突变体gydF4y2Barig - igydF4y2Ba通过激活circrg - i信号来增强癌症相关炎症gydF4y2Ba

与病原体特异性免疫反应不同，非特异性炎症病变有助于正常细胞的恶性转化gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．尽管炎症诱导的肿瘤发生机制尚未完全阐明，但长期炎症已被证实对DNA突变和染色质不稳定起刺激作用gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．炎症状态除了引发肿瘤外，还促进癌细胞侵袭和远端转移，甚至增加癌细胞对免疫治疗的耐药性gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．新兴的临床研究表明，慢性炎症使人容易患各种类型的癌症，包括结肠癌、前列腺癌和肝癌gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}．因此，阐明癌症相关炎症的调控机制对于癌症的预防和治疗至关重要。gydF4y2Ba

RIG-I作为一种模式识别受体(PRR)，通过其DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)框域特异性识别胞质短双链病毒RNA (dsRNA)。随后，RIG-I发生构象变化，激活I型干扰素(IFN)信号级联，最终促进宿主抗病毒免疫应答gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．除了RIG-I在宿主防御病毒中的关键作用外，RIG-I还与癌症发展和肠道炎症有关gydF4y2Ba^{6克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba7 gydF4y2Ba}．既往研究发现RIG-I在人肝细胞癌(HCC)中表达下调。gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．RIG-I缺乏通过损害STAT1激活，预测HCC患者预后不良和免疫治疗耐药性gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．可以想象，RIG-I的缺失参与了癌症免疫逃逸。然而,gydF4y2Barig - i -gydF4y2Ba缺陷小鼠在小鼠实验性结肠炎中表现出更严重的肠道炎症，同时激活全身免疫反应gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．尽管RIG-I和Gαi2 (G蛋白的一个亚基，参与一系列生化活动)之间存在潜在的联系，但RIG-I缺失引发持续性非特异性炎症反应的潜在机制仍未明确。gydF4y2Ba

与RIG-I类似，DEAD-box RNA解旋酶3,X-linked (DDX3X)也是DEAD-box蛋白的成员之一。DDX3X已被报道参与多种信号通路，包括I型IFN信号通路、Wnt/β-catenin信号通路和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)信号通路gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba．例如，DDX3X可以作为一个适配器，通过与MAVS、IKKε和TBK1相互作用，促进RLR信号通路，从而产生I型IFN，增强宿主抗病毒免疫gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．此外，DDX3X通过抑制E-cadherin表达促进EMT程序，增强β-catenin向核的转运，触发Wnt/β-catenin/TCF信号通路，导致结肠癌转移gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．因此，DDX3X似乎是治疗癌症的潜在靶点。然而，DDX3X活性的调节机制仍然难以捉摸。gydF4y2Ba

环状rna (circRNAs)来源于前体mRNA (pre-mRNA)的后剪接，这与线性mRNA的典型剪接不同gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．环状rna和它们的线性mRNA之间存在竞争，这表明环状rna的存在负向调节了它们的亲本基因转录gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．生理上，由于环状RNA的生物发生效率低，其表达水平低，可由顺式作用RNA序列和RNA结合蛋白共同调控gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．例如，DEAH盒蛋白9 (DHX9)作为核rna结合蛋白，特异性地结合pre-mRNA中的倒转重复Alu元件，其缺陷导致环状rna数量的增加gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．circRNA的异位表达除了调控转录外，还能被PRRs识别并引发宿主免疫反应gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba但他们在这种情况下如何行动仍有待确定。gydF4y2Ba

在本研究中，我们鉴定了移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba发生在结肠癌患者身上。利用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠模型，我们发现移码突变的gydF4y2Barig - igydF4y2Ba增加小鼠对结肠炎和结肠炎相关结肠癌的易感性。机理研究表明，移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba的二级结构gydF4y2Barig - igydF4y2Bapre-mRNA并破坏其与DHX9的关联，最终导致circrg - i的生成。此外，circrg - i的诱导对于增强的致癌炎症是必需的gydF4y2Barig - igydF4y2Ba突变。相反，我们发现全反式维甲酸作为DHX9激动剂，限制circrg - i的表达，改善结肠炎症损害gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。因此，我们的数据揭示了circrg - i - ddx3x信号通路在结肠炎症及其相关癌症发展的非特异性炎症反应中的刺激作用。gydF4y2Ba

种系RIG-I突变与结肠癌的发生有关gydF4y2Ba

RLR信号的解除与结肠肿瘤的发生有关gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．评估…的状态gydF4y2Barig - i / DDX58gydF4y2Ba在结肠癌中，我们进行了测序分析gydF4y2Barig - igydF4y2Ba结肠癌患者的425份血液样本中的外显子。比较gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在350名健康对照受试者中，我们鉴定出5名外显子3残基395位点存在杂合移码变异的患者(3个样本携带TgydF4y2Ba^395gydF4y2Ba> -和两个与TTAA样品gydF4y2Ba^{395年_398gydF4y2Ba}> -)，没有移码变体gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在健康对照组中被检测到(补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．由于这些移码突变引入了一个预先停止的密码子到的开放阅读框(ORF)gydF4y2Barig - igydF4y2Ba，因此我们假设这种种系gydF4y2Barig - igydF4y2Ba突变可影响基因的表达gydF4y2Barig - igydF4y2Ba和宿主的先天免疫gydF4y2Ba

移码突变体Rig-i小鼠的生成gydF4y2Ba

目的:研究移码变异体的生物学功能gydF4y2Barig - igydF4y2Ba，我们利用CRISPR/Cas9技术，在基因的外显子3产生了同合或杂合移码突变的小鼠gydF4y2Barig - igydF4y2Ba的移码变体gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在人类(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这些gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠有生育力，发育正常，这与gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．随后的全外显子组测序和Sanger测序进一步证实了其准确性和特异性gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠(补充图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

评估RIG-I in的状态gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}在小鼠中，我们从野生型小鼠胚胎成纤维细胞(mef)中提取，gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{+ / fsgydF4y2Ba},gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}在交配后13.5 d (dpc)对小鼠胚胎进行western blot检测其n端抗rig - i抗体。不出所料，RIG-I蛋白水平在gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}MEFs，在gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{+ / fsgydF4y2Ba}相对于WT mef中的mef(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．在暴露于水泡性口炎病毒(VSV)的mef中也检测到类似的结果(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．此外，两者均未检测到截断RIG-IgydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{+ / fsgydF4y2Ba}而且gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}mef(无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．为了进一步证实这一结果，我们采用质谱分析来确定是否有gydF4y2Barig - igydF4y2Ba移码突变基因可以转译为蛋白质。尽管在野生型mef中发现了许多覆盖RIG-I全长的肽，但在野生型mef中没有检测到肽gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}MEFs，与western blot检测结果一致(补充图。gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Rig-ifs/fs小鼠对结肠癌的易感性增加gydF4y2Ba

以确定移码是否突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba与结肠癌的发生有关，我们使用偶氮甲烷和右旋糖酐硫酸钠(AOM-DSS)模型诱导结肠炎相关癌(CAC)。在炎症期，检测到更明显的体重减轻gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型同窝小鼠对照相比(图;gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．血清中CA19-9、CEA等结肠癌诊断标志物水平明显升高gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}AOM-DSS治疗后第89天(图;gydF4y2Ba1 d, egydF4y2Ba)．然后对小鼠实施安乐死并对肿瘤进行评估。如图所示。gydF4y2Ba1 f-hgydF4y2Ba，肿瘤数量和大小均显著增加gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠比较。组织学分析显示，多为低级别腺癌，常侵犯粘膜下层，偶见侵犯固有肌层gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比(图;gydF4y2Ba1我gydF4y2Ba)．此外，我们观察到脾脏明显增大gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比，AOM-DSS对小鼠的影响更大。gydF4y2Ba1 j, kgydF4y2Ba)．与宿主抗肿瘤免疫的有益作用不同，炎症在结肠癌的发生中起着有害的作用gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．以确定移码是否突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba我们采用流式细胞术分析脾脏免疫细胞与肿瘤区域固有层单核细胞(lpcs)的比例。与脾脏中T细胞比例较低的T细胞相比，mLN和PPs来自gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba1 lgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，大量的T细胞被招募到结肠gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比，AOM-DSS对小鼠的影响更大。gydF4y2Ba1米gydF4y2Ba)．因此，我们的数据表明，刺激效应的移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba促进结肠癌的发展gydF4y2Ba

Rig-i中增强的炎症反应主要促进了CAC的发展gydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠gydF4y2Ba

排除移码突变的可能性gydF4y2Barig - igydF4y2Ba直接促进肿瘤起始，我们在野生型和DSS中进行了单独AOM和单独DSS的实验gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。我们对未加DSS的AOM诱导的肿瘤数量进行了6个月的监测，发现WT和AOM诱导的血清CA19-9和CEA水平、肿瘤体积和肿瘤数量均无差异gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠，提示移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba很少参与肿瘤的发生(补充图。gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们接下来调查的作用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba2% DSS处理小鼠的移码突变。正如所料,gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比，DSS处理后的小鼠表现出更高的死亡率、更短的结肠长度和更严重的结肠炎症损伤。gydF4y2Ba2模拟gydF4y2Ba)．此外，我们还用ELISA法测定了血液和结肠组织间液中释放的IL1β和TNFα蛋白水平。如补充图所示。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba，血液和细胞外基质中释放了大量的促炎细胞因子gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠比较。除急性结肠炎模型外，治疗后观察到更多明显的病理病变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}根据生存曲线、体重减轻、总组织评估和结肠长度来确定，在急性期和恢复期DSS为2.5%的小鼠。gydF4y2Ba七氟gydF4y2Ba)．组织学分析显示，严重的隐窝畸形，杯状细胞衰竭和大量的炎症细胞浸润gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比(补充图;gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba)．总的来说，我们的数据表明增加的易感性gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠对CAC的影响主要归因于RIG-I突变对结肠炎症的刺激作用。gydF4y2Ba

Rig-i突变以上皮细胞固有的方式加剧炎症损伤gydF4y2Ba

以确定是否炎症反应增强所致gydF4y2Barig - igydF4y2Ba移码突变是由于免疫细胞或非免疫细胞的异常调节引起的，我们采用骨髓移植实验来重建野生型免疫系统gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。野生型和gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}对小鼠进行致命照射，并移植来自野生型供体小鼠的骨髓。移植小鼠静置2个月，使其免疫系统完全重建，然后进行DSS治疗(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．急性DSS结肠炎诱导后，gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}接受野生型供体骨髓的小鼠与未移植的小鼠表现出类似的结肠炎易感性增加gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}通过生存曲线、总组织、体重减轻评估和组织学分析确定(图2)。gydF4y2Ba2 f jgydF4y2Ba)．反过来，我们进行骨髓移植试验，以重建野生型或gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}野生型小鼠的免疫系统。经DSS处理后，重组小鼠具有gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}通过体重减轻、生存曲线和总体组织评估，供体骨髓与接受野生型供体骨髓的小鼠表现出类似的结肠炎易感性(补充图)。gydF4y2Ba7 h-jgydF4y2Ba)．我们的数据证明了移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在非免疫细胞而非免疫细胞中，严重的炎症损害是由免疫细胞所致。gydF4y2Ba

为了破译RIG-I在宿主炎症反应中的作用，我们对移植的野生型或小鼠结肠组织进行了RNA测序(RNA-seq)分析gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。利用基因集富集分析(GSEA)，我们发现基因的移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba促进肠细胞表达更高水平的与I型IFN信号通路相关的基因(图。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)．鉴于I型IFN也参与了LPS诱导的感染性休克，我们还在小鼠中进行了LPS挑战实验，以进一步证实移码的刺激作用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba炎症反应调节的突变。LPS刺激后，观察到严重的死亡率gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比(图;gydF4y2Ba2 lgydF4y2Ba)．根据dss诱导的结肠炎模型的数据，与先天免疫反应激活相关的基因也在肝脏中富集gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比(图;gydF4y2Ba2米gydF4y2Ba)．随后进行实时PCR检测，以进一步证实与炎症反应相关的基因水平较高，包括gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIsg15gydF4y2Ba的肝脏中检测到gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba2 n, ogydF4y2Ba)．这些体内实验结果表明移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba增强上皮细胞I型IFN信号通路，加剧炎性组织损伤。gydF4y2Ba

病毒感染通过RIG-I突变刺激增强免疫反应gydF4y2Ba

鉴于…的刺激作用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba移码突变调控I型IFN，因此我们假设gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠对病毒感染有抵抗力。为此，我们利用水疱性口炎病毒(VSV)感染野生型和野生型gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。如图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba，移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba显著改善VSV感染小鼠的结局。病毒在肺、脾、肝等多个器官的复制均受到抑制gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型小鼠相比较(图;gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．与体内数据一致，我们还观察到较低的病毒滴度和较高的ifn刺激基因的表达gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}mef与野生型mefsmef的比较(图;gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．进一步确认的作用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在I型IFN的调节突变中，我们使用RNA-seq法分析之间的差异表达基因gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}野生型mef。如图所示。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba， I型IFN信号通路相关基因富集gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}mef与对照细胞比较。我们的数据证明了移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba通过促进I型IFN的产生限制病毒复制。gydF4y2Ba

RIG-I突变触发环状RIG-I的生成gydF4y2Ba

除了蛋白质水平，转录gydF4y2Barig - igydF4y2Ba也被下调了gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}MEFs，肝脏和脾脏是否有病毒感染(图。gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba)．有趣的是，我们注意到gydF4y2Barig - igydF4y2Ba从gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}在VSV感染的小鼠，尽管降低mRNA水平gydF4y2Barig - igydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 d, egydF4y2Ba)．鉴于RIG-I在调节宿主先天免疫中的刺激作用，可以想象，RIG-I的缺失很难刺激增强的I型IFN的产生，这与我们的移码突变的数据相矛盾gydF4y2Barig - igydF4y2Ba激活IFN信号。因此我们假设移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba不仅在转录后水平上影响RIG-I的表达，而且对宿主免疫应答的调节具有刺激作用。gydF4y2Ba

为此，我们首先使用了RNAfold web服务器(gydF4y2Bahttp://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgigydF4y2Ba)来预测RNA的二级结构，并发现移码突变相对于野生型RNA的茎环结构显著受损(图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．利用已发表的DHX9交联免疫沉淀测序(CLIP-seq)数据gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba，我们发现DHX9在的pre-mRNA上达到峰值gydF4y2Barig - igydF4y2Ba与DHX9结合序列中Alu SINEs优先富集相一致(图5)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．RNA-pulldown实验进一步证实了的pre-mRNA之间的关系gydF4y2Barig - igydF4y2BaDHX9(图;gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)．更重要的是，移码突变的gydF4y2Barig - igydF4y2Ba其与DHX9的相关性明显受损(图;gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba)．鉴于DHX9在调节环状rna生物发生中的重要作用gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba的移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba可以触发RIG-I转录本生成circRNA。gydF4y2Ba

为了降低背景噪声，提高circRNA鉴定的可靠性和准确性，我们处理了病毒感染的野生型和野生型中核糖体rna耗尽的总rnagydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}MEFs与RNase R一起降解线性RNA和富集环状RNA，最终进行高通量RNA测序。最后，我们识别出mmu-DDX58_0004 (circAtlas ID) (gydF4y2Bahttp://circatlas.biols.ac.cn/gydF4y2Ba)，在gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}病毒感染后mef与WT对照的比较(补充图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．如图所示。gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba， mmu-DDX58_0004来源于其中的第5、12外显子gydF4y2Barig - igydF4y2Ba该基因的存在可以通过特异性的发散引物进一步证实，并通过后续的测序分析验证了mmu-DDX58_0004预测的剪接结。假设mmu-DDX58_0004来源于gydF4y2Barig - igydF4y2Ba，因此我们将其命名为circrg - i。与它的线性对应物相比，circrg - i含量丰富，对RNase R处理具有抗性(图2)。gydF4y2Ba4 jgydF4y2Ba)．此外，我们使用与剪接结杂交的探针来区分circrg - i，并使用与外显子5杂交的探针来区分circrg - i及其宿主基因RIG-I (Fig. blotting)。gydF4y2Ba4 kgydF4y2Ba)，进一步证实了circrg - i的存在。为了分析circrg - i的亚细胞定位，我们使用RNA荧光原位杂交(FISH)发现circrg - i主要定位在细胞质中(图2)。gydF4y2Ba4 lgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

评估circrg - i in的状态gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}在小鼠中，我们使用qRT-PCR检测，发现circrg - i的转录在小鼠中增加gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}病毒感染的mef相对于WT mef(图。gydF4y2Ba4米gydF4y2Ba)，与mRNA水平的降低形成对比gydF4y2Barig - igydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．此外，我们还分析了circrg - i在体内的表达情况。如图所示。gydF4y2Ba4 ngydF4y2Ba与WT小鼠相比，circrg - i在肺和肝脏中表达上调gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠暴露于病毒。我们的数据证明了移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba触发circrg - i的产生。gydF4y2Ba

circrg - i在结肠癌中上调gydF4y2Ba

人类circrg - i可以通过CIRCpedia V2数据库进行查询。随后的测序实验进一步验证了预测的人circrg - i的剪接连接(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．接下来，我们通过RT-qPCR检测circrg - i在结肠癌组织及其匹配的邻近正常组织中的表达gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．如图所示。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba， circrg - i在结肠癌中表达上调。通过临床病理特征分析，我们发现溃疡性结肠癌比息肉样结肠癌表达更高水平的circrg - i(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．circrg - i表达上调与肿瘤(III/IV)分期及患者年龄高度相关，与患者性别、肿瘤亚型及部位无明显相关性(图2)。gydF4y2Ba5 d - hgydF4y2Ba)．除结肠癌外，我们还分析了circrg - i在溃疡性结肠炎患者炎症灶(P)和邻近正常组织(N)中的表达。如图所示。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba，与正常组织相比，炎症灶中circrg - i的表达增加，这进一步支持了circrg - i参与肿瘤相关炎症的观点。因此，这些发现表明circrg - i的失调可能有助于结肠癌的进展。gydF4y2Ba

circrg - i增强宿主先天免疫反应gydF4y2Ba

为了确定circrg -I是否对增加I型IFN的产生至关重要，我们使用了短发夹RNA (shRNA)，它靶向circrg -I的后剪接结，选择性地敲除circrg -I，而不影响其线性对应物gydF4y2Barig - igydF4y2Ba．如补充图所示。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，在转染plko - circrg - i -2或plko - circrg - i -3而不是plko - circrg - i -1或plko - circrg - i -4的细胞中，circrg - i的表达下调，而不是相应的线性mRNA。因此，我们利用plko - circrg - i -2和plko - circrg - i -3进一步分析了circrg - i在调节宿主抗病毒免疫中的作用。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba， circrg -I的沉默在一定程度上削弱了对I型IFN和ISG产生的刺激作用(gydF4y2BaIfitm2gydF4y2Ba)在WT或gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}暴露于VSV的MEFs。接下来我们将circrg - i转染到HEK293T细胞中。PCR结果证实了circrg - i在HEK293T细胞中的强制表达(图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．如图所示。gydF4y2Ba6汉英gydF4y2Bacircrg -I的过表达限制了病毒复制并增强了I型IFN的产生。同样，在病毒感染期间，表达circrg - i的细胞中，其他ISGs的表达也增加了(图2)。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

IRF3作为转录因子，其活性对宿主的先天免疫至关重要。通常情况下，IRF3通过TBK1的磷酸化被激活，进而形成同源二聚体，最终导致核易位，并通过与靶基因组区域结合启动I型ifn和各种抗病毒基因的转录。如图所示。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba病毒感染在表达circrg - i的细胞和对照细胞中都触发了IRF3磷酸化。值得注意的是，在表达circrg - i的细胞中，IRF3的磷酸化水平显著升高(图2)。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)．我们接下来确定circrg - i是否影响IRF3的二聚化和随后的核易位。在VSV感染后，与对照细胞相比，在表达circrg - i的细胞中检测到IRF3的二聚体和核积累增加(图2)。gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba)．综上所述，我们的数据确定了circrg - i在调节宿主先天免疫中的刺激作用。gydF4y2Ba

CircRIG-I可激活DDX3X/MAVS/TRAF5/TBK1通路gydF4y2Ba

在对病毒dsRNA的反应中，RIG-I和MDA5等rlr通过连续激活MAVS/TBK1/IRF3轴来触发先天免疫反应，从而产生I型IFN。相反，IFN-IFNR信号激活JAK-STAT通路，导致ISGs的表达，从而调节宿主免疫程序。为了确定circrg - i在调节宿主先天免疫中的作用，我们首先将circrg - i转染到存在或不存在IFNβ的HEK293T细胞中。如补充图所示。gydF4y2Ba11个gydF4y2Ba在IFNβ处理下，circrg - i的强制表达几乎不影响ISGs的表达。接下来我们共转染活性截断的MDA5 (MDA5gydF4y2Ba_{1 - 350gydF4y2Ba})或加入circrg - i的MAVS进入HEK293T细胞。与对照细胞相比，circrg - i的过表达增强了RLR信号诱导的IFNβ和其他ISGs的上调(补充图)。gydF4y2Ba11 bgydF4y2Ba)．因此，我们的数据表明，circrg - i触发RLR信号的激活而不是IFN信号的激活来抑制病毒复制。gydF4y2Ba

为了研究circrg - i正向调节宿主先天免疫的分子机制，我们开发了MS2-MCP-TurboID系统，并进行了基于邻近的标记筛选。将4份MS2拷贝连接到表达circrg - i的载体上。为了确定MS2连接是否影响circrg - i的生物学功能，我们将circrg - i或circrg - i -MS2转染到HEK293T细胞中。暴露于VSV-GFP感染后，circrg - i - ms2引发了与circrg - i类似的抗病毒作用，这进一步证实了circrg - i - ms2的可用性(补充图。gydF4y2Ba12个一个gydF4y2Ba)．接下来，我们将circrg - i -MS2与编码MS2包衣蛋白(MCP)-TurboID的载体共转染HEK293T细胞，并用VSV处理细胞。在生物素亲和捕获之后，生物素化的蛋白质被纯化并通过质谱分析(图2)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．如补充图所示。gydF4y2Ba12个罪犯gydF4y2Ba，含有核苷酸结合域或RNA识别基序的蛋白质在circrg - i的相互作用组中富集。其中，一个值得注意的发现是DDX3X作为circRIG-I的强结合伙伴(图2)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba及补充资料gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，通过RNA下拉试验和共聚焦试验证实(图。gydF4y2Ba7 c, dgydF4y2Ba)．随后的交联免疫沉淀(CLIP)试验证实了DDX3X与circrg - i的连锁(图2)。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba)，进一步证实了DDX3X和circrg - i之间的物理联系。gydF4y2Ba

为了确定circrg - i信号是否需要DDX3X，我们使用shRNA敲低内源性MDA5, MVAS, DDX3X或IRF3在野生型和gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}分别为mef(补充图。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．在VSV-GFP感染后，尽管MAVS的丢失部分削弱了抗病毒作用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}mef，绿色荧光蛋白的比例较低gydF4y2Ba^+gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}与野生型mef相比，内源性MDA5沉默时观察到mef(补充图)。gydF4y2Ba13 bgydF4y2Ba)．此外，在野生型和野生型中检测到相同的高病毒滴定和低水平的ISGsgydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}内源性DDX3X或IRF3敲除的MEFs(补充图)gydF4y2Ba13 cgydF4y2Ba)．因此，我们的数据表明，DDX3X-IRF3信号通路对于病毒的抗病毒作用至关重要gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}mef。gydF4y2Ba

为了研究circrg - i促进DDX3X激活的机制，我们使用免疫沉淀和质谱(MS)来识别存在或不存在circrg - i时DDX3X相关蛋白的动态变化。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba及补充资料gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．利用细胞壁，我们鉴定出多种ddx3x相关蛋白，包括TBK1、EIF4G1和EIF3A，这与之前的报道一致(图2)。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba,)。值得注意的是，circRIG-I的存在促进了DDX3X与MAVS、TRAF家族(TRAF1、TRAF4和TRAF5)以及TBK1的关联(图1)。gydF4y2Ba7 ggydF4y2Ba， Down)，这对激活宿主先天免疫至关重要。为了进一步证实这些结果，我们将DDX3X与MAVS、TRAF2、TRAF4、TRAF5、TRAF6或TBK1共转染到HEK293T中，无论有无circrg - i。如图所示。gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba在circrg - i存在的情况下，DDX3X与MAVS、TRAF4、TRAF5和TBK1的相关性增强，而不是与TRAF2或TRAF6的相关性。总的来说，我们的数据表明circrg - i通过激活DDX3X刺激irf3介导的先天免疫信号。gydF4y2Ba

全反式维甲酸通过抑制circrg - i表达改善免疫病理gydF4y2Ba

全反式维甲酸(ATRA)已被报道参与RIG-I表达的调控gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．有趣的是，我们还发现ATRA治疗也促进了gydF4y2BaDhx9gydF4y2Ba表达是circrg - i生物发生的负调控(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．以确定ATRA是否也影响转录后gydF4y2Barig - igydF4y2Ba的pre-mRNA和mRNA水平gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在ATRA处理下的野生型mef中。如图所示。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba,gydF4y2Barig - igydF4y2Ba随着ATRA剂量的增加，mRNA水平逐渐升高，而不是其pre-mRNA水平逐渐升高。相反，circrg - i的表达在这一过程中被抑制(图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．此外，ATRA处理减弱了circrg - i在移码突变背景下的上调gydF4y2Barig - igydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．鉴于circrg - i的上调对于增强免疫反应是必不可少的gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}因此，我们假设补充ATRA可以改善小鼠的病理损伤gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}DSS处理的小鼠。为此，我们处理了野生型或gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}有或没有ATRA的小鼠存在DSS。尽管在野生型小鼠的病理病变轻度缓解，补充ATRA显著改善的结果gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}由生存曲线、结肠长度和组织学分析确定的急性dss诱导结肠炎小鼠(图2)。gydF4y2Ba8情况gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总的来说，我们的数据证明移码突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba触发circrg -I，进而激活DDX3X/MAVS/TRAF5/TBK1轴，最终加强I型IFN的产生和结肠炎症损伤。反过来，ATRA作为circrg - i的抑制因子，可以作为一种潜在的策略来治疗由移码突变引起的严重结肠炎症gydF4y2Barig - igydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

积累的研究表明，RIG-I除了检测外源病毒rna外，还参与多种细胞活动gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba．在这里，我们确定了移码gydF4y2Barig - igydF4y2Ba结肠癌患者的变异。发病率gydF4y2Barig - igydF4y2Ba突变显著高于GnomAD数据库的群体频率(0.0004%)。此外,这种gydF4y2Barig - igydF4y2BaCOSMIC数据库中已记录该突变(突变ID: COSM6995308)，但该突变的功能尚不清楚。有趣的是，这种移码变体(rs760088776)也在单默顿综合征(SMS)患者中被检测到。SMS是一种常染色体显性多系统疾病，以牙齿发育不良、骨骼异常等表型为特征gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba．最近的研究表明，SMS被认为是一种I型干扰素病，其中I型IFN的上调被认为在疾病的发病机制中起着核心作用gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．换句话说，移码突变体gydF4y2Barig - igydF4y2Ba可以刺激IFN信号的激活。考虑到RIG-I的mRNA和蛋白水平在突变的情况下都会受损gydF4y2Barig - igydF4y2Ba，唯一合理的解释是可诱导的circrg -I对I型IFN的产生产生积极的影响。因此，我们的数据显示circRIG-I直接与DDX3X相互作用并激活DDX3X信号，最终通过上调I型IFN的产生来增强炎症反应。因此，我们的数据提供了对突变体的深入了解gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在结肠炎和其他自身免疫性疾病期间起作用。gydF4y2Ba

以前，有两种gydF4y2Barig - igydF4y2Ba产生缺陷小鼠，其中外显子8至10 (Δ8-10)或外显子4至8 (Δ4-8)gydF4y2Barig - igydF4y2Ba分别被删除，而这些小鼠的表型是有争议的gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9技术生成了基因外显子3移码突变的小鼠gydF4y2Barig - igydF4y2Ba的开放阅读框(ORF)中引入了一个预停止密码子gydF4y2Barig - igydF4y2Ba．通过全外显子组测序和western blot证实RIG-I的破坏。按照gydF4y2Barig - igydF4y2Ba缺陷小鼠(Δ4-8)，我们的纯合子gydF4y2Barig - igydF4y2Ba敲除小鼠可活且可育，这与高致死率的毒株不同gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^-/-gydF4y2Ba胚胎发生期间的小鼠(Δ8-10)。类似于易感性的增加gydF4y2Barig - igydF4y2Ba缺陷小鼠(Δ4-8)到实验性结肠炎，gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠还表现出严重的结肠炎症和加剧的上皮细胞恶性转化。除结肠炎外，突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在lps诱导的脓毒症和病毒感染中增强炎症损伤。鉴于炎症在DNA突变和免疫逃逸中的重要作用，可以想象突变引起的非特异性炎症增强gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在结肠中引起致癌作用。gydF4y2Ba

pre-mRNA可以被剪接以生成线性或环状RNA。当前mRNA剪接位点按规范顺序连接时，就会生成线性mRNA。否则，反向剪接可以将剪接供体连接到上游剪接受体，生成环状RNAgydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．规范剪接和反向剪接之间的竞争有助于确定哪个成熟的rna是由一个基因产生的gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．虽然移码突变的gydF4y2Barig - igydF4y2Ba外显子3上的突变对参与后剪接的后剪接位点(外显子5/外显子12)的序列影响不大，但相对于野生型RNA的茎环结构受损。通过分析已发表的CLIP-seq数据，我们发现DHX9的3-5外显子和12-15外显子上有峰gydF4y2Barig - igydF4y2Bapre-mRNA，位于短散布的核元件(sin)上或周围。考虑到Alu SINEs在环状RNA生成的顺式调控中的关键作用，DHX9作为一种反式因子，抑制源于Alu入侵人类基因组的RNA加工缺陷。我们的数据显示移码突变阻断了dhx9与的前rna的结合gydF4y2Barig - igydF4y2Ba，从而释放Alu元素对后剪接的刺激作用，最终产生circrg - i。gydF4y2Ba

由于DHX9参与了多个细胞过程，包括DNA复制、转录、翻译、microRNA生物发生、RNA加工和基因组稳定性的维持，累积的研究表明DHX9对肿瘤的发展具有双重作用gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．在这里，我们发现ATRA治疗增加了DHX9的转录，从而阻断了circrg - i的诱导，改善了结肠的炎症损伤。鉴于炎症在结肠癌的发生中起着有害的作用gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba因此，我们的数据表明，在炎症期或肿瘤发生的早期，ATRA治疗增加DHX9的表达可以改善肠道炎症损伤，并以时间依赖的方式阻止肿瘤进展。相反，在肿瘤发生的晚期，上调DHX9表达可引发复杂的肿瘤发展影响，可能是细胞环境依赖的方式。gydF4y2Ba

虽然目前已有许多方法来分析环状RNA的生物学功能，但每种方法都有其局限性。例如，通过RNA纯化(ChIRP)和RNA下拉分离染色质在很大程度上取决于核苷酸结合的特异性和效率gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}．此外，利用体外转录的RNA可能会错过结构依赖的靶点，难以揭示环状RNA-蛋白质相互作用的瞬时和动态网络gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}．此外，ms2标记的RNA亲和纯化(MS2-TRAP)会受到过度或不足交联的影响，可能不能真实反映生理状况gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．为了解决以circrna为中心的相互作用组映射的挑战，我们开发了一种基于邻近的标记筛选结合MS2-MS2包衣蛋白(MCP)策略来发现circrg - i的相互作用伙伴。通过将MCP与生物素连接酶TurboID融合，MS2标记的circRNA的相邻蛋白被共价标记，从而可以通过链霉亲和素珠分离并随后通过质谱鉴定gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba．我们研究中引入的circRNA-MS2-MCP-TurboID技术可以捕捉微弱和短暂的circrna -蛋白质相互作用，并揭示circrg - i参与的信号通路。此外，随后的CLIP试验进一步保证了MS2-MCP-TurboID系统的可靠性。因此，我们希望这种有效的方法也能促进未来对环状rna -蛋白质相互作用组的研究。gydF4y2Ba

总之，我们的数据揭示了突变体的刺激作用gydF4y2Barig - igydF4y2Ba在结肠炎和结肠炎相关结肠癌的发展中。通过诱导circrg - i突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba激活DDX3X信号级联，最终导致I型IFN的产生和严重的炎性组织损伤。相反，补充ATRA可以通过抑制circrg - i的表达来改善癌症相关的炎症。因此，我们对circrg - i的致癌作用的鉴定为结肠炎和炎症性癌症的治疗提供了一个潜在的治疗靶点。gydF4y2Ba

老鼠gydF4y2Ba

rig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}通过crispr - cas9介导的基因编辑生成小鼠(C57BL/6 J背景)。小鼠序列(GGAATGTGAAGAAATCAGAC)gydF4y2BaDdx58gydF4y2Ba外显子3中的基因被靶向。所有动物都被安置在特定的无病原体条件下。使用6-8周大的雄性小鼠。所有实验均按照北京大学医学部伦理委员会(ECPKUHSC) (LA2021487)批准的方案进行。gydF4y2Ba

CRISPR-Cas9脱靶检测与分析gydF4y2Ba

从野生型和野生型结肠组织中提取基因组DNAgydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。以检测是否有任何潜在的脱靶gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}在小鼠中，我们选择了前10个可能通过off - spot被错误识别的基因(gydF4y2Bahttps://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/gydF4y2Ba)，并通过DNA测序检测其相应的基因组(所有引物，补充数据gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)．中未检测到相应基因的基因组突变或缺失gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}老鼠。此外，我们通过全外显子组测序(WES)对CRISPR-Cas脱靶进行了全基因组检测和分析。gydF4y2Ba

患者与标本gydF4y2Ba

人体血液标本取自中日友好医院的425名结肠癌患者和350名健康受试者。使用TIANamp血液DNA试剂盒(TIANGEN)从血液样本中提取基因组DNA，然后作为模板进行PCR扩增gydF4y2Barig - igydF4y2Ba外显子，随后进行测序分析。人类结肠癌及其相匹配的正常组织取自在中日友好医院接受结肠癌手术的患者。所有程序均经中日友好医院机构审查委员会(No. 2019-50-Q07)批准，并获得所有受试者的知情同意(符合赫尔辛基宣言)。用于放大的引物gydF4y2Barig - igydF4y2Ba外显子3测序结果为正向5 ' - GAAGACCTAAAGTGTTGGCTGAC-3 '，反向5 ' - GGGTTTCAATGATCTTTCTCAGGT-3 '。gydF4y2Ba

CAC(结肠炎相关癌症)的诱导gydF4y2Ba

用于CAC诱导gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba， 6周大的男性gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}使用野生型(WT)小鼠。单次腹腔注射10mg /kg氮氧甲烷(AOM) (Sigma, A5486-25MG) 7天后，给予2%(重量/体积)硫酸右旋糖酐钠(MP, 0216011090)治疗3个周期。1个周期包括7天DSS治疗，随后休息14天(饮用常规水)。在肿瘤大小达到ECPKUHSC允许的最大肿瘤负荷(小鼠体重的10%或终点为2000 mm3)前的第90天处死小鼠gydF4y2Ba

急性结肠炎的诱导与评价gydF4y2Ba

急性结肠炎诱导，6周大的男性gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}野生型(WT)小鼠给予2%或2.5% DSS，每天记录体重。gydF4y2Ba

骨髓移植gydF4y2Ba

对受体小鼠进行致死照射(1000 cGy/只)gydF4y2Ba注射gydF4y2Ba．注射5 × 10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba骨髓细胞来自野生型或gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}小鼠股骨和胫骨。移植小鼠2个月后进行实验，确保骨髓重建。gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验(ELISA)gydF4y2Ba

按照厂商说明书(CEA: Dogesce, DG30128M;Ca19-9:美面，mm-44828m2)。gydF4y2Ba

组织间质液gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba得到如下。将肠道组织置于40 μm细胞过滤器上，在4℃下以40 g离心5 min，去除表面液体。然后在4°C下以400 g旋转样品10分钟，收集液体作为TIF。TIF和血浆在10000 g下旋转5 min，去除不溶性颗粒，上清进行ELISA检测。gydF4y2Ba

ELISA检测小鼠血清和组织间液中IL-1β和TNFα (IL-1β: R&D, MLB00C;Tnfα: r&d, mta00b)。gydF4y2Ba

脂多糖诱导的感染性休克gydF4y2Ba

6周大的男性gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}野生型(WT)小鼠腹腔注射LPS (10 mg/kg)，每日监测小鼠健康状况。gydF4y2Ba

VSV感染模型gydF4y2Ba

对于VSV感染，6周龄雄性野生型或gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}用1 × 10静脉注射感染小鼠gydF4y2Ba^8gydF4y2BaVSV的p.f.u.。gydF4y2Ba

全反式维甲酸(ATRA)治疗gydF4y2Ba

rig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}野生型(WT)小鼠注射2% DSS，第3天腹腔注射玉米油加ATRA (15 mg/kg)。gydF4y2Ba

免疫共沉淀和免疫印迹分析gydF4y2Ba

用合适的质粒转染HEK293T细胞，用共免疫沉淀裂解缓冲液(10% glycerol, 0.5% NP-40, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)进行裂解。细胞裂解物与抗flag抗体(Sigma, F3165)和蛋白A/G (Santa Cruz Biotechnology, sc-2003)一起孵育。珠粒经PBSN (PBS含0.1% NP-40)洗涤3次，SDS-Page。对于亚细胞分离，使用核-细胞质提取试剂盒(Applygen, P1200)按照制造商的方案分离核和细胞质提取物。gydF4y2Ba

本研究使用的抗体如下:抗rig - i (Santa Cruz Biotechnology, sc-376845, 1:1000)，抗p- irf3 (Cell Signaling Technology， #4947, 1:1000)，抗mda5 (ab克隆，A2419, 1:5000)，抗mavs (abcam, ab189109,1:2000)，抗irf3 (abcam, ab68481, 1:2000)，抗ddx3x (Santa Cruz Biotechnology, sc-365768, 1:5000)，抗dhx9 (Santa Cruz Biotechnology, sc-137232, 1:5000)，抗gapdh (RayAntibody, RM2002, 1:500)，抗-α-微管蛋白(RayAntibody, RM2007, 1:500)，抗hdac1 (Santa Cruz Biotechnology, sc-8410, 1:1000)，抗flag (Sigma，F3165, 1:5000)，抗gfp (RayAntibody, RM1008, 1:5000)，抗gfp (RayAntibody, RM1008)，小鼠IgG (H + L) KPL过氧化物酶标记抗体(Seracare, 5220-0341, 1:5000)和兔IgG (H + L) KPL过氧化物酶标记抗体(Seracare, 5220-0336, 1:5000)。gydF4y2Ba

北部的污点gydF4y2Ba

10微克总RNA经RNase R消化或不经RNase R消化后，在1.2%的甲醛琼脂糖凝胶上分解，并转移到Hybond-N +膜上。RNA通过紫外交联(1200 J)固定在膜上。用生物素标记探针在68°C过夜进行杂交。膜在阻滞缓冲液中阻滞30分钟，然后与链霉亲和素- hrp孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤3次，检测液孵育5 min后，x射线胶片曝光。探针序列显示如下:circrg - i连接位点探针，5 ' -Biotin-AGCCCTTTTGAAACCTTCAAACCTCCG-3 ';外显子5探针，5 ' - biotin - CCTGAATGAAAATCTGGATGCTGGA-3 ';Actb探针，5 ' -生物素- CTCTTTGATGTCACGCACGAT-3 'gydF4y2Ba

H&E(苏木精-伊红)染色gydF4y2Ba

H&E染色采用甲醛固定后石蜡包埋。用4 μm厚的切片按标准方案进行H&E染色。图像采集使用奥林巴斯IX51显微镜。gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，然后根据制造商的方案(Promega)逆转录为cDNA。cDNA定量采用ABI 7500检测系统。PCR引物序列见补充数据gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

为了检测病毒复制，用VSV-GFP和GFP感染HEK293T、mef和iBMDMgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba采用流式细胞仪检测细胞数量。gydF4y2Ba

目的分析淋巴结、脾脏和LPMC的免疫细胞群gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba，分离淋巴细胞，室温下与特异性抗体孵育30min。使用apc标记的抗cd4抗体(Biolegend, GK1.5, 1:500)、fitc标记的抗cd8抗体(Biolegend, 53-6.7, 1:500)和pe标记的抗b220抗体(Biolegend, RA3-6B2, 1:500)。gydF4y2Ba

RNA测序分析gydF4y2Ba

为了研究RIG-I缺陷在抗病毒免疫中的作用，从野生型或野生型的13.5日龄胚胎中制备小鼠胚胎成纤维细胞(mef)gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}用VSV或LCMV Cl13处理小鼠，体外培养24小时。然后用聚t低聚磁性珠纯化总RNA。RNA-seq文库使用NEBNext®UltraTM RNA 24 Library Prep Kit for Illumina®(NEB, USA)构建，并在Illumina平台上测序，端对reads为125 bp/150 bp。根据制造商的说明，通过从原始数据中去除含有适配器和poly-N的读取以及低质量的读取来获得干净的数据。根据基因模型注释文件，用参考基因组Hisat2 (version 2.0.5)绘制干净的reads。根据基因的长度和映射到该基因的reads计数，计算每个基因的每千碱基每百万映射reads (FPKM)片段数。RNAseq数据中的基因集与MSigDB中的管理数据集(C5.all.V6.2, H.all.V6.2)进行了重叠分析gydF4y2Bahttp://software.broadinstitute.org/gsea/index.jspgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细胞gydF4y2Ba

HEK293T细胞来自American Type Culture Collection (ATCC)。原代小鼠胚胎成纤维细胞(mef)来自野生型(WT)，gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{+ / fsgydF4y2Ba}或gydF4y2Barig - igydF4y2Ba^{fs / fsgydF4y2Ba}交配后13.5 d小鼠胚胎。永生化骨髓来源的巨噬细胞(iBMDMs)由You Fuping博士(北京大学医学部，中国)提供。gydF4y2Ba

为了获得稳定转染iBMDM的细胞，将circrg - i序列克隆到pLV-ciR慢病毒载体中。HEK293T细胞转染psPAX2、pMD2。G和慢病毒结构。转染48小时后，用添加8 μg/ml聚brene的上清液进行感染。为获得过表达稳定的细胞，用2 μg/ml嘌呤霉素筛选阳性细胞。gydF4y2Ba

对于circrg - i敲除MEFs细胞，shrna靶向circ_RIG-I的连接位点(1gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: CTCGGAGGTTTGAAGGTTTCA;2gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GAGGTTTGAAGGTTTCAAAAG;3.gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GTTTGAAGGTTTCAAAAGGGC;4 gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GAAGGTTTCAAAAGGGCTGAA)克隆到pLKO中。1质粒。psPAX2、pMD2转染mef。G和慢病毒结构。如上所述选择阳性细胞。gydF4y2Ba

在MEFs细胞中敲除MDA5, MAVS, DDX3X和IRF3, shRNAs靶向gydF4y2BaIfih1gydF4y2Ba（1gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: CCCATGAGGTATTGTCCTAAA;2gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: CCACAGAATCAGACACAAGTT),gydF4y2Ba小牛gydF4y2Ba（1gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GCTGAGTCAGAGAAACTTAAA;2gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GCAACCAGACTGGACCAAATA),gydF4y2BaDdx3xgydF4y2Ba（1gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: CCCTGCCAAACAAGCTAATAT;2gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GTGGAGTTCTAGTAAAGATAA)和gydF4y2BaIrf3gydF4y2Ba（1gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: GCGTCTAGGCTGGTGGTTATT;2gydF4y2Ba^＃gydF4y2Ba: TGCGGTTAGCTGCTGACAATA)克隆到pLKO中。1质粒。psPAX2、pMD2转染mef。G和慢病毒结构。如上所述选择阳性细胞。gydF4y2Ba

荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光gydF4y2Ba

使用荧光原位杂交(FISH)试剂盒(RiboBio, Guangzhou, China)进行原位杂交。简单地说，iBMDM细胞用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100渗透，37℃预杂交30分钟。将生物素标记的FISH探针加入37℃杂交缓冲液中过夜。用柠檬酸钠盐水(SSC)洗涤后，细胞与DDX3X抗体在室温或非室温下孵育。细胞用Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素(Bioss, bs-0437P-AF555)或荧光基团偶联二抗和DAPI孵育。图像采用尼康TCS A1显微镜拍摄。探针序列显示为circrg - i探针，5 ' -Biotin-AGCCCTTTTGAAACCTTCAAACCTCCG-3 '， U2探针，5 ' -Biotin-CTACACTTGATCTTAGCCAAAAGGCCGAGAAGC-3 '。gydF4y2Ba

国旗下拉gydF4y2Ba

简单地说，HEK293T细胞转染了相应的质粒。24小时后，用共免疫沉淀裂解缓冲液裂解细胞。用anti-FLAG M2珠(Sigma, F2426)在4℃下富集FLAG-DDX3X或FLAG-NLS-RIG-I蛋白4小时。结合成分用3×FLAG肽(Sigma, F4799)洗脱。对样品进行4%-12%的NuPAGE凝胶(Invitrogen)和条子染色(Pierce, 24612)。对切除的凝胶段进行质谱分析gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

接近生物素酰化gydF4y2Ba

用表达MS2包衣蛋白(MCP)-TurboID融合蛋白的质粒和4 × MS2标记的circrg - i转染HEK293T细胞。转染24小时后，以最终浓度100 μM加入生物素30分钟。细胞在采集前用冰冷的PBS冲洗四次。细胞用RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸钠，1% Triton X-100)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)在4°C下裂解30分钟。使用Streptavidin琼脂糖珠(Millipore, 69203)在4℃下富集生物素标记的蛋白质3小时。随后用RIPA裂解缓冲液清洗珠子两次，1 M KCl一次，0.1 M NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba2 M尿素加入10 mM Tris-HCl (pH = 8.0)一次，RIPA裂解缓冲液两次。最后，用洗脱缓冲液(55 mM Tris-HCl (pH = 8.0)， 0.1% SDS, 6.66 mM DTT, 2 mM生物素)煮沸10分钟，对生物素化的蛋白质进行洗脱，并进行4%-12%的NuPAGE凝胶(Invitrogen)和条子染色(Pierce, 24612)。对切除的凝胶段进行质谱分析。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

在进行银条染色后，将凝胶段切除并进行凝胶内胰蛋白酶消化和干燥。10微升多肽(0.1%甲酸溶解)自动采样到100 μm × 10 cm的熔融二氧化硅发射器上，反向相resil - pur C18-AQ树脂填充(3 μm和120 Å;Ammerbuch,德国)。用5-32%乙腈在0.1%甲酸中线性梯度洗脱样品，流速为300 nl/min，洗脱时间为50 min。质谱数据由配备纳米电喷雾离子源(Proxeon Biosystems)的LTQ Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Fisher Scientific)获得。LTQ中的碎片通过碰撞诱导解离(归一化碰撞能量，35%;激活Q, 0.250;激活时间，10毫秒)，目标值为3000个离子。为了搜索原始文件，使用了来自Uniprot蛋白质序列数据库的SEQUEST引擎。gydF4y2Ba

交联和免疫沉淀(CLIP)分析gydF4y2Ba

HEK293T细胞转染表达mock或flag标记的DDX3X和circrg - i质粒。转染6小时后，更换培养基。用100 μM的4-硫脲啶(abcam, ab143718)处理细胞14小时后，在0.15 J/cm的冰面上进行紫外线交联gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在365纳米波长。随后收集细胞，用NP-40裂解缓冲液(50 mM HEPES, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5 mM DTT)裂解细胞。与anti-FLAG M2珠孵育后，结合组分与NT2缓冲液(50 mM HEPES, 150 mM KCl, 1 mM MgCl)混合gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 0.05% NP-40)含有SDS，蛋白酶K (Roche, 3115879001)和RNase抑制剂在56°C。用Trizol试剂分离RNA, real-time PCR分析。gydF4y2Ba

RNA下拉gydF4y2Ba

RNA下拉裂解缓冲液(20mm Tris-HCl (pH = 7.5)， 150 mM NaCl, 1mm EDTA, 0.5% NP-40)加蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂，裂解表达Mock和circrg - i细胞的HEK293T细胞。细胞裂解液用6 μg生物素标记探针在室温下孵育4小时。链霉亲和素琼脂糖珠经裂解液清洗，酵母tRNA (500 ng/μL)阻断。随后，将含有链霉亲和素琼脂糖珠的全细胞裂解液旋转1小时。结合组分经裂解缓冲液清洗3次，进行SDS-PAGE检测。gydF4y2Ba

体外RNA下拉gydF4y2Ba

生物素标记的小鼠WT或框架突变gydF4y2Barig - igydF4y2Ba通过T7 RNA聚合酶试剂盒(Promega, P2075)和Biotin RNA标记Mix (Roche, 11685597910)获得包括外显子3和内含子3在内的RNA。WTgydF4y2Barig - igydF4y2Ba以RNA反义序列为对照。标记RNA与过表达DHX9-FLAG的HEK293T细胞裂解液孵育，RNA结合蛋白由链霉亲和素琼脂糖珠分离(GE, 17-5113-01)。结合成分用生物素(T1116)洗脱，SDS-Page洗脱。gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

使用Prism GraphPad软件v7.0进行统计分析。使用双尾学生t检验计算两组之间的差异。采用Log-rank (mantle - cox)检验分析小鼠生存状况。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的。所有实验都独立重复了至少两次，得到了相似的结果。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba