TPGS-based和S-thanatin克服耐药的功能化纳米棒gydF4y2Ba克雷伯氏菌肺炎gydF4y2Ba

小娟王gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
小玲徐gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Shaojun张gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Na陈gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
云峰的太阳gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Kuifen马gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
摄于香港gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
李陆gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Yongzhong杜gydF4y2BaORCID:gydF4y2Baorcid.org/0000 - 0002 - 2137 - 4517gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
小杨陆gydF4y2BaORCID:gydF4y2Baorcid.org/0000 - 0002 - 1001 - 0160gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba&gydF4y2Ba
…gydF4y2Ba
Saiping江gydF4y2BaORCID:gydF4y2Baorcid.org/0000 - 0001 - 6656 - 5969gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba

自然通讯gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba13gydF4y2Ba文章编号:gydF4y2Ba3731年gydF4y2Ba(gydF4y2Ba2022年gydF4y2Ba)gydF4y2Ba引用这篇文章gydF4y2Ba

4999年gydF4y2Ba访问gydF4y2Ba
6gydF4y2Ba引用gydF4y2Ba
37gydF4y2BaAltmetricgydF4y2Ba
指标gydF4y2Ba细节gydF4y2Ba

主题gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

Tigecycline被视为应对耐多药的最后防线gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba。然而,提高利用率上升导致耐药和治疗失败。这里,我们设计一个dα生育酚聚乙二醇succinate-modified和S-thanatin peptide-functionalized基于tigecycline交割的磷酸钙纳米颗粒和纳米棒tigecycline-resistant引起的肺炎治疗gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba。与细菌孵化后,制造纳米棒可以提高tigecycline积累的细菌gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba对射流泵施加的抑制作用dα生育酚聚乙二醇琥珀酸和瞄准能力S-thanatin细菌。S-thanatin之间的协同抗菌能力和tigecycline进一步增强了纳米抗菌活性,从而克服tigecycline阻力gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba。静脉注射后,纳米棒显著减少白细胞和中性粒细胞的数量,减少细菌菌落,和改善中性粒细胞浸润事件,从而很大程度上提高与肺炎小鼠的存活率。这些发现可能会提供一个由耐药细菌引起的感染的治疗策略。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

抗生素是一个划时代的发现在过去的几十年里细菌感染的治疗方法。然而,长期过度使用抗生素导致抗生素耐药性的传播gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba。随后,超级细菌的出现已经成为一个占主导地位的挑战人类健康成长gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。据预测,细菌感染每年会导致1000万人死亡,到2050年,超过目前由癌症引起的gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。细菌抵抗抗生素的影响主要通过以下分子机制:修改目标站点,破坏抗生素,抗生素通过射流射流转运蛋白通过减少膜透性和减少抗生素涌入gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。在1980年代首次发现以来,许多射流泵等病原体的特征gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌,肠球菌都有效,不动杆菌baumanii,铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba克雷伯氏菌肺炎gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。射流泵的过度会导致临床相关的革兰氏阴性细菌抵抗抗生素的水平gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

目前,gydF4y2Ba克雷伯氏菌肺炎gydF4y2Ba(KPN)被认为是一个最严重的医院病原体的威胁公众健康gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。革兰氏阴性细菌,KPN可以诱导多种感染,如肺炎、肝脓肿、尿道感染、脑膜炎、和菌血症在住院病人免疫系统的不足gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。近年来,KPN菌株具有高毒性和粘液表型已经逐渐成为一个重要的临床病原体,可以导致严重的感染健康人,大大威胁到他们的健康gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}。此外,KPN容易产生多药耐药性gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。碳青霉烯抗生素使用的一线药物引起的感染耐多药KPN (MDR-KPN)。然而,随着碳青霉烯抗生素的广泛使用在临床治疗,特KPN (CRKP))明显增加,已经成为一个严重的公共卫生问题gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。耐药性的增加和高死亡率为临床治疗提出了占主导地位的挑战。目前有几个可用的替代药物治疗CRKP)感染患者,与tigecycline (TIG)剩下为数不多的抗生素gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba。因此,TIG通常被认为是对CRKP)最后的防线之一。然而,阻力越来越大,灵敏度和降低CRKP)与增加TIG观察临床应用,极大地威胁着最后防线的疗法gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba。——和cost-consuming过程慢得多的新抗生素的开发结果的出现比细菌新抗菌药物的耐药性gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

最近,、交付系统(dds)已成为致命感染的新治疗方法gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。DDS可以增加血液中药物保留时间,减少非特异性分布,和有针对性的感染部位的药物gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。纳米材料和抗生素联合治疗可能有助于更好的治疗指数。因此,它们被认为是有前途的候选人为打击MDR细菌gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。大量研究构建基于dds Ag)、金、铜、铁、钛和介孔二氧化硅纳米颗粒治疗传染性疾病gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba,他们的临床使用体内阻碍了安全。更高效nanomaterial-based交付策略,如pH-triggered enzyme-sensitive,和细菌toxin-triggered dds,可能允许释放抗生素时空控制的方式,得到全世界的关注gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba。然而,这个过程是复杂的和复杂的,发布的抗生素缺乏特异性细菌。因此,一个安全的DDS与针对功效细菌感染可能是一个有效的策略治疗TRKP所致。gydF4y2Ba

到目前为止,几种机制已确定与tigecycline-resistant相关联gydF4y2Ba克雷伯氏菌肺炎gydF4y2Ba(TRKP)。最常见的,非特异性主动resistance-nodulation-cell部门(RND)射流泵如AcrAB-TolC过度繁殖gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。Tigecycline > 2 mg / L的中等收入国家已经显著增加gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba水平gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba。据报道,大多数CRKP)分离株耐tigecycline是由于增加外排泵基因的表达gydF4y2BaacrBgydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。中国的回顾性研究显示,高表达gydF4y2BaacrBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba被发现在~ 90%的tigecycline-resistant隔离临床吗gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

dα生育酚聚乙二醇琥珀酸(tpg)、非离子表面活性剂,广泛应用于dds。大量研究表明,tpg函数作为抑制剂和底物的22和大大减少药物的流出gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba。因此,tpg可以逆转肿瘤细胞的多药耐药性。这些特性使得tpg的另一个可行的生物材料在dds肿瘤治疗,尤其是在肿瘤对化疗药物产生抗药性gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。我们先前的研究已经证实tpg射流泵在细菌的抑制活性gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。因此,tpg在dds中的应用可能是一个有效的手段来提高TRKP TIG积累,达到有效治疗TRKP感染。gydF4y2Ba

S-thanatin (Ts)肽是一个简短的抗菌肽(AMP)展品脂多糖(LPS)绑定关联gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba,这表明其潜力作为感染的治疗策略由革兰氏阴性细菌引起的。Ts肽之间的交互和有限合伙人可以促进Ts进入细胞质的膜的夹层,随后导致漏水的细胞质的膜和细菌呼吸和通电的解体gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。Ts肽可以杀死细菌membrane-dependent方式已显示其对展览活动对许多革兰氏阴性细菌的抗菌活性,包括MDR细菌gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba}。Ts peptide-functionalized levofloxacin-loaded脂质体靶向型药物显示细菌和表现出一个优秀的治疗效果在感染性MDR-KPN引起的小鼠模型gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。磷酸钙纳米颗粒(Cap)引起了广泛关注作为潜在的航空公司由于其固有的优越特性,包括药物装载效率高、良好的生物相容性,良好的生物降解性gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。Ts-modified帽dds可能进一步加强TIG积累细菌。肺炎由KPN和TRKP是临床上最常见的传染性疾病之一。gydF4y2Ba

在这项工作中,我们设计一个TPGS-based TIG加载和Ts peptide-modified帽、交付系统,并构造Ts-TPGS /帽/ TIG (TTCT)肺炎治疗。与细菌,孵化后Ts肽修改可以实现有针对性的TIG交付到细菌。射流泵和tpg展品抑制活动的小粒径、交付系统有利于穿透细胞壁。因此,TIG积累内细菌可以被增强,增加TTCT的抗菌活性。此外,Ts之间的协同抗菌能力和TIG进一步增强了TTCT的抗菌活性(示意图描述图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。因此,克服耐药性和有效治疗TRKP-induced肺炎可以实现。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba — **图1:示意图描述制造的纳米棒和克服TRKP tigecycline抵抗的机制。gydF4y2Ba**

结果gydF4y2Ba

的制备和表征Ts-TPGS /帽/ TG、输送系统gydF4y2Ba

Ts-TPGS (TT)共轭羧基组之间通过酯化反应合成的Ts肽和tpg的羟基。(中行)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO是用来保护氨基的Ts,和一个合成插图图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。的gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba核磁共振光谱的TT共轭显示的特征峰Ts (gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba7.7 ppm)gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba和tpg (gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba3.5 ppm),这表明tpg已成功修改Ts(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。然后,TT共轭作为稳定剂准备Ts-TPGS /帽通过水热纳米棒的方法。纳米棒的晶体结构和化学成分经x射线衍射(XRD)谱比较典型的纳米羟基磷灰石晶体的晶体衍射峰(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。后来,TIG被封装到Ts-TPGS /帽和tpg /帽透析纳米棒的方法。当药物喂食比率为20%,药物加载(DL %)为12.47±1.48 tpg /帽/ TIG (TCT)纳米棒和12.31±0.94 Ts-TPGS /帽/ TIG (TTCT)。相应地,封装效率(EE %)估计TCT 62.33±6.92, 61.53±4.70 TTCT。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba — **图2:合成和表征Ts-TPGS (TT)。gydF4y2Ba**

图3gydF4y2Ba — **图3:TTCT的制备和表征。gydF4y2Ba**

粒子大小,多分散性指数(PDI)和电动电势tpg /帽,Ts-TPGS /帽,TCT, TTCT评估。配方的粒度是维护gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba25 nm(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),显示一个狭窄的粒径分布(图gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。没有观察到明显的变化后Ts修改和TIG加载。所有的配方展出monomodal电动电势分布与负电荷(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)。然而,纳米棒的电动电势下降从−18.56±1.66 mV后−14.99±1.66 mV Ts修改(表gydF4y2Ba1gydF4y2Batpg的),可能是因为一些羟基取代了Ts。此外,TIG加载进一步降低电动电势,这可能是由于药物和纳米棒之间的静电相互作用。透射电子显微镜(TEM)图像显示,所有的配方有统一和棒状形态。(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。配方的稳定性是探索作为时间的函数,动态光散射(DLS)。观察到,准备纳米棒稳定后与小粒径的变化和PDI存储20天(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2BaE、F)。此外,TCT的粒子大小和PDI和TTCT仍然几乎不变在10%胎牛血清(的边后卫)包含PBS 24 h内(如无花果所示。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba),这表明TCT流通和TTCT不会分解。gydF4y2Ba

表1描述tpg /帽,Ts-TPGS /帽,TCT, TTCT。gydF4y2Ba

全尺寸表gydF4y2Ba

TCT的药物释放行为和TTCT透析法进行评估。显示在无花果。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba,快速释放的纳米棒TIG 0.5 ~ 25%的h,然后继续释放药物持续一段72 h。药物分子在8 h释放了大约50%。累积药物释放为86.89±0.76%和87.80±0.39% TCT TTCT,分别。值得注意的是,药物释放的TCT和TTCT相似,表明Ts修改没有明显的对纳米棒的药物释放特性的影响。gydF4y2Ba

TTCT体外抗菌活性gydF4y2Ba

TTCT体外抗菌活性的评价gydF4y2Ba克雷伯氏菌肺炎gydF4y2Ba(KPN)和TIG-resistant KPN (TRKP)在我们的研究中。如无花果所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba的最小抑制浓度(麦克风)TIG KPN和TRKP 1µg /毫升和4µg /毫升,分别表明TRKP不容易追到。然而,Ts肽显示类似的抗菌活性对KPN TRKP,麦克风16µg /毫升的价值,这与之前报道的研究是相一致的gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba。对于KPN, TCT证明类似于TIG抗菌活性。抗菌能力TTCT是最好的理由是它的MIC值最低。它可能是与TIG和Ts肽之间的组合效应。TRKP, TIG、TCT的麦克风值4µg /毫升和2µg /毫升,分别指示TPGS-based、输送系统可以改善TIG TRKP阻力。也观察到类似的结果之前报道的研究和可能与射流泵的活动gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}。值得一提的是,TTCT的MIC值是1µg /毫升,这等于免费TIG KPN,表明TTCT克服耐药是有效的。gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba — **图4:抗菌活性评价TTCT KPN和TRKP体外。gydF4y2Ba**

我们进一步研究了配方的效果KPN的生长曲线和TRKP。在24小时的潜伏期与自由TIG, TCT, Ts-TPS /帽(TIG浓度:0.5µg /毫升;Ts-TPGS /上限浓度:5µg /毫升),OD的显著增加gydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}观察KPN的值,这表明他们不能阻止细菌的生长(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。然而,可见完全抑制了细菌的生长TTCT (TIG浓度:0.5µg /毫升)。对于TRKP,只能抑制细菌增长TTCT (TIG浓度:1µg /毫升),几乎恒定的ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}值超过24小时的潜伏期。增长TRKP并不阻止TIG(1µg /毫升,2µg /毫升),TCT (TIG浓度:1µg /毫升),和Ts-TPGS /帽(10µg /毫升)(图gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。结果是按照图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。作为一个整体,TTCT抗菌活性比TIG和TCT KPN和TRKP。gydF4y2Ba

进一步评估TTCT的抗菌活性,细菌形态学变化后不同治疗被扫描电子显微镜(SEM)观察。显示在无花果。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba无需任何治疗,细菌表现出典型的棒状的形状和完整的光滑表面。细菌形态明显改变了治疗后的各种准备工作。Ts-TPGS /帽纳米导致明显漏洞KPN和TRKP细胞壁,这可能归因于Ts肽的抗菌机制。此外,细菌的SEM图像放大与TIG-containing孵化后准备展示形态的重大变化,如细胞膜破裂,碎片,以及细胞完整性的损失。的细菌结构被大量摧毁TTCT KPN和TRKP组,进一步确认TTCT的优越的抗菌效果。总之,图中所示的结果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba透露,TTCT是一个优越的制备具有优良的抗菌功能KPN和TRKP与TIG相比,TCT和Ts-TPGS /帽纳米棒。此外,数据表明,TTCT能够克服耐药性TRKP对耐多药细菌和实现有效的抗菌能力。gydF4y2Ba

克服耐药的机制gydF4y2Ba

我们推测,增强抗菌活性TTCT归因于Ts的定位能力,对射流泵由tpg赋予抑制作用,协同抗菌活性Ts和TIG之间。下面是我们进行的实验来验证我们的假设。gydF4y2Ba

体外靶向效率Ts-TPGS /帽纳米棒gydF4y2Ba

据报道,thanatinβ-hairpin结构稳定的二硫键Cys11和Cys18之间gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba,这被认为是积分的活动gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。模拟两个半胱氨酸残基的thanatin取代了阿拉巴马州被发现在很大程度上不活跃gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba,这表明Ts的二硫键是重要的活动。考虑这一点,Ts的模拟肽与两个半胱氨酸残基取代了阿拉巴马州(GSKKPVPIIYANRRSGKAQRM)合成和担任的新肽。的新peptide-conjugated tpg /帽(NT-TPGS / Cap)准备根据Ts-TPGS /帽的制备过程和用于控制评价的体外靶向效率Ts-TPGS /帽纳米棒。如无花果所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaNT-TPGS /帽和Ts-TPGS /帽纳米棒显示逐步增加intra-bacteria荧光信号延长培养时间。Ts-TPGS /帽纳米细菌内化能力显示强于NT-TPGS /帽纳米棒在KPN和TRKP 2和6 h。获得的结果是一致的与流式细胞术(无花果。gydF4y2Ba5 b, CgydF4y2Ba)。荧光信号在孵化后KPN Ts-TPGS /帽纳米棒~ 2倍大于那些NT-TPGS /帽纳米棒在2 h和6 h(无花果。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)。TRKP,也观察到类似的结果,这表明Ts-TPGS /帽纳米棒表现出更好的细菌内化活动,这可能归因于针对一部分Ts肽。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba — **图5:调查TTCT克服耐药的机制。gydF4y2Ba**

tpg在射流泵的抑制作用gydF4y2Ba

据报道,累积的溴化乙锭(EB)与射流泵的活性呈负相关gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。因此,海尔哥哥是利用射流泵的衬底gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba。tpg在射流泵的抑制作用是研究通过比较其羰基氰化物法(CCCP),一个著名的质子泵抑制剂。如无花果所示。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba,EB积累在对照组TRKP是微不足道的。与tpg孵化后,EB内细菌的荧光信号明显强于对照组。定量分析表明,EB累积百分比的增加从22.11±3.67%增加到64.75±5.91%,tpg的浓度从20增加到100µM(无花果。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba),这表明tpg治疗EB积累体现一个明显的增加。也观察到类似的结果之前报道的研究gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

此外,tigecycline阻力TRKP已被证实与RND-type外排泵基因的超表达(gydF4y2Ba肢端gydF4y2Ba和gydF4y2BaacrBgydF4y2Ba),gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。实时一(rt - pcr)被用来确定的水平gydF4y2Ba肢端,acrBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba。细菌在mid-exponential阶段收获后,KPN和TRKP暴露在tpg, Ts, Ts-TPGS,分别和Ts-TPGS /帽纳米棒。如补充图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba的表达水平gydF4y2Ba肢端gydF4y2Ba,gydF4y2BaacrBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba与KPN相比差异显著,这证实了AcrAB-TolC参与TRKP TIG阻力。Intervenation tpg, Ts, Ts-TPGS Ts-TPGS /帽明显下调表达水平。还值得一提的是,Ts治疗抑制射流泵的表达水平,我们推测这一现象是与Ts活动相关细菌的外膜gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}。Ts-TPGS和Ts-TPGS /帽纳米棒显示最高的外排泵基因表达减少,可能是由于tpg的组合效应和Ts。基于这些结果,我们证实,tpg有抑制作用的活动和表达水平TRKP射流泵。结果与先前报道的一致gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。然而,潜在的机制仍不确定。报道,表面活性剂可以诱导膜流动性的改变和atp酶抑制gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba。因此,我们推测,tpg抑制射流泵的活动可能是通过其表面活性剂的特点。gydF4y2Ba

TIG浓度内细菌gydF4y2Ba

针对疗效和射流泵的抑制作用是有利于TIG交付到细菌。因此,TIG浓度内细菌与自由TIG KPN和TRKP孵化后,TCT, TTCT高性能液体色谱-质谱法测定(HPLC-MS)。如无花果所示。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba随着时间的推移,TIG浓度增加与TIG细菌孵化后,TCT, TTCT。对于KPN, TCT和TTCT导致TIG浓度大量增加比TIG集团和TTCT展出浓度高于TCT 2 h和6 h。这些结果表明,TIG交付在纳米细菌后更好的封装,并进一步加强了Ts肽修饰的影响。TRKP观察到类似的结果。TIG浓度TRKP组只有~,KPN集团30%的细菌与TIG孵化时,这可能是一个合理的解释TIG TRKP的阻力。结合图所示的结果。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba,我们推测,这可能是因为射流泵会产生运输TIG从内到外的细菌。这种现象明显改善了TPGS-based、输送系统。Ts肽修饰进一步增加了TIG浓度内细菌。总体而言,这些团体中TIG TTCT浓度越高TRKP可能是由于针对Ts引起的效率,抑制影响射流泵的活动,和纳米棒的TIG封装。gydF4y2Ba

之间的协同抗菌活性Ts和戏弄gydF4y2Ba

之间的交互Ts和tigecycline调查micro-dilution棋盘技术根据CLSI指南。部分的数据表现出抑制浓度指数之间的Ts和tigecycline KPN和TRKP是0.75和0.375,分别表明Ts对协同效应与tigecycline TRKP和累加效应对KPN(补充表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总体而言,底层TTCT克服耐药机制可能包括以下几个方面:(1)小粒径的纳米棒有利于穿透细胞壁;(2)TIG积累在细菌通过Ts的瞄准能力显著增强细菌和射流泵由tpg施加的抑制作用;(3)之间的协同抗菌能力TTCT Ts和TIG进一步增强抗菌活动。gydF4y2Ba

Biodistribution体内gydF4y2Ba

使用气管注入KPN或TRKP细菌进入肺部健康的老鼠,我们创建了急性肺炎小鼠模型和调查Ts-TPGS的体内靶向效率/帽纳米棒。静脉注射的小鼠注射吲哚菁绿(ICG)标记纳米棒在5 h术后。在政府Ts-TPGS /帽纳米棒,我们评估的体内biodistribution纳米5 h和24 h后。如无花果所示。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA、B Ts-TPGS /帽纳米棒之间类似的生物分布特征显示肺炎小鼠感染KPN和TRKP。同样的现象也观察到小鼠接受tpg /帽纳米棒。此外,荧光信号在肺部更强处理Ts-TPGS /帽纳米比对待tpg /帽,这意味着更多的Ts-TPGS /帽纳米积累在肺部感染(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA、B)。在肺炎引起的小鼠KPN和TRKP,定量荧光信号(每克组织表达的荧光强度、ID / g) Ts-TPGS /帽纳米棒在肺~ 1.5倍~ 2.5倍高于tpg /帽5 h和24 h,分别(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaC, D)。值得注意的是,Ts-TPGS /帽纳米棒主要是分布式的肝、肺、肾的肺炎小鼠在24 h。肺部的ID / g高于肝脏和肾脏。gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba — **图6:评估biodistribution和定位的功效Ts-TPGS /帽体内。gydF4y2Ba**

肺炎可能引起破坏的肺内皮屏障的完整性gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba、血管渗透性可能会显著增加细菌感染的网站gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。据报道,增强渗透性和保留(EPR)效应可能操作提供纳米粒子bacterial-infected组织gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba。我们推测,我们准备好的纳米棒可能分成感染肺部通过EPR效应后静脉管理。然后纳米棒可以由血管内皮细胞内化(补充图中的数据。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba证明了纳米棒有极好的细胞内化能力)和跨血管运输。Ts,有限合伙人提升之间的亲和力的积累Ts-functionalized纳米棒在受感染的肺。总的来说,体内分布研究表明Ts-TPGS /帽纳米棒可以实现针对肺炎小鼠肺的积累,这是有利于实现更好的抗感染的疗效。gydF4y2Ba

TTCT体内抗感染的疗效gydF4y2Ba

急性KPN, TRKP-infected肺炎模型被用来调查TTCT的体内抗感染药活动。5 h建模后,小鼠静脉注射TIG, TCT TTCT, Ts-TPGS /帽纳米棒。然后,老鼠的存活率接受不同的治疗在5天内被记录。如无花果所示。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA、B TRKP幸存下来33.3%的肺炎小鼠感染5天,相比KPN-infected老鼠在16.7%。这种差异可以解释的事实获得抵抗后,细菌可能变得不那么强gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}。KPN-infected小鼠接受TIG、TCT治疗(TIG剂量:15毫克/公斤)幸存下来的66.7%和83.3%,分别,这表明在纳米封装TIG提高其抗菌活性。此外,Ts-TPGS /帽奈米棒治疗也增强KPN-infected小鼠的存活率。gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba — **图7:调查TTCT体内的抗感染的疗效。gydF4y2Ba**

相比之下,TRKP肺炎小鼠接受治疗的TIG(15毫克/公斤)证明比KPN-infected小鼠存活率较低,可能归因于nonsusceptibility TRKP戏弄。66.7%的TRKP-infected老鼠45毫克/公斤TIG治疗后还活着,但仍低于小鼠TCT (TIG剂量:15毫克/公斤)。这一现象表明TPGS-based、运载系统可以克服细菌阻力,实现有效的抗药细菌引起的抗感染治疗效果。结合图中所示的数据。gydF4y2Ba5gydF4y2BaE、F、可以解释结果发现tpg是抑制射流泵的活动的能力。此外,TTCT治疗组存活率最高100%的肺炎小鼠KPN和TRKP所致。优越的治疗效果与其他组相比可能归因于目标分布,抑制射流泵的活动,Ts抗菌肽。gydF4y2Ba

炎症标记物(白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白水平)是重要的炎症指标,可用于评估感染。因此,存活小鼠接受治疗的各种准备工作就绪牺牲48 h后收集血液样本和支气管肺泡灌洗液(BALF)。首先,我们评估的白细胞水平(白细胞)和中性粒细胞在血液样本。结果表明,细菌感染引起的白细胞和中性粒细胞(图的明显增加。gydF4y2Ba7 c - dgydF4y2Ba)。显著减少白细胞和中性粒细胞的水平观察当KPN TRKP-infected小鼠接受TIG, TCT TTCT,表明感染明显缓解。此外,更大的观察水平的白细胞和中性粒细胞减少TTCT组在KPN TRKP-infected老鼠,证明TTCT比其他疗法有更好的治疗效果。应该提到Ts-TPGS /帽纳米棒单独有积极抗感染活性对KPN, TRKP-infected老鼠。减少白细胞和中性粒细胞水平Ts-TPGS /帽治疗组甚至等于TIG (L)集团(TIG剂量:15毫克/公斤)TRKP-infected老鼠。这一现象可能的原因是Ts的优良的抗菌活性肽对药敏结核病和耐药细菌。结果符合那些显示在无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA、B。gydF4y2Ba

然后,我们研究的水平总细胞,中性粒细胞百分比,和C反应蛋白(CRP)在BALF进一步评估TTCT体内的抗感染的疗效。如无花果所示。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba,总BALF细胞过度增加KPN, TRKP-infected老鼠。当被感染的老鼠收到TIG-containing准备和Ts-TPGS /帽纳米棒,总细胞表现出显著减少,TTCT显示最高的减少在这些组。嗜中性粒细胞浸润到肺间质液可能导致进一步肺水肿和恶化的炎症gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}。因此,我们另外评估肺中性粒细胞浸润。中性粒细胞被贴上PE-labeled anti-Ly-6G / Ly-6C和FITC-labeled anti-CD11b抗体。中性粒细胞的百分比总细胞流式细胞仪测定。是观察中性粒细胞占细胞总数的75% ~ 85% ~ KPN-infected TRKP-infected小鼠,分别(无花果。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)。中性粒细胞的百分比明显降低TIG管理后,TCT, TTCT,和Ts-TPGS /帽纳米棒,清楚地表明改善肺中性粒细胞浸润。值得一提的是,TTCT治疗治疗中仍表现出最好的效果。此外,Ts-TPGS /帽纳米棒显示肺中性粒细胞浸润的抑制作用类似TRKP-infected TIG(15毫克/公斤)的老鼠。代表图像的流式细胞仪图所示。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba。gydF4y2Ba

c反应蛋白是一种细菌感染的证据确凿的指标gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba。的CRP水平BALF使用商业酶联免疫试剂盒测定。如无花果所示。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba,KPN的CRP水平明显升高,TRKP-infected老鼠。然而,它与TIG水平治疗后明显下降,TCT, Ts-TPGS /帽纳米棒,效果被TTCT进一步加强。此外,BALF菌落分析利用,TTCT显示最低的细菌菌落肺炎小鼠感染KPN和TRKP小鼠接受各种治疗(无花果。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba和定量分析结果补充图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。总的来说,TTCT治疗始终显示最好的治疗效果,较低的白细胞计数和中性粒细胞在血液,降低肺嗜中性粒细胞浸润和更高,降低c反应蛋白水平和细菌菌落。这些结果可能解释Ts肽的抗菌活性和抑制作用的射流泵,从而增加了TIG浓度在肺部和细菌。gydF4y2Ba

正电子发射tomography-computed断层扫描(磁共振)成像gydF4y2Ba

PET / CT成像系统已经广泛应用于临床诊断和治疗gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba。毛细血管通透性增加的初期感染可能导致炎症细胞的聚集和激活,并激活炎症细胞主要代谢葡萄糖作为能量来源gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba。因此,为了提供更多的证据抗菌效果,PET成像gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-labeled氟脱氧葡萄糖(gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG)是用来评估炎症和感染不同的基团。如无花果所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,KPN TRKP感染显著增加引起的gydF4y2Ba^18gydF4y2BaFDG肺部吸收。的水平gydF4y2Ba^18gydF4y2BaFDG减少吸收后受感染的老鼠受到戏弄,TTCT, Ts-TPGS /帽,反映在标准摄入值下降(suv)。这种现象被TTCT干预进一步改善,证明TTCT表现出优越的效果与其他治疗组相比,这是符合结果显示在无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

图8gydF4y2Ba — **图8:组织病理学观察肺部组织。gydF4y2Ba**

组织病理学gydF4y2Ba

评价不同治疗方法对病变的影响,他在5天post-administration染色了。正如所料,KPN的肺,TRKP-infected老鼠显示典型的病理特征,如肺泡壁增厚、水肿、白细胞浸润(无花果。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。组织学改善显然是观察在收到TIG, TCT和Ts-TPGS /帽纳米棒。TTCT显示更明显改善肺部炎性浸润、水肿,肺泡壁增厚比另一组。此外,肺沾髓过氧化酶(MPO)抗体调查嗜中性粒细胞浸润。共焦图像显示肺部细菌感染导致显著的嗜中性粒细胞浸润,这现象很明显改善后,不同的治疗方法(无花果。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)。与图中所示的结果一致。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,TTCT仍然证明比其他组更好的治疗效果。gydF4y2Ba

生物安全的TTCTgydF4y2Ba

tpg的细胞毒性/帽和Ts-TPGS /帽纳米棒,体内其进一步应用的关键因素,在HUVECs MTT法评价,EA.hy926细胞。细胞生存能力超过90%时,纳米棒的浓度达到0.4毫克/毫升,这意味着tpg /帽和Ts-TPGS /帽有极好的生物相容性(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2BaA, B) Ts的溶血率是多少~ 3%,tpg /帽,Ts-TPGS /帽纳米棒。TIG、TCT TTCT,溶血百分比分别为6.80±0.11%,3.92±0.52%,和4.13±0.96%,分别,这意味着TIG封装增加了生物安全(无花果。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)。当造成的肺炎小鼠KPN TRKP收到TIG治疗,明显观察肝脏中脂肪和水肿的变性(无花果。gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba)。然而,在收集到的器官没有明显的病理变化观察TCT, TTCT,和Ts-TPGS /帽奈米棒组,表明TIG封装后减少的不利影响、交付系统。这些结果是一致的与图所示。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

图9gydF4y2Ba — **图9:生物安全评价不同治疗方法。gydF4y2Ba**

讨论gydF4y2Ba

总之,TPGS-based和Ts-modified、输送系统有限合伙人定位和协同抗菌活动设计TIG交付和治疗MDR细菌引起的急性肺炎。准备Ts-TPGS /帽纳米棒能有效地封装TIG,实现持续的药物释放。通过Ts和有限合伙人之间的绑定,Ts-TPGS /帽展出目标和增强KPN和TRKP积累。tpg可以发挥其抑制能力的活动射流泵和的表达gydF4y2Ba肢端gydF4y2Ba,gydF4y2BaacrBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba在TRKP。这样,TIG内细菌浓度明显高于TTCT组比TIG和TTCT组。Ts和TIG之间的协同抗菌能力进一步增强抗菌活性TTCT,从而克服TRKP的耐药性。gydF4y2Ba

在小鼠肺炎,Ts-TPGS /帽专门积累在肺部。TTCT管理可以显著降低血液中的白细胞和中性粒细胞数量样品,降低总BALF细胞和CRP水平。此外,TTCT能够改善肺部嗜中性粒细胞浸润和减少BALF的细菌菌落,从而明显增加小鼠的存活率KPN和TRKP引起的肺炎。此外,TTCT导致肝脏毒性。这些结果表明,TTCT可以克服TRKP的耐药性。gydF4y2Ba

除了经典的gydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba(cKp)我们关注,hypervirulentgydF4y2Bak .肺炎gydF4y2Ba(hvKp)比cKp毒力更强,已成为全球病原体有关,并能引起社区获得性感染,通常在健康的个体gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。据报道,类似于cKp, hvKp菌株越来越耐抗菌素通过收购移动元素携带阻力因素。当广泛耐药cKp菌株获得hvKp-specific致病因素,新的hvKp菌株出现,导致院内感染gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。考虑的潜在严重性hvKp感染及其对转移性传播的倾向,tigecycline在特拉的经验性治疗扮演重要角色hvKp菌株。然而,tigecycline阻力已经报道的cKp应变演变成一个hvKP应变通过收购hvKP毒力质粒的一部分。外排泵基因的超表达gydF4y2BaacrRgydF4y2Ba及其调节基因gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba已经证明与tigecycline阻力gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba。根据我们的数据,我们推测TTCT系统仍有优势对特拉hvKp菌株。为tigecycline-sensitive hvKp, TTCT产生多个不同的机制和协同/添加活动Ts和TIG之间可能会减少细菌的可能性发展阻力。gydF4y2Ba

作为一个时间延迟抗生素效果(PAE)抗菌剂,药物动力学/药效学(PK / PD)与临床疗效相关参数tigecycline AUC /麦克风。对于tigecycline-resistant hvKp,增加麦克风和有限tigecycline剂量是穷人临床疗效的主要原因gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。麦克风减少TTCT赋予将有利于功效最大化和最小化tigecycline的与毒品有关的不良事件。gydF4y2Ba

总之,TTCT可能是一种有前途的治疗候选人MDR革兰氏阴性细菌引起的传染病。然而,有限合伙人之间的详细机制绑定和Ts肽需要进一步调查。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

研究符合所有相关的道德法规,浙江大学的批准。批准的体内研究动物保健和使用委员会第一附属医院、浙江大学医学院。gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

琥珀酸D-α-tocopherol聚乙二醇1000 (TPGS1000)提供的西格玛奥德里奇有限公司有限公司(美国)。的di-tert-butyl碳酸氢钠((中行)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO)从上海购买Medpep(上海,中国)。S-thanatin (Ts)肽(GSKKPVPIIYCNRRSGKCQRM)的新肽(GSKKPVPIIYANRRSGKAQRM)是由广州Sinoasis合成制药有限公司(广州)。无水氯化钙、磷酸氢二钠氯化亚锡、柠檬酸钠、氢氧化钠、2.5%戊二醛溶液和盐酸从化学试剂国药控股有限公司有限公司(中国)。6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和3 - (4 5-Dimethyl-thiazol-2-yl)−2, 5-diphenyltetrazoli-nbromide (MTT)是由σ化学。有限公司(美国)。KPN和TRKP菌株我们用临床分离株和亲切的国家重点实验室提供的诊断和治疗传染病的,第一附属医院、浙江大学医学院(杭州)。Tigecycline (TIG)是由阿拉丁(上海,中国)。内部标准tigecycline (D9-TIG)是由J&K化工有限公司有限公司(中国,北京)。营养琼脂和磅汤是由杭州微生物试剂有限公司有限公司(杭州)。异硫氰酸荧光素(FITC),吲哚菁绿(协调小组)和4%多聚甲醛(PFA)从Meilun生物技术有限公司有限公司(中国大连)。 Fetal bovine serum (FBS) was obtained from Sijiqing Biological Engineering Materials Co. Ltd. (Hangzhou, China). Ethidium bromide (EB) and carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) was obtained from Sigma Aldrich Co., Ltd. (USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) was supplied by Corning (USA). The oligonucleotide primers of肢端gydF4y2Ba,gydF4y2BaacrBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba罗摩gydF4y2Ba和16 s rRNA用于实时RT - pcr被Sangon合成生物技术(上海)有限公司,有限公司PrimeScript™RT试剂盒和SYBR预混料的前女友Taq装备从豆类购买生物医学科技有限公司有限公司(中国,北京)。Anti-myeloperoxidase (MPO)抗体购自Abcam(英国)。CD11b单克隆抗体(M1/70)和Ly-6G / Ly-6C单克隆抗体(RB6-8C5)从eBioscience购买。CRP的ELISA试剂盒获得博士德生物科技有限公司有限公司(武汉,中国)。其他化学试剂都是分析或色谱级。gydF4y2Ba

细胞株和动物gydF4y2Ba

EA.hy926(目录号:GNHu39)获得中国科学院细胞银行(上海,中国)。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)提供的细胞资源中心,ibm,摄像头/曾经(产品目录号:1101 hum-pumc000437)gydF4y2Ba

雄性ICR小鼠(6到8周大,22 - 25 g)是由浙江医学动物中心提供的,有免费的食物和水。动物被安置在大约22±2°C,湿度50±10% 12 h光/ 12 h暗周期。外科手术和体内实验根据美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验室动物和动物保健和使用委员会批准的第一附属医院,浙江大学医学院(参考号:2019 - 227)。gydF4y2Ba

Ts-TPGS的合成和表征gydF4y2Ba

Ts-TPGS (TT)是根据之前报道通过酯化反应合成方法,如无花果所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba。简而言之,Ts肽(20毫克)和(中行)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO(11.2µL)被添加到2毫升无水DMSO在冰浴,其次是在室温下搅拌12 h, 5毫升含有tpg的DMSO, DCC,和深度贴图添加到反应系统,搅拌是24小时持续60°C。中行保护组和2 M盐酸移除。随后,反应溶液放入1.0 kDa MWCO透析袋透析,de-ionized用水2天。然后,TT共轭冻干后得到。gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba核磁共振是用来证实Ts的结构,tpg和TT。gydF4y2Ba

纳米棒的制备和表征Ts-TPGS /限制gydF4y2Ba

Ts-TPGS /帽是由热液的方法gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba。简单地说,1毫升的NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba.12HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO(30毫米)添加一滴一滴地为1毫升CaCl组成的混合解决方案gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba解决方案(50毫米)和1毫升的TT(5毫克/毫升)的解决方案。然后,10毫克柠檬酸钠是添加到反应系统,与氢氧化钠和pH值调整到8。由此产生的混合物搅拌在100°C水浴4 h,其次是对蒸馏水透析24小时。然后,Ts-TPGS /帽冻干后得到了纳米棒。tpg /帽奈米棒是由相同的方法。颗粒大小、粒径分布和法制备的纳米棒的电动电势测定使用Zetasizer (3000 hs莫尔文仪器有限公司,英国。形态学观察,透射电子显微镜(TEM, JEOL jem - 1230,日本)。准备Ts-TPGS /帽的结晶度纳米棒是由小角度x射线衍射。gydF4y2Ba

的制备和表征TTCT、输送系统gydF4y2Ba

TIG封装是由添加TIG / HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba解决方案(2毫克/毫升)一滴一滴地阿水Ts-TPGS /帽的解决方案(2毫克/毫升)在不断搅拌。激动人心的另一个2 h后,混合溶液进行了透析(MWCO: 3.50 kDa)对去离子水4 h。在3500 g离心10分钟后,TTCT、交付系统。颗粒大小、粒径分布和电动电势测定使用Zetasizer, TEM和形态学检查。评估了稳定的纳米粒子尺寸的变化和PDI FBS-containing PBS水和10%。总药物含量TIG TTCT悬挂和未密封的TIG溶解在水中分离的超滤管(3.5 kDa,微孔,麻萨诸塞州,美国)被检测到紫外可见分光光度计(tu - 1080,北京)与一组波长245 nm。然后,下列方程应用于确定药物在装货(DL)和封装效率(EE)。gydF4y2Ba

$ $ {{{{{rm \ {DL}}}}}} \ % = \压裂{{{{{{rm \{质量}}}}}}\,{{{{{\ rm的{}}}}}}\,{{{{{rm \ {TIG}}}}}} \, {{{{{rm \{封装}}}}}}\,{{{{{rm \{在}}}}}}\,{{{{{rm \ {TTCT}}}}}}} {{{{{{rm \{质量}}}}}}\,{{{{{\ rm的{}}}}}}\,{{{{{rm \ {TTCT}}}}}}} \乘以100 \ % $ $gydF4y2Ba

(1)gydF4y2Ba

$ $ {{{{{rm \ {EE}}}}}} \ % = \压裂{{{{{{rm \{质量}}}}}}\,{{{{{\ rm的{}}}}}}\,{{{{{rm \ {TIG}}}}}} \, {{{{{rm \{封装}}}}}}\,{{{{{rm \{在}}}}}}\,{{{{{rm \ {TTCT}}}}}}} {{{{{{rm \{质量}}}}}}\,{{{{{\ rm的{}}}}}}\,{{{{{rm \ {TIG}}}}}} \, {{{{{rm \{添加}}}}}}}\乘以100 \ % $ $gydF4y2Ba

(2)gydF4y2Ba

的体外药物释放行为TTCT、输送系统由透析评估方法gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba。短暂,1毫升TTCT的解决方案是添加到透析袋(MW: 3.5 kDa)和透析对PBS包含的边后卫(pH值7.4)下不断摇晃在37°C (60 rpm)。在预定的时间点,增加了新的缓冲溶液后0.1毫升的释放介质。然后,HPLC-MS分析测定TIG浓度,和D9-TIG采用作为内部标准(是)。简而言之,收集到的样本稀释10倍空白的矩阵,其次是增加0.3毫升甲醇包含(500 ng / mL)。涡3分钟后,混合物在离心机在4°C 2500 g 12分钟,和获得的上层清液用于HPLC-MS TIG浓度测定。每个测量进行了一式三份。gydF4y2Ba

色谱分离进行水域BEH-C18列(50毫米×2.1毫米,1.7μm)。列的温度是35°C。梯度洗脱一个恒定的流速为0.50毫升/分钟。流动相是0.1%甲酸(v / v)和10毫米甲酸铵在水中,和移动阶段B是甲醇。梯度设置如下:启动B 5%,平衡为0.3分钟,B在接下来的1.7分钟增加到95%,维持0.5分钟,改变回5%的B,最后re-equilibrate下注射前为1.5分钟。总运行时间为4.0分钟,注入体积是2μL。质谱进行积极的应急服务国际公司模式,毛细管电压是2500千伏。碰撞能量优化在64 V TIG和54。破解电压30 V TIG和32 V。量化分析是使用多反应监测(MRM)进行的。 The protonated precursor → product ion combinations m/z were 586.31 → 456.21 for TIG and 595.30 → 514.30 for IS^59gydF4y2Ba。gydF4y2Ba