介绍

移植物抗宿主病(GVHD)是指宿主的主要组织相容性复合体(MHC)激活移植物中的供体免疫细胞，从而对宿主组织和器官造成的免疫损伤。1，2．这是一种比典型排斥反应更强烈的排斥反应，破坏宿主的皮肤和粘膜屏障，导致严重感染，最终致命的感染性休克。从发病到死亡，病程可在两周以内3.．一般来说，GVHD可分为急性(aGVHD)和慢性(cGVHD)两种类型，这取决于疾病是在移植后第100天之前还是之后出现4．与接受造血干细胞移植(HSCT)患者aGVHD的高发生率(20-80%)相反5，6，实体器官移植(如肝移植)的发病率要低得多(0.1-2%)。7．然而，伴有aGVHD的LT患者的死亡率高达80-100%8，而移植受者在一年内的总体死亡率为9.4%9．在各种实体器官移植中，GVHD发病率低，死亡率高。然而，目前还缺乏理论来解释这一问题10．

20多年前，供体来源的T细胞被确定为GVHD的主要原因11．大量供体来源的T细胞的引入导致了HSCT患者GVHD的高发5，6而LT患者只接受了一小部分供体免疫细胞。当移植肝时，109−1010供者来源的免疫细胞被转移到受体体内，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和单核细胞12．在某些情况下，这些细胞可以在手术后3到100天在受体的外周血和骨髓中检测到，这与aGVHD的发病时间相匹配13．任何将存活的异基因淋巴细胞转移到受者体内的移植都有发生GVHD的潜在风险，例如输血相关的GVHD14，15．

aGVHD发展的关键过程是抗原提呈细胞(APC)与相应的宿主MHC或小组织相容性抗原(miH)肽激活供体来源T细胞上的T细胞受体(TCR)16．捐赠者CD8+单独的T细胞可以通过识别MHC类I分子的差异诱导GVHD，而CD4+T细胞通过识别MHC II类分子诱导GVHD10，17，18．T细胞是引起靶组织细胞死亡的主要效应因子，由各种细胞毒性作用介导10．作为一种致病性和嗜t细胞的人逆转录病毒，人t细胞嗜淋巴病毒I型(HTLV-1)可以感染CD4并使CD4细胞永生化+T细胞19，20.．在在猕猴、兔子和人化小鼠中建立的不同HTLV-1感染动物模型中，该病毒可导致致命的CD4+t细胞扩张21，22，23．值得注意的是，骨髓-肝脏-胸腺(BLT)小鼠模型容易发生aGVHD，这与血液中HTLV-1 RNA水平升高有关21．HLA匹配在HSCT前进行，以避免大量供体来源的T细胞攻击宿主，而HLA匹配在肝移植中不是强制性的。一般来说，即使HLA在供体和受体之间不匹配，在LT中供体淋巴细胞的比例也太小，无法诱导aGVHD。此外，HLA不匹配与LT结果或排异率无关24，25．在HSCT中，组织损伤和GVHD似乎是相互的因果关系26，27，28．然而，在lt中，没有常规化疗引起的组织损伤，触发和诱导供体来源的T细胞扩增以发展aGVHD的危险因素仍然未知，这是我们的重点。

在本研究中，我们假设病毒感染在LT中发挥了扩大供体来源的T细胞的作用，这可能被aGVHD过程中严重的真菌和细菌感染所掩盖。从2015年到2020年，在我们中心的3763例肝移植受者中，确定了7例aGVHD患者为DCD(循环性死亡后供体)受者。因此aGVHD的发生率为0.18%(7/ 3763)。为了揭示与发展aGVHD相关的隐源性感染，我们设计了一种针对8种非嗜肝病毒的鸡尾酒探针。结果，在所有7例aGVHD患者中均明确发现HTLV-1感染。此外，多重免疫组织学(IMC)结果证实了供体来源的CD4+T细胞因HTLV-1感染而增加。此外，大规模细胞术(CyTOF)和IMC结果的联合分析表明agvhd特异性Tax+CD68+APCs吸收HTLV-1并传递病毒和免疫信号。因此，我们的研究表明HTLV-1参与了aGVHD的整个过程。

结果

HTLV-1仅在肝移植后aGVHD患者中发现

为了揭示与aGVHD发展相关的隐基因感染，我们采用TargetSeq检测了aGVHD组的两名患者(ID139和ID141)和对照组的17名患者的样本中的病毒感染(图2)。1)．详细的患者信息和分组原则在方法和材料中描述(表S1)．在aGVHD组中，由于样本收集的限制，仅获得了两名患者的外周血、皮肤或肝脏活检组织(图2)。2)．同样，从对照组采集外周血和疾病相关病变组织标本，包括肝组织、感染部位组织和肝肿瘤肺转移灶(图2)。2和表S1)．TargetSeq使我们能够确定病毒(HHV-6A、HTLV-1、HTLV-2、HTLV-4、EBV、腺病毒、巨细胞病毒和细小病毒-1)的存在，特别是病毒是否处于潜伏感染阶段29．潜伏感染是指病毒DNA已经整合到宿主基因组中，病毒在人体内实现持续性和终生感染，并参与各种并发症的发病机制的一种方式30.．在aGVHD组和对照组中，HTLV-2和HTLV-4均未检测到，因此被排除在后续分析之外(图2)。2)．在所有aGVHD样本中检测到HHV-6A和HTLV-1，而在部分aGVHD样本中检测到EBV和腺病毒(图2)。2)．在139例患者的肝活检组织和皮肤组织中均发现HTLV-1、HHV-6A和腺病毒的病毒宿主基因整合，而EBV仅在肝活检组织中存在整合。同时，仅在141例患者的肝活检组织中检测到HTLV-1、HHV-6A和EBV的病毒宿主基因整合(图2)。2 a, B)．通过Fisher精确检验比较各组间病毒的存在，并采用Benjamini-Hochberg校正(图2)。2摄氏度)．与对照组相比，aGVHD组HTLV-1阳性患者的百分比显著升高(经调整后)p值= 0.0406)(图2摄氏度)．在aGVHD样品中均未检测到细小病毒1和巨细胞病毒。此外，在对照组患者的外周血或组织样本中未检测到HTLV-1，这与aGVHD组相比，该病毒在所有样本中均被检测到(图2)。2a c d)．虽然在aGVHD组的所有样本中都检测到HHV-6A，但在对照组中也存在HHV-6A。aGVHD组与对照组之间HHV-6A感染率无明显差异(图2)。2, C)．因此，这些结果初步提示了HTLV-1感染与aGVHD发生的相关性。此外，一些病毒在组织感染患者的外周血中未被检测到，这表明同时对组织和外周血进行病毒筛查可能更可靠(图2)。二维)．

图1:实验设计示意图。
图1

一个aGVHD组37例患者标本中检测到多种病毒DNA和RNA序列(N= 2)，对照组(N= 17)。测试样本包括皮疹皮肤、外周血、肝移植、肠、心室壁和肺。B对来自aGVHD组患者的总共16个外周血单个核细胞(pbmc)样本进行了CyTOF检查(N= 3)，对照组(N= 10)。CaGVHD组患者的福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)样本17份(N= 7)，包括7个皮肤组织，5个天然肝组织，3个移植肝组织，2个骨髓组织。

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图2:多种病毒cDNA探针检测表明，HTLV-1只存在于aGVHD患者的所有外周血和组织中。
图2

一个热图描述了来自aGVHD组的2名患者和对照组的17名患者的每个样本中病毒或病毒/宿主整合的检测情况。阴性、阳性和宿主整合结果分别标记为蓝色、黄色和红色。B统计病毒感染病例数和宿主整合数。C计算并比较aGVHD组(N= 2)，对照组(N= 17)。所有p数值采用Fisher精确检验计算，并采用Benjamini-Hochberg校正。*p= 0.0406。D在外周血或组织样本中检测到病毒的患者百分比。E热图描述了验证队列中400例患者的基本临床信息，包括年龄、体重指数(BMI)、样本收集时间、术前诊断和伴随疾病。两名HTLV-1感染患者用红色箭头标记，并标注病毒载量。(良性ESLD:良性终末期肝病，恶性LD:恶性肝病，肝移植术后并发症，NC:无伴发疾病。)

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为了进一步调查HTLV-1在我们中心的流行情况，验证我们关于HTLV-1感染和aGVHD过程的假设，我们对400例患者进行了独立队列研究，包括肝手术患者、肝移植受者和肝移植供体(表2)S2)，于2021年1月至2021年6月进行RT-PCR检测HTLV-1感染。共有2例患者HTLV-1阳性，其中1例为移植供体，1例为肝部分切除术后患者(图2)。2 e)．值得注意的是，HTLV-1阳性供体的受体没有感染，因为供体的病毒载量低于可引起病毒感染的最低负荷(9 × 104）31．另1例htlv -1阳性合并丙型肝炎患者因急性肝衰竭术后2天死亡。在该队列的400例患者中，没有人被诊断为aGVHD，也没有HTLV-1阳性受体。因此，我中心无aGVHD患者HTLV-1患病率为0.5%，95%置信区间为[0.01%，1.93%]，与报道的0.1% ~ 1%的患病率相吻合32．考虑到这一点，这两种罕见疾病同时出现是巧合的可能性小于10−4使用二项概率计算，提示HTLV-1感染应与LT后aGHVD发展密切相关。

agvhd特异性循环免疫细胞(Tax+CD68+)在外周血中发现APCs特征

由于HTLV-1与aGVHD之间的关系在统计学上得到了支持，因此我们进行了一系列探索性实验，以进一步揭示其潜在的生物学机制。采用大规模细胞术(CyTOF)对来自aGVHD的pmcs进行系统和深入的表型分析(N= 3)和控制(N= 10)患者(图;1 b)．在两个不同的时间点从aGVHD患者和一次对照组患者中收集样本。CyTOF面板，包括31个金属同位素标记的抗体(表S4)，旨在获得外周血中白细胞的整体概况。该小组包含30个谱系标记，用于区分显著的白细胞亚群和一个标记，用于在细胞水平上追踪HTLV-1感染。主要是一种针对Tax蛋白的金属标记抗体，一种HTLV-1特异性RNA转录增强剂33，34，也被列入了讨论小组。为了表征免疫细胞亚群的表型，采用t分布随机邻居包埋分析在Cytofkit中生成二维图谱35．每个样品至少5 × 103.白细胞(CD45+细胞)进行后续数据分析(图;S1)．结果显示，6个aGVHD样本中Tax蛋白信号均为阳性，而对照组10个样本中Tax蛋白信号均为阴性。信号强度的正负比高达50(图。3)．

图3:流转税+CD68+aGVHD外周血中可见明显的免疫细胞，以DC细胞和单核细胞为主。
图3

一个这两个直方图显示了CD45中htlv -1特异性Tax信号的强度+数量(图。S1)两组PBMC样本。在aGVHD组中，在发病至死亡之间的T1和T2两个时间点收集3例aGVHD患者的pbmc。对照组10例患者接受肝移植，并在术后并发症发生的一个时间点采集其pbmc。aGVHD患者的pbmc显示高水平的HTLV-1 Tax表达。B对CD45进行t-SNE降维+细胞探索患者间的异质性。色标表示Tax的arcsin变换信号强度。通过手动门控(红圈)标记具有积极Tax表达式的集群，主要出现在aGVHD组中。C表型图和t-SNE描述了30个自动识别的聚类结果。aGVHD组显示与对照组不同的集群分布。税收+亚种群用空心红圈标记(表S6)．D热图描绘了七税细胞标记物的中位表达+亚种。的HLA-DR+亚种群由一个中空的红色矩形标记。颜色条表示蛋白质的arcsin变换信号强度。E百分比的七税+CD45亚群+比较aGVHD组和对照组的细胞。税+以aGVHD组为主。(中间单核细胞:iMo;非经典单核细胞:ncMo;常规树突状细胞:cDC;CD8+T细胞)。

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在无花果。3 b，每个点代表一个细胞，颜色表示Tax蛋白的表达水平。aGVHD组和对照组之间免疫细胞的空间分布不同，提示这些患者的免疫反应不同(图。3 b)．然后，我们根据表面标记物的表达与表型将免疫细胞聚成30个簇35(无花果。3 c)．aGVHD组和对照组之间的主要不同聚类是Tax+CD68+集群(图。3 b而且S2)．根据TargetSeq的结果，HTLV-1感染应该与LT、Tax后aGHVD的发展密切相关+仅在aGVHD组的22-26 #和29-30#细胞中检测到细胞。3 b, C)．Tax的细胞表型+集群在表中列出S6．簇23#、25#、29#和30#被分类为CD3−CD19−CD11c+CD123−细胞。其中Cluster 29#为HLA-DR+细胞，可以定义为传统的树突状细胞(cDC细胞)。树突状细胞(DC)，构成单核吞噬细胞系统(MPS)，被认为是最有效的apc36．因为CD68是人类单核细胞和巨噬细胞的选择性标记物，簇22#，23#和30# (CD3−CD19−CD14−CD16+HLA-DR−CD68+)被认为是非经典单核细胞37．25#簇为中间单核细胞(CD3−CD19−CD14+CD11c+CD16+CD68+)．簇24# (CD3−CD19−CD14−CD16−CD11c−CD123−HLA-DR−CD68+)表达CD38等活化标记38和CD6939这表明这些细胞被高度激活。同时，星团26# (CD19 .−CD14−CD3+CD8+税+)的特征是税务+CD8+T细胞(图;3 c, D,而且S2)．表型从aGVHD组聚集到7 Tax的细胞数量是对照组的10到100倍+集群(图。3 e)．22#， 26#和29-30 #簇的百分比超过5%，在aGVHD样本的白细胞中占据较高比例。长期以来，树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞一直被认为是循环和组织中的抗原提呈细胞40，41，42．APC与抗原反应，向CD4呈递MHC II沟槽结合肽+T细胞拥有相同的等位基因，引发免疫反应43．我们的CyTOF结果显示agvhd特异性免疫细胞亚群，尤其是Tax+CD68+装甲运兵车。

“三阳性T细胞”证实为皮肤切片供体来源的T细胞

下面对税收进行分析+免疫细胞亚群在外周血中的分布，进一步应用IMC研究Tax的空间分布+免疫细胞是aGVHD的靶器官之一(图2)。1 c)．设计了一个由19个金属同位素标记抗体组成的IMC面板，以获得皮肤病变中免疫细胞的整体概况，并揭示HTLV-1与免疫细胞之间的相互作用(表2)S5)．该小组包含两个结构蛋白标记物，13个免疫细胞标记物，一个HTLV-1特异性标记物(Tax蛋白)和一个Y染色体标记物，用于跟踪细胞来源。对aGVHD组所有7例患者的皮损进行IMC。其中4例女性患者(ID139、ID141、ID143、ID144)接受男性供体肝脏。因此，由位于Y染色体上的相应基因表达的真核翻译起始因子1AY -linked (EIF1AY)被靶向用于跟踪女性受体样本中供体来源的细胞44．EIF1AY信号显示在女性样本上(图2)。4模拟)，但对男性样本没有影响(图。4种情况)．此外，我们还对2例aGVHD患者(ID144和ID145)和2例对照组的血清进行了ELISA检测，aGVHD患者的HTLV-1抗体滴度比对照组高30 ~ 100倍(图2)。S3)．

图4:IMC检测到aGVHD皮肤组织中HTLV-1特异性Tax蛋白。
图4

来自7例aGVHD患者的两个独立染色皮肤组织的代表性IMC图像显示，Tax(红色)、DNA(蓝色)和不同的免疫反应标记物重叠。每列显示的通道为:一个税收(红色)/DNA(蓝色);BCD4(绿色)/Tax(红色)/EIF1AY(白色)/DNA(蓝色);CC4d(绿色)/Tax(红色)/EIF1AY(白色)/DNA(蓝色);DCD68(绿色)/Tax(红色)/EIF1AY(白色)/DNA(蓝色)。E税收(红色)/DNA(蓝色);FCD4(绿色)/Tax(红色)/DNA(蓝色);GC4d(绿色)/Tax(红色)/DNA(蓝色);HCD68(绿色)/Tax(红色)/DNA(蓝色)。红色箭头指示多重信号重叠位置，红色方框显示放大的CD4+带有Tax信号的T细胞。景观视图比例尺= 100 μm，放大视图比例尺= 20 μm。

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皮肤组织切片中各种免疫细胞与HTLV-1的相互作用如图所示。4．感兴趣区域(ROI)定义为光学显微镜下选择的表皮-真皮交界处淋巴细胞丰富的区域。在aGVHD组每个患者的标本切片中，在细胞核、细胞质和细胞外空间(分泌蛋白)检测到Tax蛋白信号，证实HTLV-1病毒蛋白存在于目标器官，包括皮肤和肝脏。此外，图。4 bCD4、EIF1AY和Tax蛋白信号叠加。在女性受者的所有皮肤切片中都可以发现三重重叠信号(图2)。4罪犯)．税收+CD4+细胞也表达CD3，所以Tax+CD4+细胞被定义为CD4+T细胞(图;S4，S5)．CD4、EIF1AY、Tax蛋白信号叠加显示aGVHD的效应T细胞为“三阳性T细胞”，为供体来源和htlv -1感染CD4+T细胞。无花果。4 c、G在浸润皮损的免疫细胞中显示大量C4d表达，并显示Tax和C4d蛋白共表达。C4d由抗原-抗体反应激活，是器官移植后抗体介导的体液排斥反应的重要标志物，也有报道在GVHD发生后出现45，46，47．这可能是aGVHD进展过程中病毒感染和免疫排斥相互作用的标志48．另外，图中CD68、Tax、EIF1AY的重叠信号。4 d H提示存在供体来源的apc，这与已发表的文献一致49，50，51．此外，我们的结果表明，在CD8中没有检测到Tax的表达+皮肤中的T细胞或B细胞(图。S6)．12个谱系标记的单信号图像如图所示。S4，S5，S7,S8．因此，通过标记EIF1AY和Tax, IMC结果再现了HTLV-1与其他免疫细胞，特别是供体来源细胞在aGVHD发病过程中的相互作用。

为了充分展示发现队列中多种方法评估的HTLV-1检测结果，表中列出了HTLV-1的阳性率和特异性检测信息1和表S1．通过跟踪临床记录，我们整合了发现队列中所有24例患者的HHV-6A、EBV、腺病毒、巨细胞病毒和细小病毒-1的PCR检测结果，并对两组进行统计学分析(表2)1)．经Fisher精确检验，并经Benjamini-Hochberg校正，对照组与aGVHD组HTLV-1检测阳性率差异有统计学意义(调整后)p值< 0.0001)。四种方法交叉验证了所有且只有7例aGVHD患者感染了HTLV-1。

表1病毒检测结果汇总及联合分析
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CD68+aGVHD患者皮肤切片中单核吞噬细胞亚群

税后认定+CD68+通过IMC检测所有aGVHD患者皮肤病变部位APCs的特征，进一步揭示htlv1感染在aGVHD中的作用。皮肤中的主要apc是组织单核吞噬细胞(MNP)亚群，这是两个突出的家族，dc和组织巨噬细胞40．DC又分为常规DC (cDC)和浆细胞样DC (pDC)。cdc、pDCs、单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)和组织驻留巨噬细胞分别表达CD11c+HLA-DR+CD68+, CD123+HLA-DR+CD68+, CD14+CD11c−CD68+，和CD14-CD11c−CD68+细胞52，53．IMC在皮损中发现的四种MNPs的表型和分布由三位具有代表性的患者(ID139, ID140和ID145，图。5 a - c)．7例GVHD患者的HLA-DR、CD14、CD123、CD68、CD11c单色图像显示核信号如图所示。S7而且S8．DNA、HLA-DR、CD14、CD123、CD68、CD11c的信号及其合并面板如图所示。5 a - c．7例aGVHD患者的MNP表型总结见图。5 d．7例aGVHD患者皮肤切片中均存在巨噬细胞，4例患者(ID139、ID141、ID 142、ID144)存在MDMs, 2例患者(ID140、ID143)皮肤切片中仅存在cdc和pDCs。此外，一些MNPs表达Tax蛋白(图2)。4 d H)，这表明它们吸收了HTLV-1，并向外传播病毒和信号。可见aGVHD患者中发现的MNP细胞种类繁多，主要为dc和巨噬细胞，部分为Tax细胞+CD68+与外周血中agvhd特异性细胞亚群一致。皮肤切片的IMC结果再现了抗原提呈反应，并显示了先前在外周血中检测到的、可能迁移到组织中的apc。

图5:CD68+aGVHD患者皮肤切片中的单核吞噬细胞(MNP)。
图5

来自3名aGVHD患者(ID139、140和145)的两个独立染色皮肤组织的代表性IMC图像显示了7个单一信号一个DNA(蓝色)，HLA-DR(红色)，CD11c(紫色)，CD14(黄色)，BCD123(浅蓝色)，CD68(绿色)。C七个标记叠加信号。在每一列的图像中显示相同的标记。红色、黄色、绿色和蓝色箭头分别指向单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞(pDC)和常规树突状细胞(cDC)。红色、黄色、绿色、蓝色框分别为MDMs、巨噬细胞、pDC、cDC的放大多信号重叠位置。景观视图比例尺= 100 μm，放大视图比例尺= 20 μm。D每一列为每位患者皮肤切片中的单核吞噬细胞(MNP)鉴定。每一行是一个MNP的综合表型，符号+/−表示该MNP在每个患者的皮肤切片中存在/不存在。每一行显示的通道为:巨噬细胞(CD14−CD11c−CD68+);MDM (CD14+CD11c−CD68+);疾病预防控制中心(CD11c+HLA-DR+CD68+);pDC (CD123+HLA-DR+CD68+)．

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肝脏切片中的HTLV-1特异性信号表明HTLV-1要么是供体来源的，要么是受体预先存在的

为了追踪HTLV-1的来源，我们进一步通过IMC检测移植肝和受者自身肝脏中Tax蛋白的表达。在接受男性捐赠者器官(ID139)的女性患者的肝活检(肝移植)中，在CD68中检测到Tax蛋白+EIF1AY+细胞，这证实了供者来源的HTLV-1感染从肝移植(图;6，4 d而且S9)．在原生肝脏(ID139、ID144和ID145)中，在CD68上检测到Tax蛋白+细胞在原生肝脏部分，表明在这些患者中存在预先存在的HTLV-1感染(图。6)．对于ID140和ID141患者，肝移植上Tax蛋白信号呈阳性(图14)。6)，但在原生肝脏上呈阴性(图。6 b)，提示手术后感染HTLV-1，可能是供体来源。在骨髓切片或其他肝组织中未发现HTLV-1感染。6 b)．这些结果初步揭示了病毒感染途径，无论是供体来源或受体预先存在。

图6:IMC检测aGVHD患者移植肝、原生肝和骨髓样本中htlv1特异性Tax蛋白。
图6

一个代表税收+两个独立染色的移植肝和天然肝的图像显示两种重叠模式。每一行数字显示相同的组织类型。肝移植标本显示通道从左到右依次为:CD68(绿色)/Tax(红色)/EIF1AY(白色)/DNA(蓝色)，CD68(绿色)/Tax(红色)/DNA(蓝色)，CD68(绿色)/Tax(红色)/EIF1AY(白色)/DNA(蓝色)。天然肝脏样本显示的通道为CD68(绿色)/Tax(红色)/DNA(蓝色)。红色箭头指向多信号重叠位置。B代表税收−两个独立染色的骨髓和原生肝脏的IMC图像显示Tax(红色)和DNA(蓝色)重叠。比例尺分别为50 μm和100 μm，如图所示。

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讨论

在本研究中，我们通过预先合成的TargetSeq、CyTOF和IMC，从所有agvhd诊断患者的外周血样本、新鲜组织切片、福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织切片中检测htlv1 cDNA和htlv1特异性Tax蛋白。HTLV-1感染与aGVHD发生之间的关联已通过统计分析确定。此外，CyTOF发现了agvhd特异性循环税+CD68+免疫细胞，包括单核细胞和树突状细胞。综合分析CyTOF和IMC结果，重现了lt后aGVHD期间的抗原呈递反应。皮肤中部分MNPs(主要是DCs、MDMs和巨噬细胞)共表达Tax和CD68蛋白。它解释了APCs从外周血迁移到皮肤损伤，在此过程中，它们携带HTLV-1并传递病毒和免疫信号。最重要的是，我们通过IMC发现了致病的宿主靶向T细胞，即“三阳性T细胞”。我们的结果证实了供体来源CD4的存在+这些发现将aGVHD的发生与病毒感染联系起来，为aGVHD的防治提供了新的视角。

HTLV-1是一种类似于HIV的高致病性病毒，但由于其地理分布和潜伏期长，HTLV-1没有得到足够的重视20.．与HIV引起T细胞死亡相反，HTLV-1可以有效地感染T细胞，维持它们的生长，并通过Tax蛋白诱导的kappa b特异性蛋白使它们永生19，20.．HTLV-1 Tax蛋白的表达诱导T细胞促进因子IL-2、IL-4、IL-6、T细胞端粒酶、Tax/rex mRNA的表达增强，T细胞凋亡因子Bim(促凋亡蛋白)的表达降低，导致T细胞过度增殖(一般为CD4)+以及IL-2R和IL-2基因的无限表达19，20.．HTLV-1感染引起的T细胞无限增殖作用于人体免疫系统，成为排斥反应的增强剂54，55．因此，HTLV-1病毒感染可能会扩大T细胞，可能对宿主和供体都是如此，导致宿主对移植物和移植物对宿主排斥的潜在趋势。

HTLV-1感染的确认和预防取决于移植的围手术期准备。当含有原病毒的细胞数量超过9 × 10时，就会发生病毒感染431．由于HTLV-1的低感染率和地域限制，许多移植中心没有常规筛查HTLV-1，导致忽视了病毒感染。在我们的研究中，无论HTLV-1感染源(供体来源、既往病史或输血)如何，供体T细胞都会扩增。致命的CD4+T细胞的扩增被认为是aGVHD发生和发展的基础。因此，我们的数据表明，捐赠者、受者和血液供应源应在手术前进行严格的HTLV-1感染检测，以防止器官受者中T细胞的无序增殖。本研究初步揭示了肝移植后aGVHD患者HTLV-1病毒感染的特异性，因此更广泛的多中心研究HTLV-1与aGVHD之间的关系将是有益的。简化HTLV-1感染的诊断策略和抗逆转录病毒治疗将对lt后aGVHD的预防和治疗发挥积极作用。同时，它解释了人类各种病毒危害之一，并呼吁对病毒相关淋巴细胞疾病进行更多的研究。

方法

伦理、分组原则和人体样本采集

本研究由上海交通大学医学院仁济医院伦理审查委员会批准(临床试验注册号:KY2019074)。所有患者样本均在IRB监督下知情同意获得。

将DCD接受者分为aGVHD组和对照组。aGVHD组由7名在2015年至2020年期间被诊断为aGVHD的患者组成。对照组由17名受者组成，包括移植后排斥反应患者(N= 4)、移植后感染患者(N= 3)，移植后正常恢复受者(N= 4)、术前患者(N= 6)。对于aGVHD、移植后排斥反应或移植后感染的患者，在疾病进展期间收集样本。术前采集术前对照患者标本。本研究评估的患者id、临床信息和分组列在表中S1．在2021年1月至2021年6月期间招募了400例独立队列患者，包括肝脏手术患者、受体和肝移植捐赠者(表2)S2)．

对于TargetSeq检测，从aGVHD组的2例患者(ID139和ID141)和对照组的17例患者中收集新鲜样本，包括受皮疹影响的皮肤、外周血以及肝脏、肠、心室壁和肺的活检组织(表1)S1)．

为了进行CyTOF和后续分析，我们从3名aGVHD患者(ID139, ID 140和ID 141)和对照组的10名患者(包括移植后排斥反应患者(N= 4)、移植后感染患者(N= 3)，以及移植后正常康复患者(N= 3)。aGVHD组在发病和死亡之间的两个不同时间点收集pbmc。对照组只收集一次pbmc。

IMC的标本是来自7例aGVHD患者的天然肝脏、皮损、肝活检(移植组织)和骨髓的FFPE切片(表2)S1)．自体肝脏的FFPE切片是在移植手术期间收集的，其他标本是在aGVHD进展期间收集的。

TargetSeq非嗜肝病毒的检测

新鲜样本(N= 37)来自aGVHD患者和对照组患者，包括皮肤病变、外周血以及肝脏、肠道、心室壁和肺的活检组织(表S1)．RNA由Pre-NAT全自动系统(PerkinElmer, Massachusetts, USA)提取。靶向非嗜肝病毒的捕获探针(TargetSeq, iGeneTech, Beijing, China)是基于液相芯片的RNA探针(图2)。1)．靶向病毒包括人类疱疹病毒6a (HHV-6A)、eb病毒(EBV)、腺病毒、细小病毒-1、巨细胞病毒(CMV)、HTLV-1、HTLV-2和HTLV-4。根据从NCBI GenBank数据库中获得的每个病毒的全基因组序列，设计探针板用于靶区测序(表2)S3)．对于RNA病毒，以逆转录合成的cDNA为模板设计探针。TargetSeq能够捕获目标病毒的全长序列和相应的基因组整合区域。

RT-PCR检测HTLV-1

采用Pre-NAT全自动系统(PerkinElmer, Massachusetts, USA)采集外周血，提取RNA。HTLV-1 RNA检测采用人t细胞淋巴瘤病毒1型(HTLV-1)探针qRT-PCR试剂盒(亚吉生物，中国上海)，按照试剂盒说明书在ABI 7500实时PCR系统(赛默飞世尔科技，美国加州)中进行。每个反应混合液中含有10 μL缓冲液、2 μL酶混合液、2 μL正反引物混合液、1uL探针溶液和5 μL标本。热循环参数为:50℃逆转录30 min, 94℃预变性10 min, 94℃15 s, 60℃1 min，循环40次。

抗体制备

本研究中使用的抗体及相应的生产商和浓度列于表中S4和表S5．金属偶联抗体购买或使用Maxpar ×10抗体标记试剂盒制备(Fluidigm Sciences, San Francisco, USA)。偶联后，将抗体储存在Candor PBS抗体稳定液(Candor Bioscience, Wangen, Germany)中4℃。

用于大规模细胞术检测的pmcs的制备和染色

用Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, Piscataway, USA)进行密度梯度离心分离pbmc(图2)。1 b)．淋巴细胞提取后，用顺铂(5 μM)悬浮液处理细胞，用多聚甲醛(PFA;终浓度1.6%)。细胞用30种抗表面蛋白的金属同位素偶联抗体鸡尾酒染色S4)．表面蛋白染色后，用转录因子渗透试剂盒(eBioscience, Santiago, USA)处理细胞，然后在室温下用抗tax抗体染色30分钟(表2)S4)．细胞核用1:4000稀释后的1ml染色191红外/193Ir DNA插入器(Fluidigm Sciences，旧金山，美国)与Maxpar Perm-S Buffer (Fluidigm Sciences，旧金山，美国)在4°C过夜。

用于IMC检测的aGVHD组织切片的制备

组织切片取自仁济医院的宿主肝脏、皮肤、骨髓活检和移植肝活检的FFPE组织块(图2)。1 c)．组织载玻片在二甲苯(Adamas-beta，上海，中国)中脱蜡，并在分级乙醇(Adamas-beta，上海，中国)系列中再水化。然后，将它们在95°C的预热回收溶液(R&D Systems, Boston, USA)中孵育30分钟，冷却至室温。然后用3% BSA (Macklin, Shanghai, China)在DPBS (Gibco, San Francisco, USA)中在室温下阻塞组织切片45分钟。抗原提取后，用含有19个金属同位素标记抗体的抗体鸡尾酒培养组织载玻片(表2)S5)针对免疫细胞标记物和Tax，在4°C的湿润室中过夜。对于核染色，每个切片在室温下用100µL 1:60稀释染色30分钟191红外/193Ir DNA插入器(Fluidigm Sciences, San Francisco, USA)与DPBS。

海量细胞仪检测及后续分析

在Helios (Fluidigm, San Francisco, USA)上采集数据后，用4个标准EQ珠进行归一化(图2)。1 b)．在CytoBank在线平台(www.cytobank.org)．用一系列门选择单细胞和CD45+如图所示。S1．设置降维参数，利用R包Cytofkit应用表型图进行降维35．为了减小测量中的噪声，我们选择了尺度因子为5的ArcSinh变换作为变换方法。

IMC检测及后续分析

使用Hyperion激光扫描模块(Fluidigm, San Francisco, USA)与Helios细胞仪耦合获得图像(图2)。1 c)．Fluidigm的CyTOF v6.7软件生成a.m mcd文件和a.txt文件。使用MCD Viewer v1.0软件进行图像处理和可视化。

ELISA的文章

在诊断aGVHD后采集患者(ID:144和145)血清样本。血液样本离心5分钟，分离血清。血清保存于-80℃。所有样品均采用HTLV-I ELISA试剂盒(KNUDI，中国泉州)进行检测。所有操作均按照试剂盒说明书进行，并使用微量滴度板阅读器(BioTek, Winooski, USA)在450nm处测量光密度。

统计分析

采用Fisher精确检验检验组间HTLV-1阳性率的差异，采用Benjamini-Hochberg调整控制假发现率。的调整p值<0.05为有统计学意义。在无花果。S3，采用Mann-Whitney检验计算组间HTLV-1阳性率的差异。

报告总结

有关研究设计的进一步资料，请参阅自然组合报告摘要链接到这篇文章。