谱(NMR)。然而，其分辨率与体外技术所能获得的分辨率相差甚远。gydF4y2Ba

本研究的主要局限性是其基线时的横断面设计，不允许对观测到的通量率及其关联的因果关系得出结论。此外，丹麦卫生当局要求手术患者强制减重8%，这可能会影响我们在基线时的结果，因为我们的受试者体重并不稳定。然而，之前我们没有发现8%饮食诱导的体重减轻对SAT线粒体呼吸的影响的证据gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

配对数据也有一些局限性，因为第一次肝活检是在麻醉引入后不久以楔形活检方式获得的，而经皮活检是在局部麻醉(利多卡因)下通过针获得的，并深入组织。全身麻醉对线粒体呼吸的影响尚不清楚。然而，在猪肝的补充实验中(补充图。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)，我们不能证明与活检部位或取样方式(楔形或经皮)有关的呼吸有显著差异。如果有区别的话，经皮穿刺活检的呼吸频率略低于楔形活检，因此这只会加强减肥后呼吸频率增加的发现。另一个限制是在随访中缺乏对脂肪组织的重新取样。最后，应该指出的是，成熟脂肪细胞占人类脂肪组织样本中细胞类型的31%至57%，这是最近使用单细胞RNA测序的空间分辨转录谱分析显示的gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba因此，这里报告的呼吸数据与脂肪组织有关，而不一定专门与脂肪细胞有关。gydF4y2Ba

总之，我们没有报告肥胖和NASH患者肝脏线粒体呼吸受损的证据。然而，在VAT和SAT中，特别是内在呼吸降低，但与NAFLD状态无关;相反，肥胖似乎是影响VAT和SAT呼吸的共同因素。因此，脂肪组织呼吸受损不太可能显著影响NAFLD的严重程度。肥胖个体肝组织中的OXPHOS普遍升高，而AT中的OXPHOS同时降低，这表明肥胖患者肝脏和AT的呼吸适应性不同，但代谢应变增加的附加效应很小。此外，我们在减肥手术后12个月肝脏OXPHOS增强和肝脏线粒体生物发生增加的结果扩展了之前的数据，这些数据表明人类肝脏是一个非常适应的器官，无论是在体重减轻和NAFLD缓解期间还是之后。gydF4y2Ba

道德gydF4y2Ba

该研究方案得到了丹麦首都地区科学伦理委员会的批准(H-16030784和H-16030782)。丹麦数据保护局批准了数据的收集、处理和存储(P-2019-514和P-2020-606)。所有研究参与者都获得了知情的口头和书面同意。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。gydF4y2Ba

研究参与者gydF4y2Ba

本研究中提供的呼吸测量数据基于共71名受试者:62名重度肥胖(OBE)患者(41名女性，21名男性，中位年龄44岁(IQR 39-57岁)，正在接受腹腔镜减肥手术(Roux-en-Y胃分流术(RYGB) (gydF4y2BangydF4y2Ba= 29)或袖状胃切除术(gydF4y2BangydF4y2Ba= 33))和9名体重控制正常的受试者(CON)(7名女性，2名男性，中位年龄39岁(IQR 24-43)。受试者于2016年12月至2019年9月期间在哥本哈根大学Hvidovre医院入组。OBE符合丹麦卫生当局发布的现有减肥手术标准，包括手术前强制减重8%。研究特异性排除标准为男性当前或既往饮酒为>2.5单位/天，女性为>1.5单位/天，既往存在非NAFLD以外的肝脏疾病，既往存在脂质代谢疾病和急性或慢性炎症疾病，或北欧以外的民族血统。手术方式(RYGB或SG)由内分泌科的内分泌科医生决定。更多关于丹麦减肥手术标准的信息可以在gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

CON包括BMI在18 ~ 27 kg/m之间的患者gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba因胆囊结石接受腹腔镜胆囊切除术。受试者必须在其他方面健康，目前或以前没有合并症，除轻度过敏、偏头痛和/或避孕药物外，无处方药物摄入。gydF4y2Ba

CONs获得了税前1500丹麦克朗(相当于200欧元)的费用(适用约37%的税)。gydF4y2Ba

研究设计和人体测量学gydF4y2Ba

在手术当天上午(基线)和12个月后经皮肝活检当天采集血液样本，两次都至少禁食10小时(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．研究参与者的表型和人体测量特征(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在手术(减肥或胆囊切除术)中，从大网膜中取样了楔形肝活检和VAT标本。SAT取样于腹部套管针切口孔(腹部左上)。所有活检均在套管针放置后和手术前立即进行。gydF4y2Ba

21名OBE受试者在术后12个月接受了超声引导的经皮肝活检。每位患者抽取3块组织样本。研究流程流程图是可用的(补充图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在基线时，组织立即被分成50-100毫克的小块，放置在装有冷却线粒体保存缓冲液(BIOPS)的单独试管中。gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba，在液氮中快速冷冻并保存在- 80°C下用于后期线粒体DNA (mtDNA)分析或浸泡并固定在2%多聚甲醛中用于石蜡包埋和组织学评估。gydF4y2Ba

12个月时，经皮肝活检被置于BIOPS (HRR测量)和多聚甲醛(组织学)中，或被快速冷冻用于生物库(mtDNA分析)。gydF4y2Ba

用于测量线粒体呼吸能力的组织在湿冰上运输，并在采样后45-60分钟到达实验室。gydF4y2Ba

线粒体呼吸测量方案gydF4y2Ba

HRR允许直接、离体测量质量特异性线粒体呼吸能力。简而言之，HRR测量通过线粒体电子传递链复合物的电子流对底物和抑制剂的响应过程中氧的使用。gydF4y2Ba

每个组织活检都在新鲜冷冻的BIOPS中仔细修剪，并在呼吸介质中清洗。2 - 4mg肝组织和40mg VAT和SAT被转移到37°C的室中(肝组织:高氧(450-200 nmol/mL, AT:正常氧合(200-100 nmol/mL)在呼吸计中(Oroboros Instruments，因斯布鲁克，奥地利)。软件Oroboros DatLab 6.0);gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}加入洋地黄苷对脂肪组织进行渗透。在基线时对所有组织进行重复研究，12个月后对肝脏组织进行单独研究。氧消耗以组织湿重校正，并以氧通量表示为pmol mg湿重gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

使用了两种独立的底物抑制剂(SUIT)方案。gydF4y2Ba

在底物抑制剂(SUIT)方案1 (P1)中研究AT和肝组织。在加入10 mM谷氨酸盐和2 mM苹果酸盐后，测量状态2的泄漏呼吸(GM)和电子通过配合物1的流动。在没有添加二磷酸腺苷(ADP)的情况下，这一步测量了用于补偿通过线粒体内膜自然发生的电子泄漏的氧气消耗。状态3复合体I呼吸(GMgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)加入ADP + MgCl后得到gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(5毫米+ 3毫米)。当ADP加入时，氧化呼吸过程开始，ATP产生。在进一步加入1.5 mM的中链脂肪酸辛酰肉碱(GMOgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)，通过复合物I刺激线粒体β-氧化和电子传递，随后通过电子穿梭泛醌将电子馈送复合物II。gydF4y2Ba

随后加入10mm的三羧酸循环(TCA)底物琥珀酸(GMOS)gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)产生最大的耦合氧化呼吸能力(OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba})通过复合体I和复合体II。添加10µM细胞色素C (CytC)检测线粒体外膜完整性。CytC反应比转基因作物增加不到10%gydF4y2Ba_DgydF4y2BaStep被认为是可以接受的，并用作保存的线粒体外膜未因制备过程而损坏的指标。最后，通过滴定解偶联剂gydF4y2BapgydF4y2Ba-三氟甲氧基苯腙(FCCP步骤)在0.2µM步长中，我们评估了最大不耦合呼吸(也称为最大电子传递系统容量(ETS))。gydF4y2Ba

使用底物抑制剂SUIT方案2 (P2)对肝组织进行研究。首先，如P1所述，加入苹果酸(2 mM)和谷氨酸(10 mM) (GM)，再加入ADP + MgCl，刺激氧化磷酸化gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(5毫米+ 3毫米gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)，以产生复合体I氧通量。随后加入鱼藤酮(0.5 mM)，复合物I的抑制剂，然后加入复合物II底物琥珀酸盐(10 mM)，评估复合物II的特异性氧通量。通过用抗霉素A(5µM)阻断复合物III的电子通量，随后用COX特异性电子供体刺激复合物lV(细胞色素c氧化酶，COX)gydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2BaN 'gydF4y2Ba，gydF4y2BaN 'gydF4y2Ba四甲基-gydF4y2BapgydF4y2Ba-苯二胺(TMPD) (0.5 mM)和抗坏血酸(2 mM)，可以测定特异性复合物IV活性。数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba提供了研究设置和SUIT P1和P2的示意图概述。gydF4y2Ba

在对原始数据文件进行彻底评估后，由于质量不确定(例如，细胞色素c反应高)，我们从分析中删除了8个肝脏(5个基线和3个随访)，3个VAT和1个SAT HRR测量值。这样我们在12个月时总共有21名受试者，在基线和12个月时都有良好的肝脏数据。gydF4y2Ba

肝脏和脂肪组织的组织学评估gydF4y2Ba

肝组织gydF4y2Ba

福尔马林固定切片、石蜡包埋切片用苏木精伊红和苦天狼星红染色。使用标准指南计算NAFLD活动评分(NAS)gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．所有活检均由三名具有NAFLD专业知识的肝脏病理学家进行评估，他们不了解临床细节。如果分数之间有分歧，则寻求协商一致意见。gydF4y2Ba

脂肪组织gydF4y2Ba

VAT和SAT用福尔马林固定，石蜡包埋。从石蜡块中切割3µM切片，并安装在涂布载玻片上(FLEX IHC载玻片K8020, Dako, Glostrup，丹麦)。切片在60°C下干燥20分钟。然后将载玻片放在OMNIS平台(安ilent)上，在机上脱仿质，并在Flex TRS高pH (EnVision Flex目标检索溶液，GV804)中进行热诱导表位检索(HIER)，在97°C下放置30分钟。将CD68一抗(单克隆小鼠抗体，克隆KP1, Ready-to-use, GA609, Dako, Glostrup，丹麦)在32°C下应用25分钟，并内源性过氧化物酶阻断(EnV Perox GV800/GV823)。在缓冲液中清洗可视化系统后，应用OptiView DAB (EnV hrp标记聚合物，GV800/GV823)。最后用DAB (EnV FLEX Substrate Working Solution, GV825)显影，用苏木精(GC808)反染。使用NanoZoomer (Hamamatsu, Hamamatsu, Japan)扫描幻灯片，并使用NDP进行数字评估。view2查看软件(滨松，滨松，日本)在2k屏幕上×20放大。脂肪细胞和巨噬细胞在8个随机选择的整个区域进行计数(每个区域代表418.660µm的面积)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，每张幻灯片使用无偏倚计数框。计数是由一个观察者盲目进行的。巨噬细胞表达为CD68 +细胞数正常化至100个脂肪细胞。gydF4y2Ba

基于基线(手术期间)的肝组织样本，我们将出窍者分为三组:gydF4y2Ba

1) NAFL - (NAFL−):31例患者无肝脏脂肪变性，中位NAS为2;gydF4y2Ba

2) NAFL+ (NAFL+): 16例肝脂肪变性患者，中位NAS为3例;gydF4y2Ba

3) NASH: 15例NAS≥5且所有NAS亚类(脂肪变性、炎症和肿胀)均有评分。gydF4y2Ba

CON无肝脏脂肪变性，中位NAS为1。gydF4y2Ba

在我们的配对实验中，共有21例手术后12个月重复肝脏活检的出窍者。所有21人都在两个时间点(基线和12个月)进行了有效的P1 HRR测试。21例OBE中，13例基线时NAFL−，6例基线时NAFL+， 2例基线时NASH。gydF4y2Ba

表型、人体测量学、生物化学以及OXPHOS和中位NAS方面，21例进行配对HRR分析的OBE与41例仅在基线时参与横断面分析的OBE没有统计学显著性差异。gydF4y2Ba

等离子体生物标志物gydF4y2Ba

在采血后立即分析常规代谢和肝脏标志物。血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、血浆葡萄糖和甘油三酯使用Roche/Hitachi Cobas c 8000系统(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)，使用Cobas校准器和试剂，按照制造商说明书进行测量。采用免疫法Cobas e 602测定血清胰岛素和c肽浓度。使用Tosoh全自动糖蛋白分析仪HLC-723G8 (Tosoh Corporation, Tokyo, Japan)上的Tosoh TSKgel G8 Variant His检测血浆糖化血红蛋白。在禁食状态下测量所有标志物。gydF4y2Ba

血浆炎症标志物gydF4y2Ba

冷冻血浆储存在−80°C的冰箱中，直到分析一组选定的炎症标志物(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．脂联素(猫。不。DRP300，研发系统，麦金利广场NE，明尼阿波利斯)，sCD163(猫。不。DC1630，研发系统，麦金利广场NE，明尼阿波利斯)和sCD206(猫。不。DLP00, R&D Systems, McKinley Place NE, Minneapolis)采用夹心ELISA (Cat。不。ELH-MMR, RayBiotech, Norcross, Georgia)。 IL-1β, IL-6 and TNF-α were measured by customised electrochemiluminescence (ECL) assay (Cat. No. K151A9H-1, Mesoscale (MSD), Rockville, Maryland). sCD163 was measured in Hep-Plasma and the remaining inflammatory markers in cooled EDTA plasma. All markers were measured in the fasting state.

VAT、SAT和肝组织中线粒体活性的定量gydF4y2Ba

柠檬酸合成酶(CS)活性:在肝组织中，我们测量了CS活性并相应地调整呼吸频率。采用分光光度法测定CS活性。约15 mg湿重的肝组织在600 μ L 0.3 M K中均质gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 0.05% BSA, pH值7.7，在Tissuelyzer (Qiagen, Venlo，林堡，荷兰)上持续2分钟。加入6µL的10% Triton，样品在冰上放置15分钟，然后在−80°C保存以备后续分析。gydF4y2Ba

将匀浆在含有0.33 mM乙酰辅酶a、0.157 mM DTNB、39 mM Tris-HCl (pH 8.0)的最终浓度的溶液中稀释50倍。在自动分析仪(Cobas 6000, c501, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)上，加入0.6 mM草酰乙酸后，在415 nm处，用分光光度法测量了37℃下5,5 ' -二硫代二硫代-(2-硝基苯甲酸(DTNB)到2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子(TNB)的变化。酶活性以每分钟底物微摩尔/克肝组织湿重表示。gydF4y2Ba

线粒体DNA的定量gydF4y2Ba

在VAT、SAT和肝组织中，我们定量了线粒体DNA (mtDNA)含量，以mtDNA/核DNA (nDNA)比值表示。呼吸频率相应调整。gydF4y2Ba

为了分离DNA，使用QIAGEN TissueLyser II珠状均质器将5 - 20mg脂肪或肝脏组织在250µL的碱性裂解溶液(25 mM NaOH和2 mM EDTA)中分离，并以30赫兹的频率连续进行两次1分钟的循环。均质后，样品在96°C下加热1小时，然后用250µL中和缓冲液(40 mM Tris-HCl)中和。离心12000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba，将上清液转移到新管中进行半定量聚合酶链反应(PCR)。mtDNA/nDNA数据按描述进行分析gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba，增加底漆效率校正。用两组引物在线粒体编码的细胞色素C氧化酶II (gydF4y2BamtCO2gydF4y2Ba)和线粒体编码的细胞色素B (gydF4y2BamtCYTBgydF4y2Ba)位点，而引物设置在过氧化物酶体增殖物激活受体γ (gydF4y2BaPPARGgydF4y2Ba)和解偶联蛋白基因1 (gydF4y2BaUCP1gydF4y2Ba)基因位点用于扩增核DNA。引物序列:gydF4y2BamtCO2gydF4y2BaF: tgaagcccccattcgtataa,gydF4y2BamtCO2gydF4y2BaR: cgggaattgcatctgttttt,gydF4y2BamtCYTBgydF4y2BaF: agacagtcccaccctcacac,gydF4y2BamtCYTBgydF4y2BaR: ggtgattcctagggggttgt,gydF4y2BanUCP1gydF4y2BaF: gcccaatgaatactgccact,gydF4y2BanUCP1gydF4y2BaR: tgcatgcattctaggtctttaattt,gydF4y2BanUCP1gydF4y2BaR: tgcatgcattctaggtctttaattt,gydF4y2BanPPARGgydF4y2BaF: ttcagaaatgccttgcagtg,gydF4y2BanPPARGgydF4y2BaR: acatttttggcaatggcttt。gydF4y2Ba

引物效率通过运行系列稀释曲线并使用Lightcycler 480软件(罗氏生命科学公司)分析斜率来确定。的效率确定为1.938 (93.8%)gydF4y2BamtCO2gydF4y2Ba， 1.923 (92.3%)gydF4y2BamtCYTBgydF4y2Ba， 1.839 (83.9%)gydF4y2BanUCP1gydF4y2Ba1.892 (89.2%)gydF4y2BanPPARGgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

效率校正Ct值(Cteff)由方程测井计算gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba((1 + Eff)gydF4y2Ba^CtgydF4y2Ba)，其中Eff为该基因的效率(例如，对于gydF4y2BamtCO2gydF4y2Ba)．使用delta Ct方法计算每个线粒体基因相对于每个核基因的DNA水平，使用公式2gydF4y2Ba^{(Cteff nPPARG - Cteff mtCO2)gydF4y2Ba}， 2gydF4y2Ba^{(Cteff nUCP1 - Cteff mtCO2)gydF4y2Ba}， 2gydF4y2Ba^{(Cteff nPPARG - Cteff mtCYTB)gydF4y2Ba}和2gydF4y2Ba^{(Cteff nUCP1 - Cteff mtCYTB)gydF4y2Ba}．将这些值乘以2，以说明每个核基因的两个副本，并求平均值以获得最终的mtDNA/nDNA比率。gydF4y2Ba

猪模型gydF4y2Ba

为了研究肝组织取样方式(经皮穿刺和楔形活检)对HRR测量的潜在影响，我们从一头猪身上取样了三对经皮穿刺和楔形活检肝组织样本。猪为雌性丹麦长白猪，18周龄，体重51公斤。动物牺牲后立即进行组织取样。该猪已用于另一项科学目的，并已获得所有必要的批准(许可证号为2018-15-0201-01608)。所有动物实验均按照丹麦动物保护法进行，调查符合欧洲议会关于保护实验动物的指令2010/63/EU和arrival指南的指导方针。这项研究已经得到了丹麦区域动物福利监察局的审查和批准。gydF4y2Ba

计算gydF4y2Ba

P/E以OXPHOS计算gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}(转基因生物gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba) / u (FCCP)状态。P/E表示测量的OXPHOS有多接近gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}为未耦合状态下的最大电子传递系统容量(ETS)。gydF4y2Ba

呼吸控制比(RCR)以GM计算gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba/通用。RCR被用作线粒体功能的一般测量，即线粒体在补充ADP时增加呼吸的能力。gydF4y2Ba

胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)按公式[空腹葡萄糖(mg/dL) ×胰岛素(mU/L)/405]计算。gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

12个月时体重减轻的百分比(%EBWL)计算为[((基线BMI-随访BMI)/(基线BMI-25)) × 100%]。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

不符合正态分布的条件。四组间比较采用多重比较校正的Kruskal-Wallis检验或成对数据的Wilcoxon-signed rank检验(基线与12个月随访)。gydF4y2Ba

采用简单线性回归法探讨8个预测因子;这些是作者小组根据线粒体呼吸(OXPHOS)的假定临床重要性选择的gydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba})基线(肝组织:BMI, HOMA-IR，脂肪变性等级，气球级，VAT OXPHOSgydF4y2Ba_{马克斯,gydF4y2Ba}VAT/SAT: BMI, HOMA-IR，血浆瘦素，血浆脂联素，HbA1c，血浆sCD163，血浆sCD206, VAT/SAT巨噬细胞计数。为了校正回归分析中的多重检验，使用Bonferroni校正和agydF4y2BaPgydF4y2Ba-value of 0.05/8 = 0.006被认为是显著的。系数估计值以95%置信区间(CI)给出。在多个线性回归模型中尝试每个组织最显著的四个变量，并进行正向选择和模型控制，必要时包括共线性检验和对数变换。使用简单的逻辑回归来探讨VAT和SAT脂肪组织OXPHOS是否影响NASH的存在。在事后分析中，在基线时，性别和2型糖尿病状况与三个组织中的四个显著变量一起进行了尝试。此外，在简单的回归分析中，总体重减轻，delta NAS和手术类型被尝试作为肝组织中每个mtDNA的delta呼吸的预测因素。gydF4y2Ba

研究参与者特征以四分位范围(IQR)的中位数或频率表示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05(双侧)被认为有统计学意义。所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics 25 64位进行。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba