文摘gydF4y2Ba
癌症肿瘤相关成纤维细胞(战乱国家)支持通过多种机制,包括维持免疫抑制肿瘤微环境和限制渗透的免疫细胞。的prolyl异构酶Pin1的超表达在战乱国家尚未完全描述,在肿瘤发生和发展中扮演着重要角色。破译的影响在战乱国家选择性Pin1抑制胰腺癌,这里我们制定DNA-barcoded micellular系统(DMS)封装AG17724 Pin1抑制剂。DMS携带CAF-targeting anti-FAP-α抗体(antiCAFs-DMS)能选择性地抑制Pin1在战乱国家,导致有效但瞬态抑制肿瘤的生长。我们进一步整合DNA寡核苷酸适配子(AptT),可与CD8 + T淋巴细胞,获得双特异性antiCAFs-DMS-AptT系统。AntiCAFs-DMS-AptT抑制肿瘤生长在皮下和原位胰腺癌模型。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
癌症免疫疗法,包括检查点封锁,过继性细胞疗法,癌症疫苗和双特异性T细胞衔接器,显示潜在的治疗癌症gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。尽管如此,只有一小部分的病人中有一大群人可以积极回应这些免疫疗法gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5克ydF4y2Ba。累计发现有相关的免疫抑制肿瘤微环境(时间)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,癌症相关的成纤维细胞(保护)极大的贡献gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。战乱国家是异构基质细胞和著名的组件的时间在实体肿瘤和形状时间走向宽容和免疫抑制的免疫生态系统环境通过多种机制,包括多种细胞因子和趋化因子的产生,然后中介招聘和先天和适应性免疫细胞的功能分化gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。此外,战乱国家可以直接与肿瘤浸润免疫细胞在消极方面,废除其功能的肿瘤细胞死亡gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
Prolyl异构酶Pin1,高度表达的癌细胞和战乱国家gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,促进多个cancer-driving通路通过调节的构象转变磷酸化丝氨酸/ Threonine-Proline图案gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。药物抑制Pin1因此被认为是一种有效的抗癌策略gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。一些小分子化合物抑制Pin1,如all-trans视黄酸、三氧化二砷,胡桃酮,AG17724,可耐福天津公司- 6566和sulfopin,已确定和使用或重新设定调查的作用Pin1在肿瘤形成gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。所有这些化合物,然而,当应用于体内,只有一小部分金额终于可以分发注入肿瘤。gydF4y2Ba
找出Pin1在战乱国家的独家影响肿瘤进展,一个策略可以通过定制的关于交付目前Pin1抑制剂药物输送系统(dds)战乱国家。dds,包括这些针对战乱国家,不断证明他们的临床成功甚至细胞或亚细胞定位药物运输gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba。dds制定Pin1抑制剂的战乱国家,然而,还没有被开发出来。dna条码技术在dds最近已经成为一个卓越的和适用的方法来追踪纳米颗粒的药物进入肿瘤细胞gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,促进纳米粒子的发现针对特定的组织和细胞gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,或使可调功能化免疫细胞调制的生物材料gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。在此,我们报告一个DNA-barcoded micellular系统交付Pin1抑制剂AG17724(指定为DMS)(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。DMS携带抗体针对战乱国家(antiCAFs-DMS)是专门定制的交付AG17724战乱国家在皮下和原位胰腺导管腺癌(PDAC),从而帮助我们理解Pin1在战乱国家支持PDAC增长的函数。此外,antiCAFs-DMS安装与免疫cell-recruiting DNA适体与CD8 (antiCAFs-DMS-AptT)gydF4y2Ba+gydF4y2Ba为根除PDAC T淋巴细胞。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
DMS包AG17724并显示DNA条形码后功能化gydF4y2Ba
我们准备好的挂钩的DMS通过自组装gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba胆固醇(挂钩gydF4y2Ba5 kgydF4y2Bacho), DNA-barcoded胆固醇(BarcodeX-Cho)和Pin1抑制剂AG17724(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。疏水性AG17724驱使其封装的胆固醇DMS的核心。亲水的挂钩gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba聚合物周围DMS应该稳定系统gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。DNA条形码最后DMS可以促进post-functionalization,允许顺序和可靠的DNA-conjugated附件配体。从理论上讲,许多不同的条形码,这对应于一个特定的DNA序列,可以在这里使用。我们使用三个(补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)展示的概念。除此之外,所有这些材料现在商用和广泛应用于生物医学研究,从而促进生殖力和加速翻译。gydF4y2Ba
计算出光学DMS准备,barcode1-Cho的摩尔比率/ barcode2-Cho / barcode3-Cho /挂钩gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba在1/1/1/7曹是固定的,而系列浓度的(从10到40毫克/毫升)和AG17724(从0.05到1.2毫克/毫升)测量的扫描相应的规模和多分散性指数(PDI)(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。它显示大小30到60 nm之间总是在PDI增加到超过0.1一旦胆固醇物质的浓度超过30毫克/毫升。这使我们使用“20毫克/毫升胆固醇材料1.2毫克/毫升AG17724”准备最后的DMS,曾AG17724封装效率和装载效率为83.6±1.9%和45.8±2.4%,分别。DMS在43±1.8 nm和PDI规模为0.05±0.01。DMS -电动电势在−4.3 mV(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),它应该主要由DNA条形码。DMS在室温下显示尺寸稳定性与10%血清1周(补充图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)。不到10%的加载AG17724发布在这一周的评价,进一步证明其稳定性(补充图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。这延迟发布在体外可以减少风险的立即释放AG17724 DMS的血液,减轻脱靶效应。由目标细胞内化后,由溶酶体释放AG17724将加速。gydF4y2Ba
检查DNA条形码DMS的可用性,我们使用互补DNA链连接不同的荧光探针(补充表gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba),包括Cy5, Cy3.5 Alexa488,可视化。消除过度通过透析探针后,我们跑样品2%琼脂糖凝胶,然后成像凝胶在特定的通道(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。从DMS样品我们都可以检测到信号,表明三种不同的条形码都是好,可即使很难绝对量化每个条码。一组这些条形码作为坐标杂交DNA-conjugated CAFs-targeting抗体(antiCAFs)(补充图。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)获得antiCAFs-DMS(无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。我们使用了抗体识别膜生物标志物,成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α),在战乱国家antiCAFsgydF4y2Ba35gydF4y2Ba。此外,旨在直接免疫细胞对肿瘤,我们杂化DNA寡核苷酸适配子(补充表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),这是绑定CD8的筛选gydF4y2Ba+gydF4y2BaT淋巴细胞高特异性和选择性gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,另一组条形码antiCAFs-DMS双特异性antiCAFs-DMS-AptT。水动力大小antiCAFs-DMS和antiCAFs-DMS-AptT也约63纳米(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba),大约20 nm大于DMS。透射电子显微镜(TEM)成像的负染色样品进一步验证大小差异(图中这三个准备。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。我们验证了抗体的存在antiCAFs-DMS和antiCAFs-DMS-AptT凝胶银染色后释放抗体通过DNase我消化(无花果。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Antibody-functionalized DMS选择性地抑制Pin1战乱国家gydF4y2Ba
我们通过正常成纤维细胞的诱导分化培养的战乱国家(NIH-3T3细胞)与转化生长因子β(TGF-β)gydF4y2Ba37gydF4y2Ba通过展示,我们验证其可靠性大大增加表达式FAP-α和alpha-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。流cytometry-based细胞吸收的高选择性分析显示antiCAFs-DMS和antiCAFs-DMS-AptT战乱国家而不是胰腺癌细胞(Pan02),显示大约70倍(图的差异。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。进一步的定性(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)和定量(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)分析吸收antiCAFs-DMS Pan02细胞,NIH-3T3细胞和战乱国家展示了类似的差异。gydF4y2Ba
然后,我们研究了细胞毒性的配方Pan02细胞(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)和战乱国家(无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。欠其细胞渗透性不佳gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba、复合AG17724本身显示出高度的集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba约50μM细胞。集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2BaDMS的超出了我们的实验范围的细胞,这是由于其较低的细胞吸收效率。有趣的是,antiCAFs-DMS和antiCAFs-DMS-AptT显示他们的集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba在大约1.2μM战乱国家,而对Pan02细胞的细胞毒性要低得多。这表明,附加FAP-α抗体首先可以帮助antiCAFs-DMS和antiCAFs-DMS-AptT针对战乱国家,然后他们也可以促进细胞内化的整个系统,实现一个特定的和有效的交付Pin1抑制剂在战乱国家。gydF4y2Ba
研究选择性抑制Pin1 AG17724催化活性,我们执行PPIase测定和比较与其他Pin1 AG17724抑制剂包括all-trans视黄酸(ATRA)和胡桃酮。AG17724显示Pin1更有效抑制能力(Ki 0.03μM)比ATRA (Ki 1.99μM)或胡桃酮(Ki 10μM以上)(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在细胞水平上,我们的影响相比AG17724或antiCAFs-DMS Pin1击倒战乱国家的扩散(补充图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)和野生型战乱国家,表明Pin1-knockdown战乱国家更能抵抗AG17724(补充图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)或antiCAFs-DMS(补充图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba比野生型战乱国家)。进一步支持论文Pin1 AG17724目标细胞,我们接下来进行RT-qPCR检查AG17724的影响,antiCAFs-DMS, ATRA或Pin1击倒丰富的癌基因和肿瘤抑制的表达式是由Pin1监管gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba。野生型战乱国家,它表明AG17724本身不能改变这些成绩单的丰度,又可因其细胞渗透性差gydF4y2Ba40gydF4y2Ba。antiCAFs-DMS显示类似的治疗能力ATRA或shPin1影响转录这些选定的基因(补充图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba),这表明AG17724由antiCAFs-DMS确实抑制Pin1。gydF4y2Ba
看看Pin1可以抑制,细胞治疗0.5μM AG17724 4小时和相关蛋白质进行了分析。作为多种癌症相关通路的关键修饰符,Pin1显示激活已经超过55蛋白质,包括β-catenin NF-κB,一种蛋白激酶。我们这里检查他们,我们观察到,对胰腺癌细胞,Pin1和这三个相对蛋白质在相似的水平无论他们处理磷酸盐(PBS) AG17724或antiCAFs-DMS(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba克,gydF4y2BahgydF4y2Ba)。战乱国家,antiCAFs-DMS显著抑制Pin1,也有效地抑制β-catenin, NF-κB, AKT不同的区段。AG17724本身显示抑制AKT的能力,然而,这并没有阻止Pin1,β-catenin, NF-κB(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba我,gydF4y2BajgydF4y2Ba)。这些结果显示相似的细胞吸收部分和细胞毒性部分提到的,进一步表明antiCAFs-DMS强有力的战乱国家的选择性Pin1抑制。gydF4y2Ba
Pin1禁忌在战乱国家降低胰腺癌的入侵和增长球状体gydF4y2Ba
战乱国家已经显示增强不同肿瘤的生长gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。胰腺癌,尤其是分子肿瘤细胞之间的串扰和战乱国家促进肿瘤侵袭和增长gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。在战乱国家确定选择性Pin1抑制影响药物对胰腺癌细胞的行动能力,我们进行了成品胰腺癌球状体的间接共培养与战乱国家(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。与球状体培养在同等条件下但没有添加战乱国家,球状体与间接战乱国家培养显示入侵细胞在其表面,确认战乱国家可以远程作用于肿瘤细胞,这可能是通过体液因素(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。AG17724(0.5μM)未能抑制入侵迹象在球状体基底膜基质。相比之下,antiCAFs-DMS治疗停止入侵球状体,显示萎缩的利润。这些球状体进一步的动态卷记录显示,抑制的antiCAFs-DMS对其增长的影响(图gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。治疗antiCAFs-DMS球状体,表现在活细胞坏死细胞的比例最低(补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。这些结果在一起首先强调,Pin1是重要的战乱国家促进经济增长和入侵胰腺癌球状体。其次,我们表明,Pin1抑制剂AG17724交付,通过antiCAFs-DMS,战乱国家可能是另一种强有力的方式对胰腺癌的治疗。gydF4y2Ba
适配子修改战乱国家antiCAFs-DMS桥梁T淋巴细胞gydF4y2Ba
实体肿瘤,尤其是PDAC,经常显示他们的抗免疫疗法gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。除了自己的免疫抑制时间,癌细胞使虚弱的抗肿瘤免疫免疫细胞通过分泌或居民的抑制分子和与战乱国家合作,密集的架构,主要由战乱国家的贡献,提高身体免疫细胞渗透到外围障碍活跃gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba。桥接与兴趣活跃外围PDAC T淋巴细胞,我们准备好的antiCAFs-DMS-AptT如上所述。孵化后小鼠CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞与Cy5-labeled系统(无花果。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba),流式细胞仪分析显示细胞处理antiCAFs-DMS-AptT荧光强度大大高于细胞antiCAFs-DMS处理,确认这个适配子装饰可以有效地引导系统坚持T细胞(图gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)。没有很大的区别,在Cy5 T细胞信号,在时间点的0.5,1和4个小时,这表明绑定和饱和度都快。gydF4y2Ba
自从antiCAFs-DMS-AptT包含针对战乱国家的抗体也寡核苷酸适配子CD8的绑定gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞,在理想的情况下可以作为双特异性模块,在免疫治疗已经显示出有前途的潜力gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba战乱国家,桥T细胞。要验证这一点,我们进行了战乱国家和T细胞在体外的培养(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)。我们发现,T细胞几乎没有坐落在战乱国家antiCAFs-DMS治疗。AntiCAFs-DMS-AptT治疗,然而,对战乱国家显示其效果桥T细胞(图gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)。这些结果表明,除了对战乱国家的Pin1, antiCAFs-DMS-AptT可能也可以直接对战乱国家T淋巴细胞,从而导致更多的免疫细胞在时间。是不同于双特异性抗体、寡核苷酸适配子或纳米颗粒,通常仍然不能克服身体障碍的PDAC, antiCAFs-DMS-AptT可以为T淋巴细胞呈现实体肿瘤可访问。我们也孤立主CD8鼠gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞进行体外共培养实验和战乱国家luciferase-expressing癌细胞。我们的研究结果表明,antiCAFs-DMS-AptT可以显著诱导CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞介导细胞溶解在战乱国家和癌细胞(补充图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba),这表明antiCAFs-DMS-AptT的确做过双特异性CD8系统桥gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞战乱国家和附近对胰腺癌细胞发挥细胞毒性的影响。gydF4y2Ba
的适配子修改antiCAF-DMS-AptT以前发现纯CD8的无踪迹的隔离gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在高收益率gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。AntiCAFs-DMS-AptT因此旨在CD8绑定gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞而不是得到内化。为了证明这一点,我们用DNase我治疗移除antiCAFs-DMS-AptT-Cy5 CD8表面gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞,并测量了Cy5信号之前和之后(补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),表明DNase我可以几乎完全减少Cy5信号从高水平的PBS治疗。这表明antiCAFs-DMS-AptT避CD8细胞表面的gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。此外,我们研究CD8的可行性gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞与AG17724孵化后,DMS, antiCAFs-DMS或antiCAFs-DMS-AptT 48小时。在被封装到DMS,它表明AG17724毒性T细胞减少(补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。我们进一步测试CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞功能治疗后0.5 -μm AG17724相应antiCAFs-DMS-AptT,通过测定T细胞扩张,IFN-γ,2、TNF。我们的结果(补充图。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)显示antiCAFs-DMS-AptT并不影响T细胞的功能这四个方面。我们可以认为这些非常低的DMS系统的T细胞。gydF4y2Ba
从Pin1 Biodistribution和效果在战乱国家和T细胞接触抑制gydF4y2Ba
评估我们的交付系统能否成功地分发到肿瘤体内,我们标记他们Alexa750然后静脉注射管理小鼠皮下PDAC轴承。4个小时后,我们可以看到,肝脏是主要的bio-distributing器官系统(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。非常低Alexa750信号检测的心,肺,脾脏和肾脏。对于肿瘤,它表明antiCAFs-DMS和antiCAFs-DMS-AptT都可以积累比DMS肿瘤更有效率。使它更精确的定量,我们准备从这些器官或收集肿瘤匀浆,然后成像并进行定量分析(图。gydF4y2Ba5克ydF4y2Bab,gydF4y2BacgydF4y2Ba)。调查显示,与器官成像相同的趋势特征呈现,与DMS相比,抗体装饰改善了肿瘤积累了约两倍。gydF4y2Ba
然后我们评价他们的体内抗肿瘤作用遵循我们的治疗计划(无花果。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)。体重变化记录。控制老鼠相比(生理盐水),AG17724注入(10毫克/公斤)加速减肥,证明化合物本身导致毒性小鼠。所有治疗nano-formulated AG17724减慢体重不同程度的损失。AntiCAFs-DMS-AptT治疗显示能力稳定体重在整个实验期间(无花果。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。在肿瘤的生长,我们没有看到任何影响AG17724本身。DMS和DMS的混合物,抗体,寡核苷酸适配子(DMS + antiCAFs + AptT)政府稍微推迟了肿瘤的生长。AntiCAFs-DMS稳定肿瘤40天左右,但它未能抑制其增长。AntiCAFs-DMS-AptT显示其有前途的抗癌能力,几乎消除了肿瘤(图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。因此,小鼠的存活时间也将antiCAFs-DMS-AptT列为最好的抗肿瘤制剂在治疗(无花果。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
战乱国家和T细胞在肿瘤组织量化gydF4y2Ba
检查如果我们CAFs-targeting Pin1抑制剂运载系统工作,正如所料,阻止Pin1在肿瘤治疗,我们把肿瘤25日fluorescence-activated细胞排序分析。战乱国家统计表明,肿瘤内部战乱国家减少的百分比从36.3%到20.3%,5.6%,2.5%,DMS, antiCAFs-DMS,分别和antiCAFs-DMS-AptT(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个,gydF4y2BabgydF4y2Ba)。这表明,DMS携带CAFs-targeting抗体可以改善其特异性,导致更多的战乱国家消耗。脂滴与孤立的战乱国家积累试验表明,antiCAFs-DMS-AptT可以显著增加液滴的数量在战乱国家(补充图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba),这意味着有效Pin1抑制导致战乱国家可以静止。细胞因子分析表明,从antiCAFs-DMS-AptT Pin1抑制治疗抑制战乱国家分泌多种细胞因子,而细胞治疗AG17724有相似的配置文件控制(补充图。gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba)。高表达的细胞因子,包括il - 6和引发,被视为炎症战乱国家的指标。我们看见他们的表情antiCAFs-DMS-AptT治疗后下降,告诉我们,治疗并没有真正引起染色炎症战乱国家战乱国家。gydF4y2Ba
Pin1和相关蛋白在这些分类细胞进行了分析通过西方的污点。显著地抑制了战乱国家的肿瘤,Pin1 antiCAFs-DMS治疗而AG17724没有显示其效果。此外,β-catenin、NF-κB和AKT的激活部分由Pin1控制,也被antiCAFs-DMS(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac,gydF4y2BadgydF4y2Ba)。排序的胰腺癌细胞的肿瘤,我们没有看到这些蛋白质的变化(图的数量。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae,gydF4y2BafgydF4y2Ba)。由于我们的交付系统包含DNA条形码,它促进我们执行qPCR量化DNA条形码的数量分布在战乱国家和non-CAFs细胞。我们发现在22倍DNA条形码在战乱国家比在non-CAFs细胞(补充图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。这些结果直接一起进一步证实antiCAFs-DMS细胞选择性对战乱国家的体内。除了Pin1抑制在战乱国家,antiCAFs-DMS-AptT治疗,几乎根除了肿瘤,也应该作为双特异性CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞衔接器。我们证明了这种通过比较CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞数量在肿瘤治疗antiCAFs-DMS或antiCAFs-DMS-AptT。我们发现intratumor CD8的多出约16%gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(16.8%)比antiCAFs-DMS antiCAFs-DMS-AptT治疗治疗(0.1%)(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba克,gydF4y2BahgydF4y2Ba)。这些CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞进一步异形是活跃而不是疲惫(补充图。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。这证实了我们的期望,也告诉我们,在战乱国家Pin1抑制和CD8的结合gydF4y2Ba+gydF4y2BaT淋巴细胞参与可能是一个有效的方式来呈现PDAC可根除的。gydF4y2Ba
的反应原位antiCAFs-DMS-AptT小鼠胰腺癌gydF4y2Ba
我们进一步建立原位PDAC评估如果antiCAFs-DMS-AptT治疗胰腺消灭癌细胞。Luciferase-expressing Pan02细胞(Pan02-Luc)我们在这里帮助我们,通过直接生物荧光成像,监测癌症发展。老鼠接受了他们的第一个治疗15天邮报》14日癌细胞植入(无花果。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。剂量管理每个配方与AG17724 10毫克/公斤。经过四次的治疗,它表明,老鼠antiCAFs-DMS-AptT集团几乎没有从癌细胞发光信号(无花果。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba),表明强有力的anti-PDAC antiCAFs-DMS-AptT在原位胰腺癌模型的有效性。空antiCAFs-DMS-AptT(没有AG17724封装)显示肿瘤恶化(补充图上没有抑制作用。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。这可能是由于固有的肿瘤异质性和高度多和免疫抑制胰腺癌的身上,这限制了T细胞浸润。尽管DMS或antiCAFs-DMS也显示他们的能力稍微减慢癌细胞的增长率在胰腺,小鼠与他们有经验的增加肿瘤负担(图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。相应地,antiCAFs-DMA-AptT显著延长小鼠的生存时间,存活率为100%(图在我们80天的调查。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)。原位肿瘤的细胞群分析表明antiCAFs-DMS-AptT治疗不仅导致战乱国家消耗(无花果。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba),而且CD8的增加gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba7gydF4y2Baf,gydF4y2BaggydF4y2Ba)的肿瘤。gydF4y2Ba
自从biodistribution结果表明antiCAFs-DMS-AptT分布在肝脏的主要部分,我们评估是否会影响肝脏功能通过测量glutamic-pyruvate转氨酶(GPT) glutamic-oxaloacetic氨基转移酶1 (GOT1)、总蛋白(TP)、白蛋白(铝青铜)、总胆红素(治疗组)和碱性磷酸酶(ALP)的40岁gydF4y2BathgydF4y2Ba天的治疗计划。虽然六个指标的值波动AG17724或antiCAFs-DMS-AptT治疗,他们在正常范围内(补充图。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。这表明,无论是自由AG17724还是antiCAFs-DMS-AptT引起明显的肝毒性,代表antiCAFs-DMS-AptT是生物相容性在治疗。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
由于关键作用Pin1在肿瘤起始和进展,小分子抑制Pin1不断被屏蔽或开发。然而,这些抑制剂可以失去的药理作用体外一旦管理和稀释体内。此外,几可用药物针对Pin1重新改造的抑制肿瘤,通常可以抑制Pin1但不能限制肿瘤的抑制在一个特定的细胞群gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。的DNA-barcoded micellular系统我们正在开发这个工作证明可行性调节Pin1在感兴趣的细胞群。这将给洞察具有抗肿瘤靶向治疗而不是在整个肿瘤组织的水平。gydF4y2Ba
人口结构的实体肿瘤通常是抵抗目前的疗法,这是高度由战乱国家gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba。最近的文献表明,过表达Pin1显示在癌细胞和战乱国家,加剧PDACgydF4y2Ba17gydF4y2Ba。Pin1多少战乱国家有助于肿瘤进展,然而,未知,因为缺乏专门的药物阻断Pin1战乱国家。我们发现Pin1抑制剂AG17724可以有针对性的为战乱国家,无论是在体外和体内,通过通过antiCAFs-DMS交付它。功能,antiCAFs-DMS选择性大大抑制Pin1战乱国家,导致细胞毒性在战乱国家高于胰腺癌细胞。AG17724本身没有显示任何体内抗肿瘤疗效,可能与细胞渗透性差的化合物gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba。有趣的是,我们发现有效Pin1抑制在战乱国家,通过antiCAFs-DMS可以减缓皮下和原位胰腺癌PDAC的增长。但是,这不是一个有效的方法来阻止肿瘤因为他们增长快一旦我们停止注射毒品。gydF4y2Ba
免疫疗法可以结合化疗获得更好的抗肿瘤功效gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,我们准备双特异性antiCAFs-DMS-AptT。人工双特异性模块,包括双特异性抗体、双特异性寡核苷酸适配子,和双特异性纳米粒子成为强有力的抗肿瘤药物通过指挥宿主对肿瘤细胞的免疫细胞gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba。某些类型的实体肿瘤的高度多时间,然而,可以限制他们的免疫细胞进入肿瘤组织的能力gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。我们发现antiCAFs-DMS-AptT可以消除肿瘤。我们推测,Pin1抑制在战乱国家antiCAFs-DMS-AptT首先可以扰乱多和免疫抑制时间,导致免疫细胞浸润的访问时间。一开始,anti-CAFs-DMS-AptT可能无法使CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT淋巴细胞在胰腺肿瘤组织,然而,antiCAFs-DMS-AptT仍然可以AG17724交在战乱国家,从而破坏胰腺癌的免疫抑制时间,使其“可以”和“活性”免疫细胞。最近的论文认为,PDAC Pin1抑制在战乱国家通过化合物可以改变PDAC的高度多和免疫抑制时间,使PDAC可根除的免疫疗法gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。在接下来的治疗阶段,anti-CAFs-DMS-AptT CD8重定向gydF4y2Ba+gydF4y2BaT淋巴细胞在胰腺肿瘤组织,导致根除癌细胞。gydF4y2Ba
总之,我们演示了antibody-functionalized DNA-barcoded micellular系统的选择性Pin1抑制在战乱国家可以实现。这使得胰腺肿瘤细胞毒性T淋巴细胞参与可根除的。DNA条形码这些micellular系统提供了一个容易改变的方式来自定义目标需求,为Pin1抑制某些肿瘤的细胞群,从而揭示机械细节Pin1支持肿瘤起始和进展。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
道德调节gydF4y2Ba
所有动物实验程序是四川大学动物实验伦理委员会批准(中国成都)。gydF4y2Ba
试剂、细胞和老鼠gydF4y2Ba
AG17724,绝对乙醇、氯仿和二甲亚砜从Sigma-Aldrich购买。DNA barcodes-cholesterol轭合物(Barcode1-Cho: GTGATGGAGATTTATTCTCTT-Cho;Barcode2-Cho: AAAAGAATGATGATAATCATG-Cho;Barcode3-Cho: AGTACTGTGCTAAGATGGTGT-Cho), DNA-florescent轭合物(AAGAGAATAAATCTCCATCAC-Cy5;CATGATTATCATCATTCTTTT-Cy3.5;ACACCATCTTAGCACAGTACT-Alexa488), DBCO-modified DNA寡核苷酸(AAGAGAATAAATCTCCATCAC-DBCO),底漆Barcode1-Cho(转发:GTGATGGAGATTTAT;反向:AAGAGAATAAATCTC)和DNA寡核苷酸适配子(AAGAGAATAAATCTCCATCACCCAGAGTGACGCAGCAACAGAGGTGTAGAAGTACCGTGAACAAGCTTGAAATTGTCTCTGACAGAGGTGGACACGGTGGCTTTTAGT)被集成的DNA合成技术。挂钩gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba赵是购自Nanosoft聚合物(温斯顿塞勒姆,美国)。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM、高葡萄糖),胎牛血清的边后卫,penicillin-streptomycin, Trypsin-EDTA(0.25%)和磷酸盐(PBS)购自热费舍尔科学。Anti-FAP-α抗体(mab9727 - 100、0.25µg /毫升浓度。工作)和anti-phospho-CDC2 / CDK1 (Y15)抗体(AF888-SP 0.2µg /毫升工作浓度。)从研发系统购买。Anti-α-SMA抗体(ab5694,1µg /毫升浓度。工作),anti-Pin1抗体(epr18546 - 317, 1/2000稀释工作。),anti-β-catenin抗体(IGX4794R-3 1µg /毫升浓度。工作),anti-NF-κB p65抗体(ab207297 1µg /毫升浓度。工作),anti-AKT1(磷T308)抗体(ab278565 0.1µg /毫升浓度。工作),anti-GAPDH (6 c5)抗体(ab8245, 1/2000工作浓度。),抗体标记的Cy3接合工具包(ab188287)和抗体标记Cy5接合工具包(ab188288)从abcam购买。Anti-phospho-Akt (Thr308)抗体(05 - 802 R, 1/1500稀释工作。)从Sigma-Aldrich购买。HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L) cross-adsorbed二级抗体(g - 21040、1/10000稀释工作),FITC-labeled鼠标anti-CD3 (a2) 17日抗体(11-0032-82,1µg /毫升浓度。工作),PE-labeled鼠标anti-CD8抗体(12-0081-82,1µg /毫升浓度。工作)和anti-CDK1(第A17)抗体(33 - 1800 1µg /毫升工作浓度。)从热费希尔科学购买。艳紫510™anti-mouse CD45抗体(103137 1µg /毫升浓度。)从BioLegend购买。Pan02细胞系(crl - 2553)和NIH-3T3细胞系(crl - 1658)写明ATCC(美国)购买的。从Labcorp Pan02-Luc细胞系购买。不灭的小鼠CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞系(MOHITO)从反弹道导弹(T0131)购买。6周大女C57BL / 6小鼠从成都购买Dashuo生物研究所(成都,中国)。gydF4y2Ba
nano-formulations的制备和表征gydF4y2Ba
我们使用了薄膜水化法DMS做准备。在100毫升圆底烧瓶,系列(如显示在无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)barcode1-cho、barcode2-cho barcode3-cho挂钩gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba曹(摩尔比barcode1-cho / barcode2-cho / barcode3-cho /挂钩gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba赵是固定在1/1/1/7)和AG17724溶解在有机溶剂含有10毫升的绝对乙醇和1毫升以下1小时37°C。获得薄膜,在真空下,溶剂被使用旋转蒸发。烧瓶进一步干在真空干燥过夜。薄膜水化在PBS为0.5小时37°C水浴。收集解决方案被探针用超声发生器在80 W 75秒。最后一步是通过无菌过滤样品polyethersulfone膜孔径在0.22μm(美国Sigma-Aldrich)。gydF4y2Ba
准备antiCAFs-DMS, DMS与DNA-antibody共轭孵化,过度的摩尔量10倍比barocode1 DMS,一夜之间在PBS 37°C。样品在2 K×离心液gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟,过度DNA-antibody轭合物在上层清液和被移除。gydF4y2Ba
准备antiCAFs-DMS-AptT, DMS孵化了DNA-antibody共轭(10倍比barocode1过度DMS)和DNA apatamers(10倍比barocode2过度DMS)一夜之间在PBS 37°C。样品在2 K×离心液gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟,过度DNA-antibody轭合物和DNA寡核苷酸适配子在上层清液,然后被删除。gydF4y2Ba
粒子大小、PDI和zeta电位测量通过莫尔文Zetasizer Nano ZS90仪器(英国莫尔文仪器有限公司)。gydF4y2Ba
药物释放试验gydF4y2Ba
体外,AG17724释放研究使用透析方法执行在37°C 1星期。PBS含有0.1% (v / v) 80年渐变作为释放缓冲区。Nano-formulations被置于透析管(MWCO = 8000 Da)和紧密密封。然后透析管放入40毫升释放缓冲区和37°C下孵化与温柔的振荡50 rpm。在特定的时间点,1毫升的采集标本,然后离心机为0.5小时。AG17724释放量化在上层清液通过高效液相色谱法。100μL的释放介质被释放了,取而代之的是相同体积的新鲜缓冲区。然后用二甲亚砜和样本稀释的浓度AG17724测定波长λ= 225海里,高效液相色谱法。gydF4y2Ba
DNA-antibody接合gydF4y2Ba
我们使用SiteClick™抗体叠氮基附件(美国表达载体)共轭DNA寡核苷酸的Fc地区免疫球蛋白抗体。鼠标anti-FAP-α抗体集中和缓冲交换200μg 50μL抗体制备缓冲(组件),然后我们修改了碳水化合物领域的抗体通过添加10μLβ检测牛乳糖(D)组件和6小时孵化。Azide-attached抗体是一夜之间通过一个反应(30°C) UDP-GalNAz (E)和高尔特酶(组件H)。在最后一步,DBCO-modified被添加到DNA寡核苷酸Azide-attached抗体为4 copper-free点击化学的行动。在每个步骤中,兴趣是纯化的产物通过50 K Amicon超- 0.5毫升离心过滤器。gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
Pan02细胞和NIH-3T3细胞在DMEM培养(高葡萄糖)中含有10%的边后卫,50单位/毫升的青霉素,50µg /毫升的链霉素37°C的5%的股份有限公司gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba湿润环境孵化器(美国热费希尔科学)。gydF4y2Ba
战乱国家,NIH-3T3细胞孵育10 ng / mL的TGF-β24小时。验证战乱国家,收集细胞悬浮液和孵化Cy5-labeled anti-FAP-α抗体或Cy3-labeled anti-α-SMA抗体在室温20分钟。洗后用冷PBS三次,50 K细胞分析流式细胞分析仪(Cytomics™FC 500年,贝克曼库尔特,迈阿密,佛罗里达州美国)量化荧光强度。gydF4y2Ba
MOHITO细胞培养在37°C six-well板有限公司5%gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba湿润环境孵化器(美国热费希尔科学)。这个细胞系的媒介是Prigrow II中(美国abm)包含20%的边后卫,10 ng / mL鼠标IL-7, 50单位/毫升的青霉素,链霉素的50µg /毫升。gydF4y2Ba
细胞吸收化验gydF4y2Ba
为定量分析,细胞被播种到six-well板块为100 K细胞的密度好,培养24小时。Cy5-labeled DMS、antiCAFs-DMS或antiCAFs-DMS-AptT被添加到细胞,在最后Cy5浓度2毫克/毫升,4小时孵化。细胞被洗冷PBS两次,使胰蛋白酶化和resuspended 0.5毫升的PBS。Cy5强度的细胞是由一个流式细胞分析仪测量(Cytomics™FC 500年,贝克曼库尔特,迈阿密,佛罗里达州,美国)。50 K细胞为每个样本都被记录下来。gydF4y2Ba
显微成像、细胞密度的10 K细胞/嗯,被播种到8-well室(Millicell®EZ幻灯片,默克密理博)24小时之前我们nano-formulations添加。4小时孵化后,细胞在水井洗冷PBS三次,其次是固定的4% (v / v)多聚甲醛。核与DAPI沾Fluoroshield安装介质(Abcam)。荧光成像技术进行Axio成像仪。平方米(德国蔡司)。gydF4y2Ba
细胞生存能力分析gydF4y2Ba
我们执行一个ATP-based发光细胞生存能力分析使用CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析(Promega)。细胞被播种到96孔不透明白色聚苯乙烯微型板块(康宁),在每口井的20 K细胞的密度,和培养24小时。细胞与不同浓度的AG17724孵化,DMS, antiCAFs-DMS或antiCAFs-DMS-AptT。48小时后,盘子被平衡在室温为0.5小时。细胞细胞溶解在100年μL CellTiter-Glo试剂(Promega) 2分钟。孵化后在室温下10分钟,发光测量多模上标(热费希尔科学Varioskan Flash,美国)。gydF4y2Ba
西方墨点法gydF4y2Ba
感兴趣的细胞收获和细胞溶解,细胞裂解缓冲(Beyotime,中国)。sds - page凝胶电泳的样品上运行自制的10%。然后样本从凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)的电影,这是下一个孵化与反主要抗体(1:1 K) 24一夜之间。PVDF膜孵化与HRP-labeled山羊anti-rabbit二级抗体(1:5 K)和清洗。在最后,二次抗体检测到西方合止动剂基质(美国Billerica微孔)在6000年ChemiScope触摸系统(上海,中国)。gydF4y2Ba
胰腺癌的间接共培养和战乱国家球状体gydF4y2Ba
文化胰腺癌球状体,在37°C 5%二氧化碳湿润环境中孵化器(美国热费希尔科学),3 K Pan02细胞(每个)被播种到超低附件96孔板与圆底(康宁)7天文化DMEM(高葡萄糖)与20%的边后卫,50个单位/毫升的青霉素和链霉素50µg /毫升。gydF4y2Ba
间接共培养实验,十瀑样肾小球滤过率(GFR)被转移到50毫升基底膜基质(356231年,康宁)DMEM(高葡萄糖)与20%的边后卫,50单位/毫升的青霉素,链霉素的50µg /毫升。50 K战乱国家,pre-incubated 0.5μM AG17724或antiCAFs-DMS,被播种在基底膜基质为7天,紧随其后的是录音瀑样增长使用Cyntellect Celigo (Cyntellect)和分析瀑样大小使用Cyntellect Celigo软件(版本1.3,Cyntellect)。gydF4y2Ba
CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞结合分析法gydF4y2Ba
每在200 K MOHITO细胞six-well板培养24小时。Cy5-labeled antiCAFs-DMS或antiCAFs-DMS-AptT添加到细胞,在最后Cy5 2毫克/毫升,浓度为0.5小时,小时或4小时孵化。洗后用冷PBS两次,细胞resuspended 0.5毫升的PBS。Cy5强度的细胞是由一个流式细胞分析仪测量(Cytomics™FC 500年,贝克曼库尔特,迈阿密,佛罗里达州,美国)。gydF4y2Ba
共焦显微镜的研究和信息交互gydF4y2Ba
每口井的10 K的战乱国家被播种到eight-well室(Millicell®EZ幻灯片,默克密理博)一夜之间文化,然后由CellTracker彩色™红色CMTPX染料(美国表达载体)和赫斯特(美国表达载体)10分钟37°C。同时,每在一个50 K MOHITO细胞six-well板被CellTracker一夜之间文化培养,然后染色™绿色CMFDA染料(美国表达载体)和赫斯特(美国表达载体)10分钟37°C。清洗战乱国家和MOHITO细胞与相应的细胞培养基(4°C)消除了清白的解决方案。MOHITO共培养细胞被添加到战乱国家,他们对待antiCAFs-DMS或antiCAFs-DMS-AptT(控制在0.1μM AG17724)的浓度在4°C 2小时。然后,与多聚甲醛固定细胞的最终浓度为1% (w / v),和信息的图像复合物被共焦显微镜观察(TCS SP5 aob共焦显微镜系统,徕卡,德国)。gydF4y2Ba
皮下PDAC模型、biodistribution和抗肿瘤试验gydF4y2Ba
我们建立了皮下PDAC模型通过皮下接种(在正确的6周大的女性C57BL / 6小鼠)100 -μl混合细胞悬液含有1000 K Pan02细胞和500 K NIH-3T3细胞。2周后,肿瘤的体积增长约180毫米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
biodistribution成像,九皮下PDAC-bearing小鼠随机分为三组。Alexa750-labeled DMS, antiCAFs-DMS, antiCAFs-DMS-AptT Alexa750静脉注射200毫克/公斤。4小时后,小鼠安乐死和肿瘤和器官使用新光谱成像系统(卡尺生命科学、数据,美国)。然后,肿瘤和器官均质在PBS和放置在96孔板成像。gydF4y2Ba
抗肿瘤试验,40肿瘤小鼠随机分为4组(每组10)。治疗开始后第14天肿瘤接种。每隔3天进行治疗总共七轮。通过尾静脉注射药物。身体重量的老鼠和肿瘤卷记录每3天。小鼠安乐死一旦肿瘤数量达到1200毫米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba允许的最大肿瘤大小(这是我们的动物实验伦理委员会)。肿瘤体积测量和计算使用公式½×长×宽gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肿瘤细胞群分析gydF4y2Ba
肿瘤分离,收集肿瘤被分离成单个细胞悬液使用肿瘤分离工具,鼠标(Miltenyi研究,北欧国家)结合gentleMACS奥克托分离器与加热器(Miltenyi研究,北欧国家)根据制造商的指示。gydF4y2Ba
隔离,通过流式细胞仪计数战乱国家,单细胞悬浮体的肿瘤,200 K细胞样本,是悬浮在50μL PBS (pH值7.2),2毫米EDTA, 0.5% BSA (PEB)缓冲区。Cy3-labeled anti-α-SMA抗体加入细胞悬浮液和孵化在4°C下10分钟。两次,洗后通过本益比样本沾5μg /毫升propidium碘(Miltenyi研究)之前立即分析使用MACSQuant™分析仪(Miltenyi研究)。gydF4y2Ba
对CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞分析单细胞悬浮体的肿瘤,肿瘤单细胞悬浮体首先孵化了12.5μg /毫升老鼠免疫球蛋白(美国Sigma-Aldrich) PBS 15分钟在冰上阻止抗体的非特定的绑定。FITC-labeled鼠标anti-CD3抗体,PE-labeled鼠标anti-CD8抗体,亮紫510™anti-mouse CD45抗体在流缓冲区组成的PBS稀释10%的边后卫。细胞悬浊液然后抗体孵育混合在96 v形底板块(康宁,配角),在冰上,在黑暗中,为0.5小时。孵化后,100年μL流缓冲区被添加到每个好,和盘子离心机410×gydF4y2BaggydF4y2Ba6分钟4°C。上层清液被丢弃和细胞颗粒在150年resuspendedμL每口井的流缓冲区并再次离心。细胞生存能力评估1μg /毫升propidium碘前流仪分析。我们还检查孤立CD8的扩张活动gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞通过计数活和死T细胞(台盼蓝染色后)与自动细胞计数(伯爵夫人™3,表达载体)。样品被分析使用MACSQuant™分析仪(Miltenyi研究)。gydF4y2Ba
原位胰腺癌模型和抗肿瘤试验gydF4y2Ba
我们建立了原位小鼠胰腺癌模型通过手术植入500 K Pan02-Luc细胞的头6女C57BL / 6小鼠的胰腺。开始治疗,如上所述,14日15天post-implant。生物荧光成像与新光谱系统进行(卡尺生命科学,数据妈,美国)监测肿瘤的发展。在成像之前,gydF4y2BadgydF4y2Ba荧光素(美国PerkinElmer),溶解在DPBS intra-peritoneally注入老鼠(150毫克gydF4y2BadgydF4y2Ba荧光素/公斤体重)。小鼠安乐死一旦他们的体重下降到15克(这是人道的端点允许我们的动物实验伦理委员会)。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
所有的统计分析进行了GraphPad棱镜9。gydF4y2Ba
报告总结gydF4y2Ba
进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba
数据可用性gydF4y2Ba
作者声明,支持本研究的数据都包含在这篇文章,其补充信息文件。gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba本文提供的。gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
这项研究支持中国博士后科学基金会的奖学金(2021 m702340),中国国家自然科学基金(82070625,82070625),四川省科学技术厅(2020 yj0237 2021 yfs0230 2020 yfs0573 2021 zycd016 2022 nsfsc1441),主要研究和发展项目的四川省科学技术厅(2019 yfs0360),学科的135项目卓越,华西医院,四川大学(ZYJC18003 ZYJC18025, 2016105和ZYGD20006),四川省海外高层次人才引进计划(rcyj0046 21日)。我们感谢婷婷郭、杨应Mengling姚明,政法曹国伟和志强刘呼吸健康研究所,前沿科学中心疾病相关的分子网络,华西医院,四川大学,成都,中国为我们提供技术援助。gydF4y2Ba
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评论,Y.W., C.M., X.Z., T.W., Z.L., and Y.L., designed the study and performed the data analysis. M.L., K.L., S.L., W.W., L.D., X.Z., C.L., W.P., J.S., Yang L., D.Y., K.Z., Q.N., X.F., Y.Z., Y.N., performed the experiments. Z.Z., Yi L., Y.H., provided materials. J.L., Y.W., C.M., drafted the manuscript. All authors contributed to the discussion of results and revision of the manuscript.
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刘,J。,Wang, Y., Mu, C.et al。gydF4y2Ba通过选择性Pin1抑制胰腺肿瘤根除癌症相关的成纤维细胞和T淋巴细胞参与。gydF4y2BaNat CommungydF4y2Ba13gydF4y2Ba4308 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41467 - 022 - 31928 - 7gydF4y2Ba
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三阴性乳腺癌的靶向治疗和肿瘤微环境改造的人参皂苷Rg3脂质体gydF4y2Ba
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