mettl3介导的mRNA mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一种修饰通过调节转录因子Hnf4a控制出生后肝脏发育gydF4y2Ba

肝脏是负责新陈代谢、脂质运输、药物解毒和激素分泌的主要器官gydF4y2Ba^1克ydF4y2Ba．肝脏的规格和从造血到代谢的巨大功能转变是由细胞外信号、转录因子和表观遗传调控因子之间复杂的相互作用密切控制的。先前的报道表明，肝脏富集转录因子、组蛋白修饰和DNA甲基化的协调在成人发育过程中协调肝脏分化程序，并维持肝脏稳态gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

N6-methyladenosine (mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA)修饰自20世纪70年代发现以来，已被确定为真核mrna中最丰富的修饰gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba}．m的动态沉积和去除gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA由包含类甲基转移酶3 (METTL3)和类甲基转移酶14 (METTL14)的甲基转移酶复合物催化。gydF4y2Ba^{7 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}，和Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba，以及其他辅助因子和去甲基酶，包括ALKB同源物5 (ALKBH5)gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba,分别。米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaYTH家族成员在YT521-B同源结构域(YTHDF1-3, YTHDC1-2)中识别一个修饰。gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}胰岛素样生长因子-2 mrna结合蛋白(IGF2BP1/2/3)gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba，因此参与RNA代谢的各个步骤，如稳定性、翻译、核输出、mrna剪接以及miRNAs的生物发生和成熟gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在这项工作中，我们产生了肝特异性gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba击倒(gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO)小鼠杂交gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}老鼠gydF4y2Ba白蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba)增强器/启动子驱动-gydF4y2BaCregydF4y2Ba在转基因小鼠中研究mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba肝脏发育的改变围产期Mettl3肝脏缺失可引起严重的肝损伤，包括脂肪变性、细胞凋亡和纤维化，最终在7周内致死。使用米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RNA免疫沉淀(mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP)测序和rna测序，我们确定了关键的肝脏富集转录因子，包括gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba，均被m修正gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在肝脏发育中的作用。Mettl3的丢失导致m的耗尽gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个在gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba转录，以依赖igf2bp1的方式降低其转录稳定性，并下调gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba而过表达AAV8的Hnf4a可减轻肝损伤，延长肝细胞寿命gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO老鼠。然而，在成年小鼠肝脏中删除Mettl3gydF4y2Ba白蛋白gydF4y2Ba增强器/ promoter-drivengydF4y2BaCregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}对肝脏内稳态的影响很小。总之，我们阐明了mettl3介导的RNA m的动态作用gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba小鼠出生后肝脏发育过程中的一种修饰，并破译了外延转录组控制肝脏器官发生的新功能。gydF4y2Ba

肝脏特异性Mettl3基因敲除小鼠的产生gydF4y2Ba

研究m的作用gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba在肝脏发育中的修饰，我们首先测试了m的关键亚基的表达水平gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba甲基转移酶复合体，Mettl3和Mettl14gydF4y2Ba^{7 gydF4y2Ba}．这两种成分在小鼠新生儿(出生后一天内)中都表现出较浅的蛋白质水平，并逐渐增加，在2-3周达到峰值，然后从4周开始下降(补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在人类肝脏中也观察到类似的趋势，儿童肝脏高表达，随后随着年龄的增长而下降(补充图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．这些结果表明mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在出生后肝脏发育中受到动态调控。全球淘汰任一种gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba或gydF4y2BaMettl14gydF4y2Ba结果原肠形成缺陷引起胚胎死亡gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}．因此，研究mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一种修饰，我们生成小鼠肝脏特异性敲除m的催化亚基gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba甲基转移酶通过交叉形成的甲基转移酶复合物，Mettl3gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}小鼠(loxP位点位于外显子2和4两侧)gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba增强器/ promoter-drivengydF4y2BaCregydF4y2Ba转基因小鼠(补充图。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)．通过基因组PCR、实时定量PCR (RT-qPCR)、western blot和免疫化学等方法证实了Mettl3在肝脏中的特异性敲除(图。gydF4y2Ba1模拟gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1 e-jgydF4y2Ba)．基因组PCR和RT-qPCR显示，metttl3基因的高效敲除始于出生后第1天(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1 kgydF4y2Ba)，以及gydF4y2BaCregydF4y2Ba表达式(补充图gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)．果然，肝从gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠mRNA m明显下降gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA水平与对照组相比(补充图。gydF4y2Ba1 lgydF4y2Ba)．此外，我们还观察到敲除mettl13会导致Mettl14的破坏(补充图。gydF4y2Ba1米gydF4y2Ba)，与以往的报告一致gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

肝脏Mettl3基因敲除可导致产后死亡gydF4y2Ba

肝gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba敲除小鼠几乎以预期的孟德尔频率出生。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)，排除产前致死率的可能性。然而，雄性和雌性敲除小鼠的体型都小于它们的年龄和性别匹配的野生型(WT)对照(对照，以后也在类似的实验中)的窝伴(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)．这种差异出现在出生后2周，并在出生后4周和5周逐渐变得更加明显。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba1 n, ogydF4y2Ba)．此外，所有的gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠在出生后7周内死亡，而杂合子敲除个体可育并存活超过12个月，没有明显的发育缺陷(图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba的一个等位基因gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba足以维持小鼠肝脏的正常发育和功能。这些结果表明，Mettl3对出生后肝脏发育至关重要，特别是在出生后0 - 4周的高增殖阶段。gydF4y2Ba

肝Mettl3缺失导致肝损伤gydF4y2Ba

为了阐明Mettl3在肝脏器官发生中的确切作用，我们解剖了对照组和对照组的肝脏gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba出生后不同时间点的cKO小鼠。大体上，在肝脏中观察到明显的斑驳外观，这是脂质沉积的指示gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠出生后2周(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．4周婴儿的肝脏gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba与WT对照组相比，cKO小鼠呈黄色，体型更小，身体更僵硬。这些差异在第5周时变得更加显著。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．肝脏重量gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba小鼠出生3周后cKO下降(图;gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，而肝脏重量与体重比略有增加(补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．肝功能血清指标显示，出生后1-2周，Mettl3缺乏导致肝脏代谢、解毒、蛋白质合成和分泌功能缺陷，提示进行性肝损害(图)。gydF4y2Ba2 c-jgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Mettl3缺失导致细胞凋亡、脂肪变性、纤维化和肝祖细胞激活gydF4y2Ba

虽然组织学分析显示对照组和对照组之间无明显差异gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba出生后1天和1周的cKO小鼠(补充图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)，可见明显的病理病变gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠2周龄开始(图;gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．脂滴沉积增加gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba出生后2周观察cKO肝脏，冷冻肝组织BODIPY染色和Oil Red O染色证实(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)和原代肝细胞(补充图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)．我们还观察到细胞体积变大，细胞核变大，肝细胞凋亡增加gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠出生后2周开始，出生后3周导管细胞扩张(图。gydF4y2Ba3模拟gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3 f, ggydF4y2Ba)．此外，纤维化突出gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO肝脏在第4周出现，在第5周变得更加明显。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba)．通过组织学分析，我们没有观察到杂合子cKO肝脏的任何异常(补充图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．与导管细胞扩增一致，我们检测到Sox9, CK19, Ki67阳性细胞明显增加gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO肝(图;gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．同时，对不同时间点采集的肝组织进行RT-qPCR检测，肝细胞标记物(gydF4y2Ba白蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba)减少，而肝祖标记物(gydF4y2Ba法新社gydF4y2Ba，gydF4y2BaKrt7gydF4y2Ba，gydF4y2BaKrt19gydF4y2Ba，gydF4y2BaEpcamgydF4y2Ba,gydF4y2BaSox9gydF4y2Ba)和纤维化标志物(gydF4y2BaCol1a1gydF4y2Ba，gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba,gydF4y2BaPdgfrbgydF4y2Ba)在gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO个体(图;gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．western blot证实了这些变化。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．上述结果表明，围生期肝细胞Mettl3缺失导致肝细胞损伤、祖细胞激活和纤维化。gydF4y2Ba

Transcriptome-wide米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP测序鉴定Mettl3的潜在靶点gydF4y2Ba

由于Mettl3是m的关键催化亚基gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba甲基转移酶机制，为了全面了解metttl3调控出生后肝脏发育的分子机制，我们首先量化了mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaLC-MS/MS检测不同发育阶段肝组织mrna的A水平。全局mRNA mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba出生后肝脏的A水平在出生后升高，在2周达到峰值，随后下降(补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．接下来，我们分析了全基因组的mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba甲基化分布使用mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba小鼠肝组织5个发育时间点(出生后1天和1、2、4、8周)的rna A-RIP测序。m的分布gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA修饰在出生后肝脏发育的不同阶段受到动态调节(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba5模拟gydF4y2Ba)．我们确定了15139,12483,12615,10561和6806米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA峰值，分别对应上述五组中的6330、5522、5515、4856、3445个基因。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba及补充数据集gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．全球人口gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba出生后2周达到富集高峰，同时出现大量mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba小鼠肝脏发育过程中A的水平(补充图。gydF4y2Ba5 a, dgydF4y2Ba)．与之前的报告一致，mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA峰在终止密码子附近显著富集(图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba)，共识基序“GGAC”在所有样本的峰中最常见地富集(补充图。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．有趣的是，“肝脏发育”是m最显著丰富的术语之一gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba通过基因本体(GO)分析在所有时间点的修改基因(图。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba及补充数据集gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．几种关键的肝脏富集转录因子的mrna被mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba肝组织中的A，包括gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba，gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba，gydF4y2BaPparagydF4y2Ba,gydF4y2BaCebpagydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)．这些因子在肝脏体内发育和肝细胞体外分化中都起着重要作用gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．接下来，我们使用基因特异性mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP-qPCR检测证实了RNA m的真实沉积gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaMettl3对富肝因子的修饰，使用对照和gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO老鼠。我们观察到m的显著下降gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba关于gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba，gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba，gydF4y2BaPparagydF4y2Ba，gydF4y2BaCebpagydF4y2Ba等gydF4y2Ba．在gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba2周和4周的cKO小鼠(图;gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．这些结果表明，mettl3介导的mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一种修饰在肝脏发育过程中被动态调节，并修饰控制肝脏规格和功能的关键转录因子。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA通过控制核心转录因子mRNA的稳定性来调控肝脏发育和代谢通路gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba

为了进一步了解Mettl3调节肝脏发育的机制，我们对Control和c组的肝组织进行了rna测序gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠出生后1天，1周，2周，4周。对照组和对照组差异调控基因(DEGs)明显增多gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba稍后时间点的cKO小鼠(补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，补充数据集gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，这与我们的观察相一致gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠在出生后2周出现进行性严重肝损伤(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．基因集富集分析(GSEA)显示，该基因的靶点为gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba而且gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba在gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO肝甚至在出生后1天(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．双荧光素酶报告试验和诱变试验(图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba)显示与WT共转染，但未与催化突变体Mettl3共转染gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}，显著促进携带WT的报告细胞荧光素酶活性gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba而且gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba片段，而这样的增加被废除时，mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个共识基序发生突变，证实Mettl3对Hnf4a和Hnf1a的调控确实依赖于mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba转录本的甲基化。RT-qPCR和western blot均证实Hnf4a在小鼠中表达下调gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba出生后不同时间点的cKO肝脏(图;gydF4y2Ba6汉英gydF4y2Ba)．尽管RNA水平gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba在所有时间点均下调(补充图;gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)，我们观察到Hnf1a蛋白随着年龄的增长而急剧下降，仅在对照组和对照组之间观察到差异gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba出生后1周cKO小鼠肝脏(补充图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)，表明Hnf1a在肝细胞成熟过程中的作用不那么重要，这与以往的研究一致gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．Hnf4a是胎儿和成人肝脏发育所需的主转录因子，并控制成熟肝细胞功能的大部分方面gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}，我们主要针对Hnf4a进行进一步研究。rna -测序数据显示，随着Hnf4a的下调，大多数Hnf4a靶基因，如gydF4y2BaApoa2gydF4y2Ba，gydF4y2BaApoc3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCyp8b1gydF4y2Ba,gydF4y2BaMttpgydF4y2Ba，被压抑在gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO个体(补充图)gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba，补充数据集gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，经RT-qPCR验证(补充图;gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)．我们还注意到gydF4y2BaSmadgydF4y2Ba信号，纤维化的中心介质gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba中显著富集gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba4周时cKO小鼠肝组织(补充图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)，支持了大范围肝纤维化的现象gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO动物(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这些结果表明，mettl3介导的mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在肝脏发育过程中控制关键肝脏发育基因的表达。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba修饰涉及RNA代谢的各个方面，包括转录、剪接、核运输、稳定性和翻译。由于我们观察到Hnf4a在mRNA和蛋白水平上表达下降，我们确定了Hnf4a的替代剪接、核-细胞质转运和mRNA稳定性gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba信使rna。选择性剪接分析显示，两组间无差异gydF4y2BaHnf4agydF4y2Barna测序数据中的转录本gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO肝脏(补充数据集gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．的分布gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba细胞核和细胞质中的mRNA也不受影响gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba7罪犯gydF4y2Ba)．只有mRNA稳定性在原代肝细胞和Mettl3抑制的HepG2细胞中显示出显著变化(图。gydF4y2Ba6 f, ggydF4y2Ba、补充图。gydF4y2Ba7 e, fgydF4y2Ba)．Mettl3缺失的细胞半衰期较短gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba转录，表明mettl3介导的mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA通过调控其mRNA的稳定性来控制Hnf4a的表达。为了比较Mettl3基因敲除后mRNA稳定性的整体变化，我们对对照组和对照组的放线菌素d处理过的肝细胞进行了实验gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠rna测序(补充数据集gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．与以前的报告一致gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}敲除Mettl3基因可提高mRNA的整体稳定性，特别是mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Baa修饰基因(补充图。gydF4y2Ba7 g hgydF4y2Ba)．在涉及肝脏发育的基因中(由基因本体资源定义，GO:0001889)，只有gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba和另外10个基因在敲除Mettl3时显示mRNA半衰期缩短，而大多数基因(包括gydF4y2BaCited2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCebpagydF4y2Ba，gydF4y2BaNotch2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba菲律宾gydF4y2Ba，等)较为稳定或不变(补充图;gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba及补充数据集gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这些结果表明，Mettl3缺失通过缩短Hnf4a的半衰期来下调Hnf4a的表达gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba信使rna。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba修饰主要通过“读取器”蛋白质识别并与m结合来控制RNA的命运gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba包含记录。在已识别的m中gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba众所周知，胰岛素样生长因子2 mrna结合蛋白(IGF2BPs，包括IGF2BP1/2/3)是一种“读者”，可促进其靶mrna的稳定性gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．为了进一步描述m的作用机理gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba作为Hnf4a的控制性表达，我们检查了以前的出版物，发现IGF2BP1的缺失会导致其不稳定gydF4y2BaHNF4AgydF4y2BamRNA在HepG2细胞中，而干扰其他两个成员没有影响gydF4y2BaHNF4AgydF4y2BamRNA降解(补充图。gydF4y2Ba7 jgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba，说明IGF2BP1可能直接识别mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个在gydF4y2BaHNF4AgydF4y2Ba并维持其在肝脏中的水平。因此，我们测试了Igf2bp1与gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba信使rna与RIP实验。结果表明，Igf2bp1能有效地与gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba2周和4周小鼠肝脏的转录本，富集后显著降低gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba击倒(无花果。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba)．因此，在HepG2细胞中，用小发夹RNA (small Hairpin RNA, shRNA)敲除IGF2BP1也减少了gydF4y2BaHNF4AgydF4y2BamRNA半衰期，类似于Mettl3中断(图。gydF4y2Ba6我gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba7 k, lgydF4y2Ba)．这些数据证明了mettl3介导的mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA通过igf2bp1依赖的方式调节Hnf4a的mRNA稳定性来控制Hnf4a的表达。gydF4y2Ba

肝脏Hnf4a过表达减轻Mettl3基因敲除引起的肝损伤gydF4y2Ba

为了进一步强化我们的结论，即Hnf4a是肝脏发育中Mettl3功能的主要中介，我们使用AAV血清型8 (AAV8)进行抢救实验，在肝脏特异性启动子(甲状腺结合球蛋白，TBG) (AAV8-TBG-Hnf4a)的控制下表达Hnf4agydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠(图;gydF4y2Ba6 jgydF4y2Ba)．出生后第2天经颞浅静脉注射AAV8-TBG-Hnf4a成功在肝脏中过表达(补充图。gydF4y2Ba7米gydF4y2Ba)，减轻肝损伤gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba与AAV8-Ctrl相比，两周的基因敲除，Ki67的数量增加就是明证gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba肝细胞增殖和肝脏脂肪变性减少(图;gydF4y2Ba6为gydF4y2Ba)．然而，我们没有看到在死亡率方面的长期益处。这可能与出生后4周内肝细胞剧烈分裂导致AAV迅速稀释有关gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．在大鼠4周龄尾静脉注射AAV-TBG-Hnf4a过表达Hnf4agydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba并发现Hnf4a过表达显著延长了cKO小鼠的寿命gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠(图;gydF4y2Ba6 ngydF4y2Ba)．这些结果进一步证明Hnf4a是介导Mettl3在肝脏发育中的作用的主要因素。gydF4y2Ba

metttl3对于成人肝脏的稳态是不可缺少的gydF4y2Ba

考虑到致命的gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠在7周内产生条件诱导物gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba基因敲除小鼠(gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba通过交叉gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}老鼠gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}老鼠。经腹腔注射他莫昔芬后，成年小鼠Mettl3基因可被清除gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．基因组PCR, RT-qPCR和western blot证实了有效和特异性的消耗gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba他莫昔芬给药后1周(图;gydF4y2Ba7 a egydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．LC-MS/MS结果也显示了体积m的显著下降gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba的修改gydF4y2BaMettl3gydF4y2BaicKO小鼠肝脏mrna(图;gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)．然而，我们没有观察到任何明显的异常gydF4y2BaMettl3gydF4y2BaicKO小鼠(图;gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba8 b, cgydF4y2Ba)．血清学和组织学检查显示肝脏损伤很小。gydF4y2Ba7小时,我gydF4y2Ba、补充图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．两种mrnagydF4y2BaHnf4agydF4y2BaHnf4a下游靶点在对照组和对照组之间无差异gydF4y2BaMettl3gydF4y2BaicKO肝脏(补充图。gydF4y2Ba8 e-kgydF4y2Ba)．这些结果表明，尽管Mettl3对出生后肝脏的早期发育至关重要，但它对成人肝脏的稳态并不是至关重要的。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

先前的报道已经描述了转录组范围内的mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在出生后三个阶段的猪肝中gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba并提供了m的路线图gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba人类和老鼠肝脏的改造gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba，表示m的动态变化gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba肝脏发育过程中的变化本研究证实了mettl3介导的m的重要作用gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba小鼠出生后肝脏发育的改变。使用gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}/ Alb-CregydF4y2Ba老鼠，我们发现gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠出生后2周左右脂肪变性，4-5周肝纤维化，7周前因严重肝损伤死亡。gydF4y2Ba

肝脏经历了从子宫内到子宫外环境的功能突变，对应于从造血到代谢和免疫的功能转移gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．一般来说，胎儿肝脏造血具有起始(E11.5)、高峰(E14.5)、衰退(E15.5)、消失(出生后3天)的特征，而新生儿肝脏则迅速演变为免疫监测和代谢的重要器官。组织学分析显示，出生后第一周，造血细胞迅速消失，实质细胞占据肝组织，与既往报道一致gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．mett13在新生小鼠肝脏中表达量不高，而在两个胎儿肝脏中表达量较高gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba出生后1周蛋白质水平(尽管在这个过程中mRNA水平只有轻微变化)。Mettl3在围产期如何受到严格调控的机制仍然难以捉摸，值得研究。考虑到肝脏在围产期的功能转变，Mettl3在这一时期的动态调节和功能可能涉及造血和肝脏两个方面。一系列研究探讨了mettl3介导的m的作用gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在造血系统gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}，包括胚胎肝脏的早期造血干细胞(HSC)发育gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba，揭示了m的重要作用gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在造血系统的规范和稳态方面。但是，Mettl3和m的函数gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA在产前发育中的肝谱系规范目前尚不清楚，值得进一步研究。gydF4y2Ba

有趣的是，4周后肝脏中mettl13和Mettl14的表达同步下降，提高了m不那么关键的作用的可能性gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba成年期和老年期的变化事实上，我们发现Mettl3对成人肝脏内稳态并不是必需的。先前的研究也表明，在分化或祖细胞的早期阶段，如神经发生，甲基转移酶复合物的表达水平较高gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}和造血作用gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba．全局m的水平gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一种修饰和甲基转移酶的表达在过早间充质干细胞中减少gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba，复制性衰老细胞gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba以及来自老年人群的外周血单个核细胞gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba．衰老总是伴随着再生能力的逐渐下降，尤其是在肝脏中gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba，因此，描述与年龄相关的再生能力下降是否由m的降低引起将是有趣的gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba老年人的动力。虽然过表达RNA甲基转移酶减弱衰老表型gydF4y2Ba^{41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}甲基转移酶表达升高与肝脏代谢紊乱加重有关gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba以及癌变过程gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba包括肝细胞癌gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba，表示m的微调调节gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba机械是生理内稳态所必需的。gydF4y2Ba

肝脏是成人最大的消化和代谢器官，负责将蛋白质、糖原、胆固醇、脂肪酸等多种复杂分子转化为基本分子。肝脏的正常发育和功能是由一系列丰富的肝脏转录因子及其之间的综合调控网络来维持的gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}．在这里，我们发现大量肝脏富集的转录因子转录本被mettl3介导的m修饰gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba修改，包括gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba，gydF4y2BaHnf1βgydF4y2Ba，gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba，gydF4y2BaPparagydF4y2Ba，gydF4y2BaCebpagydF4y2Ba，gydF4y2BaOnecut1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOnecut2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCited2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba似乎是metttl3在出生后肝脏发育中最关键的下游中介。此外，我们观察到Hnf4a在不同时间点的mRNA和蛋白水平均有所下降gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠肝脏与对照组肝脏相比，其下游靶标明显失调。gydF4y2Ba

Hnf4a是胚胎和成人小鼠肝脏所需的主转录因子gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．它直接与成人肝脏中几乎一半的活性转录基因结合，并作为肝脏转录层次中的高级转录因子gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}．我们发现的大部分异常gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠(包括肝脏中脂质沉积、血清中胆汁酸增加、肝损伤和青壮年的致死率)出现了肝脏的表型gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba基因敲除小鼠gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．然而,gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠肝脏损伤较肝损伤严重gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba基因敲除小鼠。这可能是由于mettl3介导的m调控了多个靶点gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba其中的修饰、自动调节和交叉调节回路可能会进一步加速肝脏发育和功能的崩溃gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba}．其中，越来越多的证据表明，mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA和组蛋白/DNA表观遗传修饰gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba这为解释Mettl3在肝脏发育和功能中的作用增加了另一层复杂性。最近的研究表明mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA直接调节异染色质组织gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba}．异染色质的协调重塑对肝脏发育至关重要gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba异染色质景观的干扰有助于肝功能受损和肿瘤的发生gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．因此，观察异常的染色质状态是否能解释这一问题将是很有趣的gydF4y2BaMettl3gydF4y2Backo致肝损伤。此外，Mettl3敲除还可能通过控制RNA代谢的其他方面，如mRNA的转运、翻译和其他调控因子的剪接，从而导致肝脏发育缺陷，这些调控因子涉及肝脏发育和对肝脏发生至关重要的miRNAs的生物发生。gydF4y2Ba

综上所述，我们的研究证明了mettl3介导的m在外延转录组学中具有新的调节功能gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba对肝脏出生后发育和稳态的修正，扩展了我们对哺乳动物肝脏发育和功能调节网络的理解。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

本研究动物的使用依据国立卫生研究院《实验动物护理使用指南》，并经中山大学附属第三医院机构动物护理使用委员会批准。对于本研究中使用的人体标本，获得了所有个体的知情同意，并记录在电子数据库中。研究委员会的规程是根据中山大学附属第三医院医学伦理委员会制定的准则进行的。gydF4y2Ba

动物实验gydF4y2Ba

Mettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}老鼠是周琦教授好心送的gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba．gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCregydF4y2Ba小鼠购自GemPharmatech有限公司(南京，中国)。gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}小鼠购自北京生物增素有限公司(北京，中国)。所有小鼠均为C57BL/ 6j背景，置于特定的无病原体环境中，光照/黑暗周期为12 h，温度为24±2°C，湿度为30 - 70%，可自由获取食物和水。gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}/ Alb-CregydF4y2Ba老鼠(gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠)通过杂交生成gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}小鼠杂合子gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCregydF4y2Ba老鼠。gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}/ Alb-CregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}小鼠是通过杂交产生的gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}老鼠gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}老鼠。用于肝脏特异性诱导敲除gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba（gydF4y2BaMettl3gydF4y2BaicKO)在成人，4-5周gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba^{液氧/液氧gydF4y2Ba}/ Alb-CregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}小鼠腹腔注射1 mg/只的他莫西芬(Sigma-Aldrich, T5648)，连续5天，对照组小鼠腹腔注射相同体积的橄榄油(MACKLIN, O815211)。将他莫昔芬溶解在浓度为10 mg/mL的橄榄油中，在37°C摇动过夜。控制和gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO或gydF4y2BaMettl3gydF4y2BaicKO小鼠是窝友和笼友。所有的gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba或gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{ERT2gydF4y2Ba}本实验小鼠为Cre杂合子。gydF4y2Ba

用于小鼠基因分型的基因组PCRgydF4y2Ba

小鼠用尾巴和组织DNA进行基因分型。使用小鼠直接PCR试剂盒(ApexBio Technology, k1025)制备尾部和组织裂解物。使用两对引物来鉴定floxed等位基因:gydF4y2BaMettl3gydF4y2Baf1和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Bar1,或gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba- f2和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-R2(见补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．gydF4y2BaMettl3gydF4y2Baf1和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-R1引物(见补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)用小鼠尾巴区分WT (182 bp)和floxed等位基因(222 bp)。gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba- f2和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-R2引物(见补充图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)，用小鼠尾巴区分WT (295 bp)和floxed等位基因(335 bp)。gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCregydF4y2Ba- f和gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCregydF4y2Ba-R引物用于检测gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba等位基因与小鼠尾巴(340 bp为gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{+ /−gydF4y2Ba}也没有gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba})．gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCreERTgydF4y2Ba- f和gydF4y2Ba铝青铜gydF4y2Ba-gydF4y2BaCreERTgydF4y2Ba-R引物用于检测gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^导gydF4y2Ba小鼠尾巴等位基因(788 bp forgydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{ERT2 + /−gydF4y2Ba}也没有gydF4y2BaAlb-CregydF4y2Ba^{/ ERT2−−gydF4y2Ba})．对于floxdel在不同组织中的检测，gydF4y2BaMettl3gydF4y2Baf1和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-R2引物。floxdel只有在成功缺失的组织中才能观察到318 bp的条带gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba，在约2500bp处伴随较薄的WT带。源数据文件中提供了未裁剪的凝胶。引物序列详见补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

AAV病毒的制备和体内转导gydF4y2Ba

本研究采用血清型8 AAV (AAV8)。在TBG启动子的控制下，将Hnf4a编码测序克隆到AAV8载体上，实现Hnf4a蛋白的肝脏特异性过表达。病毒由Packgene生物技术有限公司(中国广州)包装，最终滴度大于2.0 × 10gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba病毒基因组/毫升。对于AAV在体内的转导，我们采用了两种策略进行抢救实验。在第一种策略中，每个gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠接收1.0 × 10gydF4y2Ba^11gydF4y2BaAAV8-Ctrl或AAV8-Hnf4a的病毒基因组在出生后第2天通过颞浅静脉传播。2周龄时处死小鼠作进一步分析。另一种策略是1.0 × 10gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba注射AAV8-Ctrl或AAV8-Hnf4a病毒基因组/小鼠gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠在4周龄时通过尾静脉进行进一步的存活率分析。gydF4y2Ba

血清分析gydF4y2Ba

使用日立7020全自动生化分析仪(日立，东京，日本)检测血清肝功能指标(碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白、胆固醇、甘油三酯、总胆汁酸、总胆红素和直接胆红素)水平。gydF4y2Ba

人体标本gydF4y2Ba

人肝组织取自中山大学第三附属医院肝移植手术中心脏死亡(DCD)后的捐赠。该研究已获得中山大学附属第三医院医学伦理委员会的批准。该研究的设计和实施遵守了所有关于使用人体研究参与者的相关规定，并遵循赫尔辛基宣言制定的标准进行。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

HEK293T和HepG2细胞来自American Type Culture Collection (ATCC)，培养于dmem -高糖培养基(Thermo Scientific, C11995500BT)中，添加10%胎牛血清(FBS) (PAN, P30-3302)。细胞在37°C的5% CO的潮湿气氛中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

原发性肝细胞分离gydF4y2Ba

原代肝细胞采用传统的两步胶原酶灌注法分离gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．简言之，EGTA缓冲液(8000 mg/L NaCl, 400 mg/L KCl, 76.67 mg/L NaH)经门静脉插管灌注小鼠gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 120.45 mg/L NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHEPES 2380 mg/L, NaHCO 350 mg/LgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， EGTA 190 mg/L，葡萄糖900 mg/L, PH = 7.35-7.4)，以8 mL/min浸泡2 min，然后加入酶缓冲液(8000 mg/L NaCl, 400 mg/L KCl, 76.67 mg/L NaH)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 120.45 mg/L NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHEPES 2380 mg/L, NaHCO 350 mg/LgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 481.8 mg/L氯化钙gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， PH = 7.35-7.4)含有100 U/mL的胶原酶IV (Sigma-Aldrich, C5138)，以8 mL/min的速度浸泡8分钟。细胞悬液通过70 μm细胞过滤器(Sorfa, 251200)过滤。清洗三次后，在4°C下以50 g离心1分钟收集细胞颗粒。然后将细胞重悬于添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(KeyGEN Biotech, KGY0023)的Williams’Medium E (GIBCO, 12551032)中，并在I型胶原蛋白(Invitrogen, A048301)预包被培养板中，在37℃、5% CO中培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。培养2小时后更换培养基。6小时后将细胞换为无血清培养基，培养过夜后使用。gydF4y2Ba

质粒构建与病毒转导gydF4y2Ba

靶向人shRNAgydF4y2BaMETTL3gydF4y2Ba(上海gydF4y2BaMETTL3gydF4y2Ba),人类gydF4y2BaIGF2BP1gydF4y2Ba(上海gydF4y2BaIGF2BP1gydF4y2Ba)和荧光素酶(shgydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba)克隆到pLKO中。1lent我viral vector (Addgene, 10878). All constructs were confirmed by Sanger sequencing. Lentivirus transfections were conducted using polyethylenimine (PEI, Polysciences, 23966) according to the manufacturer’s protocol. Briefly, HEK293T cell was seeded into 6 cm dish, and transfection experiments were performed at 80% confluence. For each well, 335 μl of pre-warmed Opti-MEM (Invitrogen) was mixed with 8 μg of plasmids (target plasmid: psPAX2: pMD2.G = 4:2:1), 36 μl of PEI (1 μg/ml), then incubated for 14 min at room temperature and added to the dish. The culture medium was changed 10 hours later. 48 h after transfection, the supernatants were collected and filtered through a 0.45 μm filter. HepG2 cells were infected with lentivirus-containing supernatants generated in HEK293T supplemented with 1 μg/ml polybrene (Sigma, H9268) for 8 h. Cells were then selected with 1.5 μg/ml puromycin (Thermo Scientific, A1113803) for two consecutive days. TRC lentiviral vectors encoding shRNAs against humanMETTL3gydF4y2Ba和人类gydF4y2BaIGF2BP1gydF4y2Ba在补充表中gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

组织样品用含有蛋白酶抑制剂(Roche, 04693132001)和磷酸酶抑制剂(Roche, 04906837001)的RIPA缓冲液(50 mM Tris-HCl (PH 7.4)， 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1%脱氧胆酸钠，2 mM EDTA (PH 8.0))裂解。对于细胞，样本被计数，用冰冷的PBS冲洗两次，并与组织一样裂解。然后用SDS-PAGE凝胶分离裂解物并转移到硝化纤维膜上。用含5% (v/w)脱脂牛奶和0.1% Tween-20 (Sigma-Aldrich, P1379)的TBS阻断细胞膜，并依次与一抗和二抗孵育。根据制造商的说明，使用Immobilon ECL Ultra Western HRP底物(Millipore, WBULS500)检测蛋白带。以Gapdh或β-actin作为加载对照。源数据文件中提供了未裁剪的污点。用于western blot的抗体见补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

RNA提取和RT-qPCRgydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用TRIzol (Ambion)从组织或细胞中提取总rna，并用紫外分光光度法定量。使用PrimeScript™RT Reagent Kit和gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, RR047B)进行反转录。然后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Q711-03)在Light Cycler 480 II (Roche)上进行RT-qPCR，重复三次。gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba作为内部控制。RT-qPCR所用引物见补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

H&E，马松三色，免疫组化染色gydF4y2Ba

肝脏标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。样品切片成8 μm厚，进行苏木精-伊红(H&E)染色或马松三色染色。免疫组化切片脱蜡，再水化，然后在EDTA抗原回收缓冲液(ZSGB-BIO, ZLI-9072)中在100℃下孵育5分钟。切片用3% H孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用含0.02% Triton的PBS冲洗三次gydF4y2Ba^TMgydF4y2BaX-100 (Sigma-Aldrich, T8787)，然后与一抗在4°C孵育过夜。以辣根过氧化物酶偶联抗体为二抗，37℃孵育1 h。这种颜色是由Dako Real孵育而成的gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba工具包(Dako, K5007)。切片用苏木精(Baso, BA4041)反染色，在尼康显微镜下检查。免疫组化染色所用的一抗见补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．采用ImageJ软件(1.8.0版)对Masson’s三色染色阳性区和αSMA免疫组化染色阳性区进行定量，每只小鼠5-8个随机野(10*)。gydF4y2Ba

TUNEL分析gydF4y2Ba

将肝组织固定，用OCT复合物(Servicebio, G6059)包埋，切片成8 μm厚，用含0.25% Triton的PBS渗透gydF4y2Ba^TMgydF4y2BaX-100 (Sigma-Aldrich, T8787)，并按照制造商的说明使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche, 11684795910)进行染色。Hoechst 33342 (Beyotime, C1022)用于核反染色。切片在共聚焦显微镜(ZEISS, LSM 880)下观察，图像用ZEN 2012软件分析。TUNEL的量化gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞/赫斯特33342gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba用ImageJ软件(version 1.8.0)进行细胞比和平均核直径检测。gydF4y2Ba

PI染色gydF4y2Ba

原代肝细胞进行PI染色。除去培养基，用预热的PBS洗涤细胞两次。然后用碘化丙啶溶液(BD, 556547)在37℃下染色15分钟。Hoechst 33342 (Beyotime, C1022)用于核反染色。在显微镜(Zeiss, Axio Observer Z1)下检测细胞，图像用ZEN 2012软件分析。gydF4y2Ba

油红O染色gydF4y2Ba

将肝组织固定，OCT复合物包埋，切片成8 μm厚。油红O (Sigma-Aldrich, O0625)粉末溶于0.7 g/100 mL浓度的异丙醇中，按3:2的体积比加水稀释，得到油红O溶液。预温组织切片用PBS洗涤2次，油红O溶液染色20 min，再用60%异丙醇洗涤10 s 3次，然后用苏木精(Baso, BA4041)反染，显微镜下观察(尼康)。采用ImageJ软件(1.8.0版)，每只小鼠5-8个随机场(10*)定量油红O染色阳性区域。gydF4y2Ba

BODIPY染色gydF4y2Ba

对冷冻肝切片和原代肝细胞进行BODIPY染色。冷冻肝组织切片固定，OCT化合物包埋，切片厚度为8 μm, 7.6 μm BODIPY (Invitrogen, D3922)染色30 min。Hoechst 33342 (Beyotime, C1022)用于核反染色。切片在共聚焦显微镜(ZEISS, LSM 880)下安装和扫描，图像用ZEN 2012软件分析。对于原代肝细胞，除去培养基，用预热的PBS洗涤细胞两次。然后将细胞与肝组织一样染色，并在显微镜下检查(Zeiss, Axio Observer Z1)。gydF4y2Ba

mRNA稳定性测定gydF4y2Ba

对原代肝细胞和HepG2细胞系进行mRNA稳定性检测。原代肝细胞分别从对照组和肝细胞中分离gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO老鼠。细胞培养过夜后用5 μM放线菌素D (Sigma-Aldrich, A1410)处理0 h、1 h、2 h、4 h和6 h。HepG2细胞培养后，用5 μM放线菌素D处理0 h、40 min、2 h、4 h。RT-qPCR分析中，分离总rna进行逆转录，通过RT-qPCR检测目标基因的mRNA水平。对于RNA稳定性RNA测序，发送总RNA进行RNA测序。gydF4y2Ba

rna测序和mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个破坏性的测序gydF4y2Ba

rna测序和mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba肝组织A-RIP测序由广州依必达生物科技有限公司进行。简而言之，对于肝组织RNA测序，总RNA从对照组和对照组中分离gydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO小鼠肝脏在出生后第1天、第1周、第2周、第4周和第8周(每个时间点2只)。序列reads与HISAT2.1.0小鼠基因组版本mm10进行比对gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba，用DESeq2计算差异表达基因(DEGs)gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba符合以下标准:|log2FC | > 1且P值< 0.05。基因集富集分析(GSEA)采用GSEA软件(gydF4y2Bahttps://www.broadinstitute.org/gsea/gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba．小鼠原代肝细胞RNA稳定性RNA测序，总RNA从对照组和对照组中分离gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba5 μM放线菌素D处理cKO原代肝细胞0 h、2 h、6 h, BerryGenomics Company (gydF4y2Bahttp://www.berrygenomics.com/gydF4y2Ba中国北京)。利用STAR v2.5.3a将Reads定位到小鼠mm10基因组gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba，保留q评分不小于250的唯一映射reads。基因计数由featurests v2.0.1执行，外显子特征记录在Gencode鼠标注释gtf文件中gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．利用edgeR包检测WT与KO在不同时间点的差异表达基因gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．为米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP测序，在WT小鼠出生后第1天、第1周、第2周、第4周和第8周(每个时间点2只)使用TRIZOL试剂从肝脏中分离总RNA，并进行碎片化。米gydF4y2Ba^6克ydF4y2Baa修饰的RNA经mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba去除抗体和rRNA。用smart-seq方法制备文库并进行测序。序列reads与HISAT2.1.0小鼠基因组版本mm10进行比对。微分米gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba使用exomePeak识别RIP和输入样本之间的a修正峰gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba．如果一个基因有一个以上的亚型，则最长的亚型被保留。Motif搜索采用HOMER进行gydF4y2Ba^67gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

LC-MS/MS为mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba检测和量化gydF4y2Ba

体mRNA mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba采用LC-MS/MS法进行改性定量。简单地说，将1 μg纯化后的mRNA在37℃下用S1核酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶充分消化成核苷，然后用氯仿提取得到制备好的溶液样品。样品采用UPLC- esi -MS/MS系统(UPLC, ExionLCgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba广告,gydF4y2Bahttps://sciex.com.cn/gydF4y2Ba；MS，应用生物系统6500三重四极杆，gydF4y2Bahttps://sciex.com.cn/gydF4y2Ba)．流出液交替连接到esi -三重四极线性离子阱(QTRAP)-MS。线性离子阱(LIT)和三重四极子(QQQ)扫描是在配有ESI Turbo离子喷雾接口的三重四极子线性离子阱质谱仪(QTRAP)上进行的，然后在正离子模式下操作，由analysis1.6.3软件(Sciex)控制。利用计划多反应监测(MRM)分析RNA修饰。数据采集使用analysis1.6.3软件(Sciex)。RNA修饰含量用MetWare (gydF4y2Bahttp://www.metware.cn/gydF4y2Ba)基于AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS平台。gydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP-qPCRgydF4y2Ba

米gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP-qRCR根据以前的报告进行gydF4y2Ba^{68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba}．简单地说，从2周或4周大的对照组和对照组中提取总rnagydF4y2BaMettl3gydF4y2BacKO老鼠。使用mRNA纯化试剂盒(Sigma-Aldrich, GenElute)分离Poly(A) mRNAgydF4y2Ba^TMgydF4y2BamRNA Miniprep Kit MRN10)。在每个实验中进行两轮纯化过程，根据制造商的说明充分去除rRNA污染。5 μg mrna在破碎缓冲液(10mm ZnCl)中94°C孵育30 s，破碎成200-300 nt片段gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10 mM Tris-HCl (PH 7.0))，然后用50 mM EDTA停止，并用乙醇沉淀纯化。mrna片段和2 μg anti-mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba在600 μL RIP缓冲液(150 mM NaCl, 0.1% Igepal CA-630, 10 mM Tris-HCl (PH 7.4))中加入抗体(Synaptic Systems, 202003)或小鼠IgG (Beyotime, A7028)，在4℃下孵育2 h。然后加入15 μL Dynabeads®Protein A珠(Thermo, 100-02D)和15 μL Dynabeads®Protein G珠(Thermo, 100-04D)，在4℃下再孵育2 h。用RIP缓冲液清洗珠子5次。RNase抑制剂(Promega, N2611)全程添加。碎片化mrna用100 μL 0.3 μg/μL蛋白酶K (Thermo Scientific, AM2546)在55℃下洗脱1 h，苯酚-氯仿萃取乙醇沉淀纯化。将析出的mrna逆转录，采用RT-qPCR方法进行富集。RT-qPCR引物gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个阳性区域被标记为“阳性-m”gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RT”(例如，两个单独m的引物gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个积极的区域gydF4y2BaPparagydF4y2Ba被列为gydF4y2BaPparagydF4y2BamgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-1-RT和gydF4y2BaPparagydF4y2BamgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-2-RT)， m引物gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个负区域被标记为“负m”gydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RT”(例如，m的引物gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个负区域gydF4y2BaPparagydF4y2Ba被列为gydF4y2BaPparagydF4y2Ba- mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba在rt)。底漆用于mgydF4y2Ba^6克ydF4y2BaA-RIP-qPCR列于补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

RNA免疫沉淀(RIP)-qPCRgydF4y2Ba

RIP是根据之前发布的协议进行修改的gydF4y2Ba^{69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba}．简单地说，用600 μL匀浆缓冲液(100 mM KCl, 5 mM MgCl)匀浆200 mg肝组织gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10 mM HEPES, pH 7.0, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 100 U/mL RNase抑制剂(Promega, N2611)，然后在冰上孵育5分钟，然后离心得到上清。将2 μg Igf2bp1抗体加入15 μL Dynabeads®Protein A珠(Thermo, 100-02D)和15 μL Dynabeads®Protein G珠(Thermo, 100-04D)中，然后在4℃旋转2 h。抗体珠浆与均质上清液孵育，4°C旋转2 h。用洗涤缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 150 mM NaCl, 1 mM MgCl洗涤5次gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 0.05% NP40)，用Trizol提取RNA，进行进一步RT-qPCR分析。gydF4y2Ba

双荧光素酶报告分析gydF4y2Ba

利用Phanta Max DNA聚合酶(Vazyme, P505) PCR扩增小鼠Mettl3基因全长编码序列，构建Mettl3过表达载体gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-PKD-F和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-PKD-R引物，然后使用clone express II One Step Cloning kit (Vazyme, C112)克隆到慢病毒载体PKD-EF1中。Mettl3- d395a - w398a催化突变体(DPPW/APPA)载体以Mettl3过表达载体为模板，采用pcr法构建gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba-AWWA-F和gydF4y2BaMettl3gydF4y2Ba- awa - r作为引物)。表达EGFP的PKD-EF1载体作为转染对照。DNA片段gydF4y2BaHnf1agydF4y2Ba而且gydF4y2BaHnf4agydF4y2Ba包含WT mgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba一个基序和突变基序(补充图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)由上海杰日生物科技有限公司合成，并在Mlu I和Sac I位点之间亚克隆到pmmir - report萤火虫荧光素酶报告载体(Ambion, AM5795)。所有序列均经Sanger测序证实。将50 ng Mettl3载体(Mettl3过表达载体或对照)、40 ng含有WT或突变片段的萤火虫荧光素酶报告载体和10 ng pRL Renilla荧光素酶对照报告载体(Promega, E2231)在96孔板中共转染HEK293T细胞，共转染三次。24小时后，根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告测定系统(Promega, E1910)测定Fluc和Rluc活性。相对荧光素酶活性通过将Fluc活性除以单个Rluc活性来计算，然后归一化为每个试验的对照。PCR引物序列见补充表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba