抗逆转录病毒APOBEC3胞苷脱氨酶改变HIV-1前病毒整合位点谱gydF4y2Ba

人类A3家族由7个成员组成，其中5个已经证明了抗HIV-1的生物相关抗病毒活性:APOBEC3D (A3D)， APOBEC3F (A3F)， APOBEC3G (A3G)，某些单倍型的APOBEC3H (A3H)，和一个多态变体的APOBE3C (A3C)。gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．当HIV-1感染一个新的CD4+单核细胞或淋巴细胞时，A3蛋白与病毒蛋白和RNA结合，导致它们被包裹在新生的排出病毒粒子中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．病毒粒子包装的A3在逆转录过程中主要通过脱氨胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，即单链病毒DNA (vDNA)复制中间体，在靶细胞中发挥其抗逆转录病毒活性gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

在感染早期观察到非常高水平的脱氨，称为高突变，可彻底灭活病毒gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．然而，HIV-1可以通过增加病毒感染因子(Vif)的表达来克服A3蛋白的影响，Vif结合并诱导五种抗HIV-1 A3蛋白的多泛素化，从而通过蛋白酶体降解来协调它们的渐进性消耗gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}．因此，新生排出的病毒粒子包裹数量减少的A3蛋白，直到蛋白被Vif从细胞质中清除gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．这些病毒缺乏A3，甚至限制因子蛋白水平高度降低，可以自由感染新的细胞，帮助快速传播感染。保持低比率的A3突变或低突变，被认为是HIV-1基因进化的重要贡献者gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

A3蛋白还可以通过脱氨作用以外的机制限制HIV-1的复制(例如，与病毒RNA或病毒逆转录酶(RT)结合，减少vDNA合成)。gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．先前研究表明，A3G和A3F可以与病毒整合酶(IN)和RT相互作用，但这种结合在病毒整合中的作用尚不清楚gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．更重要的是，研究表明A3F和A3G蛋白可以通过修改或改变病毒长端重复序列(LTR)末端的充分处理来降低病毒的整合效率gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}．目前尚不清楚这可能如何影响HIV-1前病毒整合位点的选择。gydF4y2Ba

在合成前病毒DNA时，由病毒和宿主蛋白质(如A3)组成的预整合复合物(PIC)易位到细胞核，为整合做准备gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}．前病毒DNA整合到开放染色质涉及宿主晶状体上皮衍生生长因子(LEDGF/p75)结合到病毒IN和多聚腺苷酸特异性因子6 (CPSF6)在LTR末端(即肠道)。gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}．这种HIV-1肠道有利于与组蛋白、活性转录单位、高G/C含量区域、高基因密度、高CpG岛密度、高频率短点缀核元件(SINEs)(如Alu重复序列)、表观遗传修饰和特定核区域(如靠近核孔复合体)相关的染色质的整合gydF4y2Ba^{32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}．此外，非b DNA结构可能会影响HIV-1整合位点的靶向gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．至少存在10种非b DNA构象，包括a相基序、倒置重复序列、直接重复序列、十字形DNA、鸟嘌呤四重体(G4) DNA、滑动DNA、镜像重复序列、短串联重复序列、三重体重复序列和Z-DNAgydF4y2Ba^{37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

A3蛋白主要在逆转录过程中通过脱氨依赖和独立机制来限制HIV-1, A3F和较小程度的A3G在PIC进入细胞核时仍然与PIC相关gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．在本研究中，我们研究了A3蛋白对HIV-1整合位点选择的影响。我们发现A3F和A3G都对整合位点的选择有重要影响，A3脱氨酶依赖和-独立活动都有助于这种影响。gydF4y2Ba

A3F和A3G以剂量依赖的方式强烈抑制HIV-1感染和整合gydF4y2Ba

通过转染293 T细胞，我们产生了HIV-1 (NL4-3)gydF4y2Ba_{ΔVif /ΔEnv-eGFPgydF4y2Ba})用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)进行假分型，同时存在野生型(wt)或脱氨缺陷突变型A3F [E251A]和A3G [E259A]。我们还包括A3G核酸结合缺陷突变体A3G [W94A]和A3G [W127A]。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．在非催化的A3G n端结构域内，W94是SgydF4y2BaWgydF4y2BaSPCxxC锌配合基序，而W127在ARLYYF内gydF4y2BaWgydF4y2Ba．这些色氨酸残基对于一般核酸结合能力、底物序列识别和蛋白质低聚化是重要的gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}．虽然W94A和W127A突变都减少了RNA结合，但W127A的取代是独特的，因为它阻止了A3G的同型二聚，从而降低了加工能力gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．这突出了二聚化对ssDNA存在下A3G催化活性功能的重要性gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．每个A3产生的等量病毒被用于感染许可人t4淋巴母细胞样细胞系CEM-SS。感染后48小时，通过流式细胞术检测CEM-SS细胞的生产性感染，采用病毒编码的eGFP报告基因表达(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．或者，收集感染细胞进行基因组DNA (gDNA)提取，以量化前病毒整合水平和整合位点的下游分析。除了在增加A3蛋白的情况下产生病毒外，还使用了三种不同数量的输入病毒进行感染(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba，gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．增加用于病毒生产的A3质粒的数量对HIV-1颗粒释放有显著影响(图2)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在野生型(wt) A3F中观察到HIV-1的有效限制，在野生型A3G中更明显(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba，gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．催化无活性的A3F [E251A]和A3G [E259A]均表现出明显较小的限制。我们的小组之前已经确定A3G [W94A]和A3G [W127A]各自的限制能力减弱，但仍然能够进行病毒DNA编辑gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．这些突变体对整体感染和整合效率的影响很小(图2)。gydF4y2Ba1 b, CgydF4y2Ba)．此外，正如预期的那样，A3F和A3G的抑制水平取决于病毒生产过程中A3蛋白的表达量(图2)。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

鉴于A3具有多种编辑依赖和独立的限制机制，生产性感染与前病毒整合的总体水平相关。我们用Alu-PCR和ddPCR检测HIV-1前病毒DNA的相对整合拷贝数，在一个实验中以HIV-1 LTR为目标，在另一个实验中以报告基因eGFP作为对照，输入细胞DNA归一化为扩增的肌动蛋白DNA(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba，gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．整合水平与感染水平密切相关，除了wt A3G和A3F蛋白表现出比整合更明显的感染限制。这并不奇怪，因为eGFP报告基因的表达和荧光依赖于其编码序列的遗传完整性，而该编码序列经常因A3F和A3G超突变而失活gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

A3F和A3G与病毒Gag和IN相互作用gydF4y2Ba

一些报道表明，A3F和A3G以依赖rna的方式与HIV-1 Gag和IN相互作用，它们都是PIC的组成部分gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba}．然而，与失活脱氨酶和缺陷核酸结合特性的A3变异体的结合此前尚未平行评估。在本研究中，确定各种A3蛋白是否能直接或间接与IN相互作用至关重要，因为这种相互作用可能对PIC的形成和整合位点的选择至关重要。为了描述HIV-1 IN和Gag与各种A3蛋白的相互作用，用flag标记的A3变异体或HIV-1转染的细胞裂解液共孵育，然后使用anti-FLAG共免疫沉淀，并使用anti-IN和anti-p24CA进行Western blotting分析。如图所示。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba，所有A3蛋白，包括脱氨酶非活性和核酸结合突变体与IN和Gag共免疫沉淀的效率相似，表明与A3直接或间接(即通过蛋白质复合物)相互作用。gydF4y2Ba

A3F和A3G改变HIV-1整合位点的基因组特征gydF4y2Ba

为了鉴定HIV-1整合位点，我们扩增了从感染HIV-1的细胞中分离出来的基因组DNA (gDNA)中的整合位点，这些细胞存在各种A3蛋白。如前所述，使用Barr实验室集成站点管道(BLISIP)生成集成站点概要gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}．BLISIP测量整合位点富集在和附近的基因组特征，如CpG岛，DNAseI超敏位点(DHS)，内源性逆转录病毒，异色DNA区域(例如，椎板相关结构域(LADs)和卫星DNA)， sin，长点缀核元件(LINEs)，低复杂性重复序列(LCRs)，癌基因，基因，简单重复序列和转录起始位点(TSS)。此外，BLISIP测量非b DNA中及其附近的富集特征，包括a相基序、十字基序、直接重复序列、G4重复序列、倒置重复序列、镜像重复序列、短串联重复序列、滑动基序、三联体基序和Z-DNA基序。gydF4y2Ba

与不含A3F或A3G的病毒相比，感染含有A3F或A3G的病毒的靶细胞在SINEs内和附近的整合显著增加(分别为39%和42%)，而不含A3F或A3G的病毒为17%;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)(图gydF4y2Ba2 a, BgydF4y2Ba、补充数据文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与没有A3的对照相比，A3F和A3G的整合也显著富集了邻近的简单重复序列(1-500个核苷酸)(分别为26%和35%);gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。此外，与无A3对照组相比，与A3F和A3G的整合在ERVs、LADs、癌基因和LCRs中及附近略有增加。值得注意的是，与没有A3对照相比，存在A3F和A3G的基因整合显著降低(分别为63%和60%)，而不是75%;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)。相比之下，46%的整合位点随机出现在基因中(补充数据文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．DHS和LINEs的整合程度也有所下降。gydF4y2Ba

使用缺乏脱氨酶活性的A3F和A3G突变体，SINEs的整合显著增加，而基因的整合显著减少，但与野生型突变体观察到的程度不同。与wt类似，与A3F [E251A]和A3G [E259A]的整合在ERVs、LADs和癌基因中或附近适度增加(图2)。gydF4y2Ba2 a, BgydF4y2Ba、补充数据文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．为了比较不同A3结构之间整合位点概况的总体相似性，我们对整合位点概况进行了两两分析，基于“在”、“1-499 bp”和“500-4999 bp”每个bin内的整合位点富集或缺失，捕获每个基因组特征在5000 bp内的所有位点。如图所示。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba，不同含a3病毒的整合位点档案各不相同(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0398;双向方差分析，DF = 37)，其中A3G和A3G [E259A]的相似度最高。gydF4y2Ba

鉴于整合位点选择的最大差异是在基因和SINEs中观察到的，我们询问这些偏好是否依赖于A3剂量。事实上，A3浓度的增加导致基因中整合位点百分比的降低(图。gydF4y2Ba2 d, EgydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．相反，A3结构物浓度的增加导致SINEs中整合位点百分比的剂量依赖性增加(图。gydF4y2Ba2 f, GgydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．总之，这些数据表明A3F和A3G影响HIV-1整合位点的靶向，A3F和A3G的脱氨活性在较小程度上影响这种靶向的大小。gydF4y2Ba

A3F和A3G的表达改变了非b DNA基序的整合位点靶向gydF4y2Ba

然后，我们确定了A3对靶向非b DNA基序进行整合的影响。在A3F或A3G存在下感染的细胞在大多数非b DNA特征的500 bp内表现出丰富的整合(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．与对照组相比，在A3F [E251A]或A3G [E259A]感染的细胞在大多数非b DNA附近表现出相似的整合水平，除了直接重复序列和滑动基序，在这些位点上观察到整合的显著增加。值得注意的是，与其他A3结构和对照组相比，A3F [E251A]在Z-DNA附近的整合显著增加(25%，对照组为10%;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。gydF4y2Ba

为了确定靠近非b DNA特征的整合位点的分布是否存在差异，我们比较了距离每个非b DNA基序50 bp到500 bp的容器中整合位点的数量(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．由A3F、A3G和A3G [E259A]产生的病毒的整合偏好聚集在距离非b DNA 50 - 300bp的区域。A3F [E251A]的不同之处在于其整合集中在距离特征100 bp以内的区域。对整合位点剖面的两两分析(距离特征500 bp内)表明，虽然A3F和A3G [E259A]具有惊人的相似性，但所有其他整合剖面都是不同的(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;双向方差分析，DF = 109)(图gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．总之，这些数据表明，A3F和A3G影响HIV-1非b DNA特征的整合位点靶向，它们在a相、镜像重复、str和Z-DNA特征的靶向上的脱氨基活性有很大贡献。gydF4y2Ba

．gydF4y2Ba

A3G残基W94和W127影响HIV-1整合位点的靶向gydF4y2Ba

我们分析了感染A3G [W94A]或A3G [W127A]突变体产生的病毒的细胞的整合位点谱，以确定这些残基是否影响wt A3G影响整合位点靶向的能力。与wt相比，A3G [W94A]和A3G [W127A]在基因整合方面显著增加，而在SINEs方面的整合则下降(图2)。gydF4y2Ba4 a、BgydF4y2Ba、补充数据文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．此外，A3G [W127A]与wt A3G相比，癌基因整合事件显著增加。有趣的是，虽然A3G [W94A]表现出介于对照组和wt A3G之间的中间表型，但A3G [W127A]似乎加剧了HIV-1的整合位点偏好。对所有A3基因整合位点的配对分析(在各种特征的5000 bp范围内)表明，A3G [W94A]与wt A3F最相似，而A3G [W127]与所有测试的A3基因变体不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.014;双向方差分析，DF = 37)(图gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对于非b DNA特征，与小剂量A3G相比，感染A3G [W94A]-或A3G [W127A]-病毒的细胞在a相基序附近的整合显著增加，而在镜像重复和滑动基序附近的整合显著减少(图)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．此外，A3G [W127A]在Z-DNA附近的整合显著增加。在距离非b DNA基序50 - 500 bp的区域内，A3G和A3G的整合位点分布相似[W94A]，主要集中在距离特征100-400 bp的区域(图4)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．一个例外是Z-DNA，其位点高度富集在Z-DNA基序的100 bp内。相比之下，在A3G [W127A]存在下产生的细胞的整合位点倾向于聚集在非b DNA的150 bp内。对整合位点剖面(距离特征500 bp内)的两两分析表明，虽然A3F和A3G [E259A]具有相似性，但所有其他整合剖面都不同(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;双向方差分析，DF = 109)(图gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．总之，这些数据表明，A3G残基W94和更大程度上的W127对A3G影响整合位点靶向的能力有不同的影响。gydF4y2Ba

A3F和A3G减少了集成站点的热点和集群数量gydF4y2Ba

HIV-1整合“热点”的概念被引入，用于描述基因组中在没有任何选择过程的情况下，整合积累的数量偶然超过预期的区域gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba．鉴于我们发现A3F和A3G会影响整合站点的定位，我们询问它们是否也会影响整合热点的数量和站点的集群。我们将整合热点定义为包含四个或更多独特整合位点的1千碱基gDNA片段。与不表达A3的细胞相比，在A3F或A3G存在下产生的感染HIV-1的CEM-SS T细胞表现出大量减少的热点数量(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, Fisher精确检验)(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．A3F [E251A]和A3G [E259A]也表现出较少的热点数量，这表明A3脱氨活性对这种效应并不重要。相比之下，A3G [W94A]或A3G [W127A]的存在并没有显著减少集成站点热点的数量。gydF4y2Ba

为了记录基因组区域内整合位点的聚类，我们比较了前病毒整合位点之间的距离(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．整合位点的对照群体包含比预期的偶然(即随机分布)更短的段间距离，表明了聚类。与对照细胞相比，用A3F或A3G产生的病毒表现出显著的聚类减少(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001，费雪精确检验)。这种减少在含有A3G [E259A]和A3G [W127A]的病毒中丢失，在较小程度上A3G [W94A]和A3F [E251A]中丢失。这些数据表明，A3F和A3G的表达减少了整合热点的数量和整合位点的聚类。gydF4y2Ba

LTR中的G-to-A突变改变了体内和体外的整合位点靶向gydF4y2Ba

为了确定LTR末端脱氨是否影响整合位点靶向，我们对唯一的整合3’LTR核苷酸序列进行了对齐，并使用WebLogo将其图形化表示为序列标识gydF4y2Ba^{52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．正如预期的那样，对照的3 ' LTR端与脱氨缺陷A3突变体A3F [E251A]和A3G [E259A]高度相似。A3F和A3G的3 ' LTR末端除了位于LTR末端14和15位置的2个核苷酸外也高度相似。在A3F存在的情况下，80.0%的LTR在这些位置含有GG, 16.3%含有GA, 1.4%含有AG, 2.3%含有AA(图3)。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．在A3G存在的情况下，66.9%的lts含有GG, 0.6%的lts含有GA, 30.4%的lts含有AG, 2.1%的lts含有AA。gydF4y2Ba

为了确定3 ' LTR端第14和/或15位的G-to-A突变是否与整合位点谱的改变相关，我们将分别含有GA或AG的前病毒的A3F和A3G整合位点谱与含有3 ' LTR端第14和15位GG的前病毒的A3F和A3G整合位点谱进行了比较。含有GA二核苷酸的A3F lts (A3F- ltr -GA)在SINEs内的整合位点显著减少，而在SINEs远端(500-5000 bp)的整合位点增加(图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba、补充数据文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．在DHS、LCR和简单重复序列远端也观察到整合增加。引人注目的是，相对于非b DNA特征，整合位点的轮廓发生了巨大的变化。A3F-LTR-GA位点高度富集(高达74倍)1-400 bp的十字形基序(图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．G4 DNA、反向重复序列和Z-DNA位点富集。含有AG二核苷酸的A3G lts (A3G- ltr -AG)也表现出在SINEs中的整合减少，在SINEs更远端的整合增加;然而，与A3F-LTR-GA不同的是，基因和简单重复序列的整合也增加了(图3)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．与A3F-LTR-GA相似，A3G-LTR-AG相对于非b DNA在整合位点谱上有显著变化。整合富集在和/或接近大多数非b DNA特征。总之，这些数据表明，a3诱导的G-to-A突变位于3’LTR末端的14或15位，与一个显著改变的整合位点特征相关，并在转录沉默附近富集非b DNA特征。gydF4y2Ba

为了确定从HIV-1感染者的前病毒LTR序列末端的14和15位置是否发生类似的G-to-A突变，从93例患者队列的外周血单个核细胞(pmcs)中分离出基因组DNA，并用于对前病毒LTR进行测序并生成整合位点文库。我们将上述体外分析中所识别和过滤的独特集成3’LTR核苷酸序列进行比对，并使用WebLogo将其图形化表示为序列标识gydF4y2Ba^{52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．序列分析显示，从3 ' LTR端开始的14和15位G-to-A突变与A3G观察到的突变比例相似(图2)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．45%的前病毒lts含有GG二核苷酸(LTR-GG)， 50%含有AG (LTR-AG)， 0%含有GA (LTR-GA)， 5%含有AA (LTR-AA)(图)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．尽管LTR-GG和LTR-AG前病毒的整合位点总数较低(共48个位点)，可能是由于患者正在接受抗逆转录病毒治疗，但将包含LTR-AG的前病毒(25个位点)与LTR-GG(23个位点)的整合位点进行比较，结果显示基因内整合位点显著减少，而在板层相关结构域(LADs)的整合位点显著增加。与A3G-LTR-AG相似，来自含有LTR-AG的患者ltr的整合位点在一些非b DNA特征附近富集，特别是重复和滑动基序，这些基序已知会对基因表达产生负面影响(图3)。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba及补充数据文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

A3F和A3G促进体外潜伏感染gydF4y2Ba

鉴于我们发现A3促进转录沉默基因组特征的整合，我们接下来确定A3的表达是否改变了潜伏性和生产性感染细胞的比例。在这些实验中，我们使用了一种双荧光HIV-1报告病毒(HIVgydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba})设计用于流式细胞术定量潜伏感染细胞(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．艾滋病毒gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}该结构包含5 ' LTR启动子转录控制下的密码子开关增强绿色荧光蛋白(csGFP)和内部EF1α启动子控制下的不同的不相关荧光蛋白mKO2。HIV细胞的生产性感染gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}导致细胞同时表达csGFP和mKO2 (csGFP+， mKO2+)，而细胞的潜伏感染只导致mKO2表达(csGFP−，mKO2+)。仅表现出csGFP表达的细胞(GFP+， mKO2−)被认为整合了缺陷原病毒。不表达任何一种标记(csGFP−，mKO2−)的细胞被认为是未感染的，和/或含有潜在的csGFP和mKO2表达的前病毒。这些(csGFP−，mKO2−)细胞被排除在分析之外。典型的流式细胞仪实验如图所示。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

HIV感染CEM-SS细胞后gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}在A3缺失的情况下，我们观察到与潜在整合(csGFP−，mKO2+)相比，具有生产性整合(csGFP+， mKO2+)的细胞比例更高(图3)。gydF4y2Ba8 b, CgydF4y2Ba)．相反，细胞感染了等量的艾滋病毒gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}A3F或A3F[E251A]的存在导致潜在整合的比例显著高于生产性整合。艾滋病毒gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}A3G的存在也导致潜在整合的显著增加，但程度低于A3F和A3F[E251A]。与无A3对照组相比，A3G[E259A]存在时未观察到潜在或有效整合的比例有显著变化。不出所料，阴性控制了HIVgydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}缺少3 ' LTR的U3启动子区域的病毒(HIVgydF4y2Ba_{ΔU3-GKOgydF4y2Ba})导致整合病毒只表达mKO2 (csGFP−，mKO2+)。总之，这些数据表明，A3F和A3G显著增加了体外潜在整合的比例，而A3G和A3F的脱氨活性促成了这种增加。gydF4y2Ba

尽管存在许多细胞宿主限制因子，共同抑制HIV-1感染的早期阶段，HIV-1基因组与宿主基因组的整合仍然可以发生。整合事件将有不同的结果取决于整合的基因组位点。这些可能涉及直接调节宿主基因网络，控制病毒转录水平，并在某些情况下影响活跃或潜伏感染的结果gydF4y2Ba^{55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba}．通常情况下，A3蛋白在阻碍HIV-1 RNA基因组的逆转录和突变复制中间体中起主要作用;然而，HIV-1 Vif通过降低生产性感染细胞中的A3蛋白水平来规避这一限制。此外，包括A3F和A3G在内的一些A3蛋白已被证明与PIC相互作用并被易位到细胞核中gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．这种细胞核定位的后果及其对HIV-1整合的影响以前是未知的。在这里，我们已经证明A3F和A3G显著改变HIV-1整合位点的选择(图。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

HIV-1具有积极转录基因区域的整合位点偏好，特别是那些在感染期间激活的基因区域gydF4y2Ba^{57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba}．毫无疑问，选择过程在感染细胞的扩张和持久性中起着重要作用，这在接受cART治疗的患者中得到了证明gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．已知宿主细胞蛋白在HIV-1整合位点选择中起着关键作用。例如，LEDGF/p75和CPSF6促进整合到居住在基因密集区域的积极转录基因中gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba}．在这里，我们发现宿主细胞A3的表达以剂量依赖的方式将HIV-1整合位点的积累从基因转移到SINEs。此外，A3表达的增加减少了人类基因组中整合位点热点的数量，这表明A3增加了整合位点的多样性。考虑到A3与PIC内整合酶相互作用的能力，了解A3是否在立体上干扰整合位点靶向因子(如LEDGF和CPSF6)结合并靶向PIC到细胞核和基因组转录活性区域的能力将是很有趣的。类似地，A3在3 ' LTR上的脱氨活性(例如，位置14/15)可以改变PIC内或PIC与整合位点靶向因子之间的蛋白质-核酸相互作用。当然，在HIV-1复制的后期，A3水平被Vif降低，这可能是病毒促进整合到更活跃的基因组区域以帮助建立生产性感染的另一种机制。考虑到A3表达的时间梯度，它们对整合的影响可能发生在新细胞被感染后的早期时刻，此时它在HIV病毒粒子中释放出许可水平的A3。此外，正如本文和其他研究小组所示，有证据表明感染个体中确实存在传染性脱氨原病毒基因组，因此支持A3影响整合的机会gydF4y2Ba^{65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba}．虽然大多数脱氨原病毒基因组在某种程度上存在缺陷，但其中一些仍然可以产生HIV RNA和病毒蛋白，从而在没有感染颗粒排出的情况下促进慢性免疫激活gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba．此外，我们的实验数据支持A3蛋白可以促进潜在的整合。在这个实验系统中，我们将这些定义为综合前病毒，其中5'LTR启动子不能在其控制下表达GFP报告基因，但从内部启动子维持mKO2报告基因的表达。这在催化活性和非活性A3变异体中都被观察到，进一步支持脱氨酶与PIC的简单物理关联可能影响整合HIV前病毒DNA的表达结果。由于整合位点在hiv -1感染细胞的扩增和持久性中也起着关键作用，这些a3导向的整合位点可能在患者潜伏感染的持久性中发挥作用。最后，wt A3蛋白催化活性的失活突变也可能导致潜在表型。需要对来自HIV患者的人类样本进行更多的研究，以确定长期潜伏感染细胞是否主要包含我们在这里确定的LTR中第14和15位的突变标记。gydF4y2Ba

A3改变整合位点谱的能力部分依赖于A3F和A3G的脱氨酶活性，但更强烈地依赖于A3G的核酸结合能力。我们之前的研究表明，核酸结合突变体A3G [W94A]和A3G [W127A]被包裹成病毒颗粒，尽管包裹程度较低，但与wt A3G相比，它们表现出类似的脱氨酶活性gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．此外，这些突变体并没有减少病毒的晚期逆转录或整合gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．我们发现，与其他A3结构相比，这些相同的突变体对HIV-1 PICs的整合位点选择显示出独特的影响，这可能意味着脱氨酶独立活性是影响整合位点选择的重要因素，但不是唯一因素。A3G [W94A]和A3G [W127A]突变体之间的一个关键区别是，虽然A3G [W94A]可以形成同型二聚体，但A3G [W127A]突变体在这方面不太擅长gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．因此，A3G和A3G [W94A]之间观察到的差异可能是由于核酸亲和力降低，而A3G [W94A]和A3G [W127A]之间观察到的差异可能是由于多聚化缺陷gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

基因组位置效应已被证明可以影响HIV-1的表达和潜伏期逆转gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba}．LADs代表与核外围紧密相关的抑制性染色质环境gydF4y2Ba^{54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba}．sin(例如，Alu重复序列)和其他转座序列由于其被抑制的染色质标记(组蛋白H3在Lys9位点甲基化)而被认为是基因表达的直接沉默者。gydF4y2Ba^{72gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba}．此外，一些非b DNA结构，包括G4、十字形、三倍体和Z-DNA，已被证明可以有效地抑制邻近基因的表达gydF4y2Ba^{75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba，gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba}．我们在这里发现，A3F和A3G都增加了LADs、sine和几种非b DNA基序内或附近HIV-1整合的频率，并增加了体外潜伏感染细胞的比例，这可能意味着A3促进了基因组中转录沉默区域的整合。有趣的是，与非脱氨3 ' LTR末端的前病毒相比，脱氨3 ' LTR末端的前病毒在非b DNA基序中高度富集并接近基因沉默。然而，目前尚不清楚这些突变的病毒是否具有复制能力，因为LTR中的突变表明在病毒基因组的其他地方也可能发现突变。潜伏病毒颗粒的转录激活和特异性恢复是一项非常复杂的挑战，因为它们只占释放病毒总量的很小一部分。gydF4y2Ba

总之，我们首次证明A3酶可以通过脱氨酶依赖性和非依赖性机制调节HIV-1的整合位点谱。虽然这些A3蛋白最强的限制性特征被确定为它们的脱氨酶活性，但即使是非限制性突变体也保持了与整合酶相互作用和调节HIV-1整合位点选择的能力。目前，A3在影响HIV-1整合位点谱和疾病进展方面的总体影响尚不清楚。A3可能代表了最后的努力，将肠道从基因引导到更有可能转录沉默的基因组区域，以促进前病毒沉默。需要进一步的努力来解剖这一现象，并确定A3对前病毒沉默的影响。gydF4y2Ba

本研究符合所有相关的伦理规范。从JCRC和UHCMC/CWRU的irb获得伦理许可(EM-10-07和10-05-35)。gydF4y2Ba

细胞系和质粒gydF4y2Ba

细胞系保持在完全培养基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)中。HEK 293 T细胞(ATCC CRL-3216gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba)维持在高糖的完全DMEM中。完全RPMI维持CEM-SS细胞(NIH AIDS #776)。两种细胞储备均保存在37°C加5% CO的湿化培养箱中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．NL4-3- ΔVif/ΔEnv-eGFP是通过对NL4-3 ΔEnv-eGFP的定点诱变而开发的，它最初是从NIH艾滋病试剂计划(N.A.R.P.)(目录#11100)获得的。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．如前所述，用水泡性口炎病毒g蛋白(VSV-G) (pMDG)对NL4-3- ΔVif/ ΔEnv-eGFP进行假分型gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba}．pcDNA 3.1 (Invitrogen)作为空载体对照进行转染，所有表达A3的质粒之前都有描述gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba}．质粒pHIVgydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}和pHIVgydF4y2Ba_{巨科——ΔU3LTRgydF4y2Ba}由Eric Verdin博士(巴克研究所)提供。gydF4y2Ba

病毒产生和感染gydF4y2Ba

HEK 293 T细胞7.5 × 10接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba6孔板中每孔的细胞。播种24小时后，将携带NL4-3-ΔEnv/ΔVif/eGFP报告载体和pMDG的质粒与聚乙烯亚胺(PEI)指示的空载体或A3质粒一起共转染细胞。gydF4y2Ba^87gydF4y2Ba．当NL4-3-ΔEnv/ΔVif/eGFP和pMDG质粒的比例保持不变(750 ng: 250 ng)时，共转染空载体或A3质粒的水平根据实验而变化(30、100和250 ng)。对于A3G和A3G- e259a，转染20 ng，以确保有足够的细胞数量用于流式细胞术分析。用空载体(pcDNA 3.1)保持DNA转染总量不变。细胞孵育72 h产生病毒。病毒生产经抗p24capsid (N.A.R.P. #1513)、抗flag(克隆M2;Sigma)和抗-β-微管蛋白(ab21058;Abcam)。收集病毒上清液，500 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba用450nm注射器过滤5分钟，去除细胞碎片。此时，使用从杂交瘤31-90-25 (#HB-9725;和183-H12-5C (N.A.R.P. #1513)。收集病毒20小时后，将CEM-SS细胞以5 × 10的密度播种于12孔板中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每孔细胞，以标准衣壳水平(500,100，或20ng)感染，以900 × spinoculation 1 hgydF4y2BaggydF4y2Ba聚凝胺。培养48 h后收集细胞进行下游流式细胞仪分析和gDNA提取。采用BD FACSDiva (Software v8.0.1)， BD FACSCelesta进行流式细胞仪分析。采集后分析使用FlowJo(软件v10.4.2)在一台单独的计算机上进行。使用Wizard gDNA纯化试剂盒(Promega)从CEM-SS细胞中分离纯化gDNA。准型艾滋病毒gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}和艾滋病毒gydF4y2Ba_{巨科——ΔU3LTRgydF4y2Ba}HEK293T细胞与pHIV共转染产生病毒gydF4y2Ba_{巨科gydF4y2Ba}或pHIVgydF4y2Ba_{巨科——ΔU3LTRgydF4y2Ba}和pMD。Gin the presence or absence of plasmids carrying A3 (200 ng) for 72 h. Sandwich-ELISA was performed to determine levels of capsid protein (p24CA) as described above. CEM-SS cells were infected with HIV_{巨科gydF4y2Ba}或pHIVgydF4y2Ba_{巨科——ΔU3LTRgydF4y2Ba}(相当于120 ng p24CA蛋白)通过900次spinoculationgydF4y2BaggydF4y2Ba在10µg/ml聚苯乙烯(Sigma-Aldrich， #H9268-5G)存在的室温下1小时。在消旋后，去除病毒，并将新鲜培养基添加到井中4天。然后使用流式细胞仪对感染细胞进行分析(BD FACSCelesta使用BD FACSDiva (Software v8.0.1))。采集后分析使用FlowJo(软件v10.4.2)在一台单独的计算机上进行。通过将(csGFP−，mKO2+)或(csGFP+， mKO2+)细胞的百分比分别除以阳性细胞的总百分比来计算潜在整合或有效整合的比例。gydF4y2Ba

铝基qPCR检测整合前病毒gydF4y2Ba

PowerUpgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba使用SYBR Master Mix (ThermoFisher)使用Viia量化细胞的相对水平gydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba7 Real-Time PCR仪(Applied Biosystems)， 50 ng gDNA模板，使用以下引物:Actin-FWD 5 ' -CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3 '和Actin-REV 5 ' -CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3 '。循环条件:95°C初始变性3分钟，然后95°C 15秒，60°C 1分钟，循环45次。数据分析采用QuantStudio (version 1.6.1)软件。接下来，与之前描述的方案类似，使用50 ng gDNA和PrimeStar GXL DNA聚合酶(Takara)在以下条件下进行Alu-PCR:在94°C初始变性1分钟，然后98°C变性10秒，55°C变性15秒，68°C变性10分钟，循环30次，最后以68°C延长10分钟结束gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．所有针对HIV-1序列的引物都被设计为排除A3二核苷酸热点，以避免引起PCR偏差。为了量化整合的eGFP序列，使用了以下引物:Alu1 5 ' -TCC CAG CTA CTG GGG AGG CTG AGG-3 '， Alu2 5 ' -GCC TCC CAA AGT GCT GGG ATT ACA G-3 '和Lambda-eGFP-FWD 5 ' -ATG CCA CGT AAG CGA AAC TGT ACA ACT ACA ACA GCC ACA ACG TCT ATA TC-3 '。使用QX200系统(BioRad)在以下条件下对其稀释度进行ddPCR分析:在95°C初始变性10分钟，然后在94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒的45个循环。最后在98°C变性10分钟。使用了以下引物:lamb大- f2 5 ' -ATG CCA CGT AAG CGA AAC TGT ACA ACT AC-3 '， HIV eGFP REV 5 ' -TGA GGA TTG CTT AAA GAT TAT TGT TTT ATT ATT T-3 '。该探针使用:/5HEX/ CCC CGT GCT /ZEN/ GCT GCC CRA CAA CCA CTA CC /3IABkFQ。为了量化整合的5 ' LTR序列，使用了以下引物:Lambda-R-U5-REV1 5 ' -AGT TTC GCT TAC GTG GCA TCA GAC GGG CAC ACA CTA CTT TGA GCA C-3 '， Alu1 Comp 5 ' -CCT CAG CCT CCC CAG TAG CTG GGA-3 '和Alu2 Comp 5 ' -CTGT AAT CCC AGC ACT TTG GGA GGC-3 '。使用上述相同的条件和以下引物:LambdaR-REV2 5 ' -GTT TCG CTT ACG TGG CAT CAG ACG G-3 '和Late U3-FWD 5 ' -GCT ACA TAT AAG CAG CTG CTT TTT GCC TGT AC−3 '，用ddPCR对其进行稀释分析。使用探针:/5YAkYel/ CTT TAT TGA GGC T + T AAG + C + AG + T + G + GG T/3IABkFQ。 Nucleotides followed by a+ (N+) indicate an LNA base to improve the melting temperature of the probe. Results from the Alu-PCR that quantified integrated proviruses using the eGFP sequence or the 5’ LTR sequence primers were then averaged.

免疫沉淀反应gydF4y2Ba

用NL4-3-ΔEnv/ΔVif/eGFP和VSV-G转染HEK 293 T细胞，清除病毒上清中的细胞碎片。病毒上清在10万倍浓度下，用20%蔗糖垫超离心浓缩gydF4y2BaggydF4y2Ba使用70Ti型在4°C下加热3小时。病毒颗粒重悬于等渗1% triton - x100裂解缓冲液中。同时，使用500 mM NaCl软裂解缓冲液裂解病毒产生细胞，有效地击破细胞核，最大限度地释放整合酶。蛋白酶抑制剂(罗氏)一直用于防止蛋白质降解。盐活性核酸酶(Sigma)被用来去除gDNA根据制造商的协议。剩余的细胞碎片在4°C, 17000 ×离心去除gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。细胞和上清液裂解物混合在一起，以最大限度地分离出病毒成分。使用无菌水将总盐水平恢复到等渗状态。上述A3或pcDNA 3.1质粒与NL4-3-ΔEnv/ΔVif/eGFP转染同时在各自的孔中分别转染。转染72小时后，收集细胞并用等渗的1% Triton-X 100裂解缓冲液裂解。对裂解物进行超声处理以提高蛋白质的溶解性，并在17000 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下浸泡10分钟，以清除剩余的细胞碎片。在免疫沉淀之前收集每种裂解物的样本以评估输入水平。病毒裂解液在含有A3或对照的细胞裂解液中平均分配。然后将这些裂解物与30 μ L的抗flag共轭磁μ珠(Miltenyi)混合，并在管旋转器上在4°C下孵育3小时。然后，根据制造商的说明，使用µ柱将µ珠磁隔离。使用抗in (IN-2, Santa Cruiz BioTechnology, sc-69721)、抗p24衣壳(N.A.R.P. #1513)、抗flag(克隆M2;Sigma)，抗-β-微管蛋白(ab21058;Abcam)。使用Image Quant LAS4000采集Western blots图像，并使用Image Quant TL 8.1版软件进行分析。gydF4y2Ba

集成站点库和计算分析gydF4y2Ba

利用Illumina MiSeq平台对基因组DNA进行整合位点分析和测序gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}．简单地说，用MseI和NarI酶切基因组DNA，用连接介导PCR扩增3 ' ltr -宿主基因组连接。PCR产物经凝胶纯化后，用Nextera XT DNA样品制备试剂盒对纯化的DNA样品进行处理。进行了有限环PCR反应来扩增插入DNA，然后在伦敦区域基因组学中心(加拿大西部大学Robarts研究所)使用Illumina MiSeq (2×150 bp化学)对其进行测序。Fastq测序reads经过高质量修剪，并使用我们内部的生物信息学管道确定了独特的整合位点gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba，它被称为Barr Lab集成站点标识管道(BLISIP版本2.9)，包括以下更新:bedtools (v2.25.0)， bioawk (awk版本20110810)，bowtie2(版本2.3.4.1)和restrSiteUtils (v1.2.9)。如果3 ' LTR序列与人类基因组的任何区域(GRCh37/hg19)不匹配，则通过允许最多5个与参考NL4-3 ' LTR序列不匹配来识别和过滤HIV-1含有3 ' LTR的fastq序列。整合位点由3’LTR与人类基因组序列的序列交叉点确定。每个数据集中包含两个或多个位点(即相同位点)的所有基因组位点被分解为一个独特的位点供我们分析。使用我们内部的python程序BLISIPHA Heatmap (BLISIPHA v1.0)对位于各种常见基因组特征和非b DNA基基的位点进行量化，并生成热图。无法明确定位到基因组中单个区域的位点被排除在研究之外。所有非b DNA基序均根据先前建立的标准进行定义gydF4y2Ba^88gydF4y2Ba．匹配的随机控制积分位点是通过将每个实验确定的位点与硅晶片上的10个随机位点相匹配来生成的，这些随机位点被构造成与实验位点距离限制位点的碱基数量相同gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．独特的HIV 3 ' lts被BLISIP识别，与MUSCLE(10.1.7版本)对齐gydF4y2Ba^89gydF4y2Ba与trimAl(版本1.2)的缺口剥离gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba．所有在40%以上的人群中存在间隙的柱都被间隙剥离。使用WebLogo(3.6版)生成唯一的LTR序列徽标gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

病人样本的收集和准备gydF4y2Ba

样本采集自乌干达坎帕拉联合临床研究中心(JCRC)的WHO、CAP和nih - vqa认可的艾滋病研究中心(CFAR)实验室。JCRC是该国首批推出抗逆转录病毒疗法的艾滋病毒治疗中心之一，目前也是该国唯一获准提供inss的场所。根据各种纳入和排除标准，在2002年至2007年期间，在激素避孕药的HIV-1感染风险研究中，招募了艾滋病毒阴性的育龄妇女(18-35岁)，并在咨询和签署同意书后自愿(无报酬)作为参与者。如果一名女性在上述父母研究期间被诊断为HIV-1，则会被邀请参加一项辅助研究，以确定疾病进展的标志物，同样是在征得同意并接受咨询的情况下。CFAR实验室的患者数据库仅用于访问HIV-1感染患者的样本ID号码。除了HIV-1感染状况外，作者对所有临床数据都不了解。从JCRC接受常规治疗的HIV-1感染者中，随机收集了93个先前冷冻和保存的PBMC样本，其中一些也来自激素避孕和HIV-1生殖器脱落和原发性HIV感染女性(GS)疾病进展研究gydF4y2Ba^91gydF4y2Ba．从JCRC和UHCMC/CWRU的irb获得伦理许可(EM-10-07和10-05-35)。按照制造商的说明，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA，并将提取的DNA储存在−80°C。gydF4y2Ba

统计和再现性gydF4y2Ba

使用GraphPad Prism 9 9.4.1版本执行所有统计测试，如图图例所示。没有使用统计方法来预先确定样本量。分析中不排除任何数据。实验不是随机的。在实验和结果评估期间，研究人员并没有对分配盲目。研究人员对所有用于整合位点和LTR序列分析的患者样本进行盲法分析。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba