抗性突变体的进化拯救是由紧凑种群中径向扩张和选择之间的平衡所控制的gydF4y2Ba

许多耐药突变与缺乏治疗时生长速率下降有关，这种现象通常被称为耐药的适应度成本，因此受到净化选择的影响gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．原则上，生长缓慢的抗性克隆可以通过获得后续的补偿性突变来挽救，抵消它们与抗性相关的适应度成本gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).然而，由生长缓慢的细胞组成的不太适合的中间克隆寿命短，体积小，因此跨越这种适合谷本来就很少，需要大量的种群gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}，环境变化gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba，或长时间gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba变得反复可见。gydF4y2Ba

我们和其他人最近已经证明，在密集的群体中，集体细胞动力学固有地将选择的力量降低了几个数量级gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．随之而来的进化动力学和克隆寿命的改变也可能影响进化拯救。然而，追踪小个体克隆的进化轨迹是极其困难的。时间分辨深度测序方法可以识别新出现的新生亚克隆，但缺乏时空跟踪的能力，特别是在密集种群中gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}．基于显微镜的荧光预标记克隆的克隆跟踪方法虽然具有良好的时空分辨率，但不能捕获新出现的突变克隆gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}．因此，我们仍然缺乏对密集种群中进化动态的改变如何影响生长缓慢的谱系的进化拯救以及耐药性进化的经验见解。更好地理解在如此拥挤的环境中控制进化拯救的基本过程，对于理解为什么在许多病理细胞群体中耐药性如此普遍至关重要。gydF4y2Ba

在这项工作中，我们通过基因定制的酵母为基础的模型系统，研究了在密集的细胞群体中耐药克隆的进化拯救。将我们的经验结果与伴随的菌落生长的硅硅模型和基于代理的肿瘤模拟相结合，我们发现机械驱动的径向范围扩展和克隆宽度依赖的选择压力降低的相互竞争效应共同创造了先前未知的膨胀-选择平衡。由此产生的不适应抗性克隆的稳定性极大地增加了它们获得补偿性突变的机会，并在药物应用后长期存在，成为重新生长的种子。gydF4y2Ba

通过合成代偿突变追踪进化拯救动态gydF4y2Ba

我们的目标是研究在生长较快但易受影响的野生型细胞的背景下，对生长较慢的耐药克隆的进化拯救。在这种情况下，进化拯救是指从头获得补偿性突变，将抗性细胞的生长速度提高到野生型(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).多类型酵母菌菌落的模型系统，包括基因定制的耐药和易感gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba菌株，使我们能够以高时空分辨率跟踪进化拯救动态和抗性谱系的最终命运。荧光标记的耐药细胞，携带对药物湿霉素B的构成性耐药，以低比例(10%)散布到湿霉素敏感的野生型细胞群中(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).然后，我们将这种混合接种物的一小滴置于2D琼脂基质上，以径向扩张菌落(见补充图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．抗性细胞系从前面接种的单个细胞扩展，形成分离良好的扇区，可以很容易地通过时间分辨荧光显微镜观察(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac, d)。gydF4y2Ba

为了模拟耐药性的成本，我们通过翻译抑制剂环己亚胺选择性地调整耐药细胞的生长速度，野生型细胞对其不敏感gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．据报道，耐药相关的生长速率降低有很大差异(0 - 75%)，这取决于细胞类型、药物和耐药机制，在临床分离株中最常观察到低成本变异gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}．适度低的健身成本gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba= 0.013±0.006 (50 nM环己亚胺)，用于我们的主要实验，反映了这种分布，同时允许在我们的实验的时间和通量限制内进行最佳的数据采集。gydF4y2Ba

在本研究中，环己亚胺仅用于调节耐药和敏感克隆之间的相对适应度，而抗性本身是指湿霉素b。此外，需要注意的是，相对适应度成本的定量测量是指克隆宽度的变化率，而不是组成细胞的倍增率(见补充图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．由于抗性克隆的适应度成本，我们观察到在最初的无湿霉素生长阶段，它们在扩张前沿的宽度保持较小(~10个细胞)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).湿霉素的应用阻止了敏感野生型细胞的生长，而仍然存在于菌落边缘的耐药克隆继续以半圆形模式向外扩张(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).我们将这些药物应用后耐药谱系的快速扩张称为复苏生长穹窿。应该注意的是，在其他情况下，治疗失败的具体形式可能不同，例如生物膜的抗生素治疗或实体肿瘤的化疗效果。例如，死亡的酵母细胞在处理后保持其结构完整性，不释放任何空间。gydF4y2Ba

为了进一步检测代偿性突变事件和追踪新兴新生代偿亚克隆的进化轨迹，我们引入了一个基于重组酶的合成突变系统(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).生长较慢的耐药细胞可以以一定的速率随机切换gydF4y2BaμgydF4y2Ba从生长较慢的红色荧光初始状态到具有与非开关野生型细胞相匹配的生长速率的青色荧光挽救状态。突变率gydF4y2BaμgydF4y2Ba是由浓度决定的gydF4y2BaβgydF4y2Ba-雌二醇(补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．除非另有说明，突变率设置为gydF4y2BaμgydF4y2Ba= 2.65±0.25 × 10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}μmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在实验时间范围内获得足够数量的进化拯救事件，同时保持一个抗性谱系内多个补偿亚克隆克隆干扰的低概率。请注意，未代偿细胞和代偿细胞都携带湿霉素抗性。gydF4y2Ba

这些合成突变使我们能够在菌落扩张过程中监测进入的代偿性突变，并直接测量它们对长期持久性和治疗失败的影响。每个初始克隆都代表一个独立的实验，这种高通量方法使我们能够同时定量评估数千个抗性谱系的命运。数字gydF4y2Ba1gydF4y2BaG显示了一个实验后的群落图像，其无性系边界作为过去无性系宽度的化石记录。我们发现，生长较慢的抗性克隆在最终被驱逐出不断扩大的前线之前，会形成狭窄但令人惊讶的持久条纹。相比之下，一个补偿耐药亚克隆可以长期存在，甚至在大小上增长，并最终在湿霉素处理后播种一个复苏的生长圆顶。gydF4y2Ba

代偿性突变的获得和效果是由未代偿性克隆的稳定所决定的gydF4y2Ba

为了量化潜在的进化动力，我们记录了完整的历史gydF4y2BaNgydF4y2Ba通过时间分辨的多尺度荧光显微镜观察~ 10,000个耐药克隆，间隔24小时(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).克隆最初与内在适应性成本有关gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba= 0.013±0.006，但可获得代偿性突变gydF4y2BaμgydF4y2Ba(见图注)。gydF4y2Ba

通过基于机器学习的逐像素分割管道分割图像，我们测量了克隆在菌落边缘的宽度和补偿状态(未补偿(-)或补偿(+))，以重建它们完整的进化轨迹(见图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

为了量化代偿性突变的流行，我们计算了概率gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{电脑及相关知识gydF4y2Ba}=gydF4y2BangydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BangydF4y2Ba_0gydF4y2Ba以获得补偿性突变并存活到实验结束。然后，我们将实验结果与从径向范围扩展的最小硅零模型中获得的基线进行了比较。在这个模型中，单个扇区边界的轨迹被模拟为径向扩展外围上的选择偏向1D随机行走(参见下面的详细描述)。简而言之，边界在径向扩展的每一步中都在角空间中经历一个随机步骤。相邻克隆之间的竞争是通过移动角步长绘制的高斯核来实现的。这种方法先前已被证明非常适合于捕捉空间结构种群中进化和范围扩展的许多关键方面，如局部竞争、基因冲浪和径向生长的影响gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．然而，我们的实验表明，与这个零模型相比，补偿克隆的流行率高出10倍(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab,插图)。gydF4y2Ba

我们的实验还可以直接获得未补偿克隆和补偿克隆的宽度分布(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一部)。对于补偿(蓝色)克隆，我们发现平均宽度gydF4y2BawgydF4y2Ba随着半径的增大，底部宽度分布逐渐变宽(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bac, e)。然而，未补偿无性系(红色)的平均宽度最初上升，然后饱和gydF4y2BargydF4y2Ba≳gydF4y2Ba4000 μm，保持在平衡宽度不变gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}= 50±17 μm。这种稳定性也反映在未补偿无性系的宽度分布上，它们仍然被狭窄地限制在周围gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

观察到的宽度平衡也应该对谱系命运有显著影响，延长整个扇区的生存时间。我们还期望无性系的灭绝速率是由平衡宽度决定的。在没有补偿性突变的情况下，这应该会导致生存概率的逐渐指数衰减gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{survgydF4y2Ba}，而在代偿性突变的存在下，我们预计gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{survgydF4y2Ba}在一个非零值处趋于平稳。gydF4y2Ba

为了验证这一假设，我们测量了半径相关的生存概率gydF4y2Ba

与gydF4y2BangydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba),gydF4y2BangydF4y2Ba_0gydF4y2Ba=gydF4y2BangydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba=gydF4y2BargydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)，表示当蜂群扩展到一个半径时，出现在前面的各自谱系的数量gydF4y2BargydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf)。gydF4y2Ba

比较实验与零模型模拟在无救援情况下(gydF4y2BaμgydF4y2Ba< 10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}μmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和with-rescue (gydF4y2BaμgydF4y2Ba= 2.65±0.25 × 10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}μmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})情况下，我们发现实验观察到的生存概率在实验结束时超过了各自的零模型数据至少一个数量级。对于没有拯救的场景，这种差异尤其明显，在这种场景中，null模型没有产生任何幸存的克隆gydF4y2BargydF4y2Ba> 2100 μm时，实验表现出长尾指数状衰变。这种行为与我们观测到的稳定平衡宽度是一致的。gydF4y2Ba

有趣的是,对gydF4y2BargydF4y2Ba≲gydF4y2Ba5000 μm，我们发现无救援情况下的实验生存概率与有救援样本中测量的几乎没有区别。在扩张的后期(gydF4y2BargydF4y2Ba≳gydF4y2Ba5000 μm)，然而，有救援的生存概率趋于平稳，而没有救援的生存概率继续衰减。这种差异可以通过计算救援效果来量化(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag)gydF4y2Ba

在这里,gydF4y2Ba\({{{{{{{{\ mathcal {E }}}}}}}}}_{{{{{{{{\ rm {resc }}}}}}}}}= 0 \)gydF4y2Ba表示两个场景之间没有观察到的差异gydF4y2Ba\({{{{{{{{\ mathcal {E }}}}}}}}}_{{{{{{{{\ rm {resc }}}}}}}}}= 1 \)gydF4y2Ba表示所有存活的克隆只在带抢救样本中的限制。在我们的实验中，功效在误差范围内保持为零gydF4y2BargydF4y2Ba< 4700 μm后，连续上升到gydF4y2Ba\({{{{{{{{\ mathcal {E }}}}}}}}}_{{{{{{{{\ rm {resc }}}}}}}}}= 0.1下午0.6 \ \)gydF4y2Ba在实验的最后。gydF4y2Ba

进化拯救的影响被推迟了gydF4y2Ba

观察到的有效性延迟产生了一个初始无效窗口，在此期间，进化轨迹似乎不受进化拯救的影响。值得注意的是，这种延迟的程度似乎暂时与补偿性突变的获得脱钩，其中大多数之前已经发生过gydF4y2BargydF4y2Ba= 3000 μmgydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．总之，这表明了一个有趣的结果:如果在无效窗口内开始治疗，治疗失败的概率应该独立于进化拯救。gydF4y2Ba

为了验证这一预测，我们进行了一系列治疗模拟实验，在无效窗口内或基本上在无效窗口后开始治疗。在这些实验中，我们以不同的突变率扩大菌落进行初始预处理阶段，持续5天或9天(见图中的箭头)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf).然后我们开始用潮霉素B治疗，停止野生型生长，并在治疗后再生一天后计数再生的生长圆顶。类似于gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{survgydF4y2Ba}，分别为处理失败概率gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{失败gydF4y2Ba}对于每个场景，由gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaNgydF4y2Ba_{失败gydF4y2Ba}是多少个生长穹窿和gydF4y2BangydF4y2Ba_0gydF4y2Ba同样是最初接种无性系的数量。我们进一步测量了补偿无性系(蓝色)或未补偿无性系(红色)在总处理失败概率中的比例(补充图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对比不同突变率下的处理失败概率，我们发现补偿生长圆顶的比例随着突变率的增加而增加(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).有趣的是，补偿状态的这种变化并不直接转化为整体治疗失败概率的变化，在早期治疗点，整体治疗失败概率基本上不受影响。相比之下，将治疗推迟到第9天，在对照组和突变率增加的样本之间，治疗失败概率有显著差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).早期和晚期治疗时间点的对比也可以通过比较各自的疗效值来了解gydF4y2Ba\({{{{{{{{\ mathcal {E }}}}}}}}}_{{{{{{{{\ rm {resc }}}}}}}}}= 1 - P { }_{{{{{{{{\ rm{失败 }}}}}}}}}^{{{{{{{{\ rm{没有救援 }}}}}}}}}/{ P }_{{{{{{{{\ rm{失败 }}}}}}}}}^{{{{{{{{\ rm{救援 }}}}}}}}}\)gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac, d)。gydF4y2Ba

进化拯救的发生和影响是由稳定的膨胀-选择平衡所控制的gydF4y2Ba

基于观察到的无补偿无性系的宽度稳定性，我们验证了我们的假设，即这种现象也可能是进化拯救动态的关键决定因素，包括无效窗口。宽度平台的起源可以通过考虑驱动平均无性系宽度变化的两种主要力量的相互作用来合理化，(i)由于径向增长而导致的种群前沿的全球膨胀(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)和(ii)自然选择(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).对于生长较慢的无性系，这两种力相互对立，膨胀使无性系尺寸增大，选择使无性系尺寸减小，因此每次径向膨胀的总宽度变化为gydF4y2Ba

克隆宽度gydF4y2BawgydF4y2Ba以划定扇区边界之间的弧长来测量。在最简单的情况下，通货膨胀取决于扇区宽度和当前人口半径gydF4y2Ba\({\partial}_{r}{w}_{\inf}(w,r)=w/r\)gydF4y2Ba而选择只取决于相对适合度的差异gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba相邻的克隆gydF4y2Bar \({\部分}_ {}{w }_{{{{{{{{\ rm{选取 }}}}}}}}}=\ √6 s {| | (2 + s)} \)gydF4y2Ba．在以往的范围扩展研究中，已经对这种不断选择的情况进行了全面的研究gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．即使恒定的选择方案可以产生平衡的克隆宽度gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}这时，暴胀和选择力相互抵消(∂gydF4y2Ba_rgydF4y2BawgydF4y2Ba_{合计gydF4y2Ba}（gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}) = 0)时，该平衡具有固有的不稳定性(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).宽度克隆gydF4y2BawgydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}选择是否占主导地位，而宽度较大的选择是否继续缩小gydF4y2BawgydF4y2Ba>gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}都是通货膨胀主导和扩张。然而，我们和其他人最近已经证明，在密集群体中，与这里调查的相似，选择随着克隆宽度的增加而减少gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}．对于这样一个依赖宽度的选择∂gydF4y2Ba_rgydF4y2BawgydF4y2Ba_{选取gydF4y2Ba}（gydF4y2BawgydF4y2Ba)时，存在一个稳定的平衡宽度，即小无性系以膨胀为主，大无性系以选择为主(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad).注意膨胀强度与菌落半径成反比gydF4y2BargydF4y2Ba．结果，gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}对于恒定选择场景，将逐渐增加，而对于宽度依赖的选择，将逐渐减少。gydF4y2Ba

为了定量测试这种膨胀-选择平衡假设，我们模拟了常数和宽度依赖的选择场景，将单个扇区边界的轨迹建模为径向膨胀表面上的有偏1D随机行走(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一)gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}．我们发现，即使有效选择降低了几个数量级，我们实验观察到的生存概率也不能被任何恒定的适应度场景所捕捉。gydF4y2Ba5gydF4y2BaF，虚线;参见补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然而，使用宽度相关的选择系数gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_effgydF4y2Ba（gydF4y2BawgydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab，插图)不仅导致了未补偿无性系的稳定和狭窄的分布宽度(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac-e)，而且还准确地再现了经验生存概率和疗效(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaF g实线)。注意，上面关于通货膨胀选择平衡的基本原理在宽范围的宽度依赖中是稳健的，只需要∂gydF4y2Ba_rgydF4y2BawgydF4y2Ba_{选取gydF4y2Ba}（gydF4y2BawgydF4y2Ba)趋近于零的速度比膨胀的宽度下降更快(见补充图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．这里，我们使用了的逻辑形式gydF4y2Ba\({年代 }_{{{{{{{{\ rm {eff }}}}}}}}}( w) = s \ cdot 2 / (1 + {e} ^ {{w }_{{{{{{{{\ rm {c }}}}}}}}}/ w}) \)gydF4y2Ba作为一个只有一个自由参数(临界宽度)的最小启发式模型gydF4y2BawgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们先前证明，在密集的细胞群中，这种依赖克隆宽度的有效选择减少可以固有地作为集体细胞动力学的结果出现(见图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba参考中的G。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba])。简而言之，细胞运动的依赖距离的机械耦合阻止了选择行动所需的差分位移。这个宽度依赖关系的确切形式，以及gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}，在不同的系统之间可能有很大的不同。然而，膨胀-选择平衡的基本概念及其进化后果可能扩展到其他密集种群，包括致病细菌生物膜或实体肿瘤，它们表现出最小的必要成分集:(i)外周生长层的膨胀和(ii)宽度依赖选择。gydF4y2Ba

一个硅质肿瘤模型的进化拯救和治疗失败gydF4y2Ba

为了评估我们的研究结果在实体肿瘤中的相关性，我们使用量身定制的PhysiCell平台实现了基于代理的肿瘤生长模拟gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．简而言之，细胞在一个明确模拟的营养微环境中生长和分裂，并通过距离依赖力相互排斥，导致非运动的过阻尼运动(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).在我们的实现中，单个细胞可以以预定的随机速率和适应度效应额外突变。由于缺乏营养，种群内部的细胞停止增殖，形成外围生长层。gydF4y2Ba

与我们的实验分析相似，我们模拟了硅质肿瘤中的2D扩增，从低比例的耐药但生长较慢的细胞混合到生长较快的野生型细胞的背景中开始。gydF4y2Ba

导致硅质肿瘤种群固有地捕获了膨胀-选择平衡的完整指纹。接下来的分析管道等效于应用于实验数据(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)，我们再次发现无补偿克隆的稳定轨迹，无救援生存概率的特征长尾，以及随后进化救援的有效性延迟(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac g)。gydF4y2Ba

利用我们模拟的时空分辨率和精确控制代偿性突变的时间和位置的能力，我们发现无性系的生活史可以分为四个特征阶段:(i)建立阶段，(ii)平衡阶段，(iii)过渡阶段和(iv)逃脱阶段(图4)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bah).在初始建立阶段的开始，根据定义，无补偿克隆非常小，类似于刚获得抗性传递突变后的新生抗性克隆。在这一阶段，一个克隆被随机遗传漂变导致灭绝的概率很高。gydF4y2Ba

那些没有立即屈服于遗传漂移的克隆体进入平衡阶段，在这个阶段，由于自然选择和外围膨胀的相反力量，克隆体的宽度保持不变。在我们的模拟中，我们发现这个有限的平衡宽度为39.24±22.32 μm，或gydF4y2BawgydF4y2Ba_{情商gydF4y2Ba}= 3.27±1.86细胞直径。虽然在这一阶段的克隆仍然可以波动到灭绝，但由于平均克隆宽度的增加，与初始建立阶段相比，灭绝率大大降低。这种在小而有限的克隆宽度上的稳定现在可以解释为图中观察到的未补偿克隆的窄而持久的条纹的根本原因。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag。gydF4y2Ba

获得补偿性突变后，开始了一个过渡阶段，在此期间，生存概率逐渐从低到高。尽管补偿的突变细胞现在以野生型细胞的速度翻倍，甚至比邻近的未补偿的祖先有适应性优势，但重新补偿的克隆起源于单个细胞，因此最初非常小。在这些小宽度上，正选择和径向膨胀的好处与随机宽度波动的影响相比是很小的。结果，相当一部分新生的补偿亚无性系将会灭绝，这与未补偿无性系在建立阶段的命运相似。然而，随着时间的推移，存活的补偿无性系的平均宽度会增长，逐渐降低通过随机遗传漂变波动到灭绝的可能性。gydF4y2Ba

在我们的模拟中，一旦克隆体生长到大于gydF4y2BawgydF4y2Ba_{逃避gydF4y2Ba}= 6个细胞时，遗传漂变克服膨胀的概率小于1%。达到这一逃逸阶段的克隆株不仅几乎无限期地存在，而且在横向宽度上继续线性增长，直到在未来的某个时间开始治疗。gydF4y2Ba

观察到的生长较慢的无性系的准稳定性的一个直接结果是，代偿性突变可以在很大范围的种群半径内发生。这就提出了一个问题，即补偿克隆永久逃脱选择的概率是如何取决于半径的gydF4y2BargydF4y2Ba*代偿性突变发生时，过渡阶段开始。gydF4y2Ba

在我们基于代理的模拟中，我们可以通过在特定半径内触发补偿性突变来解决这个问题gydF4y2BargydF4y2Ba*然后测量对后续进化动力学的影响(参见补充电影gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．我们发现补偿无性系的平均宽度增加的速率与之呈负相关gydF4y2BargydF4y2Ba*，与较高半径下较弱的膨胀相一致(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bai).根据线性宽度增加的斜率，我们计算出预期的径向膨胀ΔgydF4y2BargydF4y2Ba_{逃避gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba*)，这是需要补偿子克隆过渡到宽度gydF4y2BawgydF4y2Ba>gydF4y2BawgydF4y2Ba_{逃避gydF4y2Ba}= 6个细胞(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Baj).自ΔgydF4y2BargydF4y2Ba_{逃避gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba*)随着gydF4y2BargydF4y2Ba*，补偿克隆出现在更大gydF4y2BargydF4y2Ba平均而言，*必须在过渡阶段忍受更长的时间，这导致概率下降gydF4y2BaPgydF4y2Ba_escgydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba*)以达到逸出宽度(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bak)。gydF4y2Ba

自gydF4y2BaPgydF4y2Ba_escgydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba*)仅描述获得补偿性突变后的动态，我们必须将其与概率相乘gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{变异gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba*)的无补偿克隆的突变gydF4y2BargydF4y2Ba*得到总概率gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{总计gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba*) =gydF4y2BaPgydF4y2Ba_escgydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba*)gydF4y2Ba⋅gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{变异gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba的补偿性突变使抗性克隆得以存活gydF4y2BargydF4y2Ba*(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bak)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{变异gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba) = 1−(1−.gydF4y2BaμgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{wgydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba）gydF4y2Ba}由未补偿克隆的宽度定义，因此也受膨胀选择平衡的影响。因此,gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{变异gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba*)最初增加，然后饱和gydF4y2BaPgydF4y2Ba_escgydF4y2Ba（gydF4y2BargydF4y2Ba*)持续衰减。gydF4y2Ba

结果在综合概率上出现了宽峰gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{总计gydF4y2Ba}（gydF4y2BargydF4y2Ba*)表明存在一个时间窗口，在此期间，对抗性克隆的进化拯救最有可能导致选择逃避，长期存在，并最终导致治疗失败。gydF4y2Ba

在这项工作中，我们研究了与适应度成本相关的抗性谱系如何通过后续的补偿性突变从净化选择中获救。我们介绍了一种基于荧光偶联合成突变的实验进化分析，用于扩展酵母菌菌落。该模型系统使我们能够以高时空分辨率跟踪数千个个体无性系的完整进化轨迹。从我们的研究中发现了三个主要的发现，将进化拯救的可能性增加和治疗失败的后果与密集人群中生长诱导的集体细胞动力学联系起来。gydF4y2Ba

首先，我们确定了一个膨胀-选择平衡，在这个平衡中，外围群体膨胀和选择压力的抵消作用导致了生长缓慢的抗性无性系的准稳定平衡宽度。因此，这些世系在不断扩大的种群前沿持续存在，提高了它们获得后续成本补偿突变的机会。将克隆边界建模为有偏向的随机游走者，我们证明了膨胀选择稳定需要依赖克隆宽度的有效选择。gydF4y2Ba

我们预计，膨胀-选择平衡将对相关过程产生关键影响，如突变-选择平衡和持久遗传变异的维持，或突变负荷的积累和群体的转化熔解gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}

其次，我们的分析显示，代偿性耐药克隆的流行率升高不会立即转化为治疗失败概率的增加，而是在很大程度上延迟了。新生补偿性无性系在产生效果之前需要建立和扩展到其未补偿性祖先的宽度之上。然而，由于通货膨胀-选择平衡的稳定作用，这种追赶需要时间。其结果是一个短暂的窗口，在此期间，代偿性突变的效力可以忽略不计。从概念上讲，这些动态与在范围扩展种群中描述的其他类型的瞬态有相似之处gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

第三，使用基于因子的肿瘤生长硅模型，我们证明了膨胀-选择平衡只需要最小的成分集，这是径向扩张的密集人群所固有的，也存在于实体肿瘤中。我们通过利用我们的模拟平台方法来研究代偿性突变的时间如何影响长期治疗的成功，从而总结了我们的研究。gydF4y2Ba

我们的发现为未来的研究提供了一些途径。为了便于系统的调查，我们将重点放在一个补偿到中性的场景上。使用不同的野生型参考菌株可以将我们的分析扩展到次中性甚至净有益的代偿突变。虽然我们控制良好的酵母模型系统非常适合于研究密度驱动生长对密集种群进化动态的基本影响，但它并没有捕捉到其他环境中存在的许多生物和生化复杂性，例如主动迁移，细胞-细胞粘附或异质性机械特性，这些可能覆盖本工作中讨论的基本过程。gydF4y2Ba

这里提出的工作的一个特别有趣的扩展将是研究细胞外聚合物质(EPS)的分泌(细菌生物膜的一个共同特征)如何改变我们工作中讨论的过程gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}．虽然生物膜的生长是由于EPS的分泌，而不是单纯的细胞增殖，很可能导致某种形式的细胞运动的长程相关性，扩张可能不一定是横向的。需要专门的实验分析和量身定制的模拟来阐明EPS和生物膜生长模式在膨胀选择平衡和进化拯救动力学中的作用。此外，种群生长在空间约束下，如限制在孔隙或管，可能不遵循这里讨论的简单径向膨胀。对锋面曲率的后续影响有可能减少或放大局部暴胀，从而改变暴胀-选择平衡点。gydF4y2Ba

此外，我们的研究重点是对已有抗性突变的进化拯救。两步抗性的替代轨迹，如抗性突变在独立驱动突变上的搭便车，尚未包括在内gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．然而，我们的实验策略和提出的计算框架可以在未来推广，以研究这些替代方案。在实验中，这可以通过两个正交重组酶系统实现两步合成突变平台。gydF4y2Ba

值得注意的是，我们的观察可能并不仅限于密集的人群。虽然通胀-选择平衡的必要因素固有地来自于密度驱动的增长，但它们也可能由其他形式的负大小依赖选择产生，例如在互惠情景中所描述的gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们预测，在广泛的增长参数和系统中，通胀选择平衡的存在是稳健的。然而，自然细胞群体表现出许多层次的复杂性，我们的模型的最小假设无法捕捉到这些复杂性，这些复杂性可能会覆盖、重塑甚至消除膨胀-选择平衡及其对进化的影响。此外，本研究侧重于有限的参数集，以揭示膨胀-选择平衡和进化拯救的基本概念。然而，虽然所调查的适应度成本在现实的参数范围内，但我们强调，它们受到实验和计算的限制，并不一定反映真实世界场景的全部范围。gydF4y2Ba

与关于抗性代价的报告相比，自然系统中代偿突变率的测量仍然难以捉摸。然而，可以合理地假设这些值可能是高度可变的，并且可能超出了我们实验中探索的参数范围gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．虽然膨胀-选择平衡的概念并不依赖于代偿性突变的速率，但在解释我们在病原生物膜或癌症的进化拯救背景下的结果时，需要考虑到这种可变性。gydF4y2Ba

特别感兴趣的是将我们的研究扩展到三维范围，例如基质嵌入的微生物球体和癌细胞肿瘤。此外，在治疗失败动态的背景下，包括细胞死亡，以研究内部耐药细胞的竞争性释放将是至关重要的gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

总之，我们的工作是向自下而上地理解密集细胞群中的进化动态作为积极增殖颗粒物质的涌现现象的关键一步。据我们所知，这项研究首次结合了这些系统的两个最基本特征——生长驱动的径向扩张和集体动力学的影响，系统地研究了它们对进化拯救和耐药性进化等关键进化过程的影响。gydF4y2Ba

我们希望在此建立的框架和工具的未来扩展将有助于在紧凑种群中设计更好的定量和预测进化模型，从而成为新的基于进化的治疗策略的垫脚石gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

菌株gydF4y2Ba

本工作的所有实验都是用非运动酵母进行的gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba．所使用的菌株yJK26(合成突变系统耐药突变体)和yMG10(野生型背景)是在实验室菌株W303的基础上构建的，以共同的祖先yJK19为基础gydF4y2BaβgydF4y2Ba-雌二醇诱导pSCW11-Cre-EBD重组酶构建自pDL12gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

yJK26和yMG10具有相同的合成突变盒gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{ENO2gydF4y2Ba}-gydF4y2BaloxP-ymCherry-kanMX-loxP-FP2-UBQ-cyh2rgydF4y2Ba，只是二级荧光蛋白不同gydF4y2BaFP2gydF4y2Ba后面的卡带，这对于yJK26是gydF4y2BaymCeruleangydF4y2Ba和yMG10gydF4y2BaymCitrinegydF4y2Ba(有关合成突变系统克隆的详细信息，请参阅下面一节)。在这两种情况下，荧光蛋白通过蛋白水解可切割的泛素连接子偶联到gydF4y2Bacyh2rgydF4y2Ba（gydF4y2BaCYH2Q37EgydF4y2Ba)，传递对翻译抑制剂环己亚胺(Cycloheximide)的耐药性。为了构建yJK26，我们首先引入了合成的突变盒(yJK20)，随后取代了最初作为选择标记引入yJK19的Nourseothricin抗性标记gydF4y2Bacre-EBDgydF4y2Ba插入，具有pAG32的HygR电阻(可从gydF4y2Bawww.addgene.comgydF4y2Ba, # 35122)。因此，yJK26(及其转化版本yJK26c)对湿霉素B具有建设性抗性，而转化版本yMG10 (yMG10c)在我们的实验中被用作湿霉素敏感的野生型菌株。所有插入都是通过标准PCR扩增插入物，然后进行醋酸锂转化和选择。对阳性选择的克隆进行交叉连接集落PCR验证正确插入。各菌株的基因型见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

合成突变盒的构建gydF4y2Ba

合成突变盒是在pMEW90的基础上构建的(哈佛大学Andrew Murray实验室的善意礼物)。gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba．最初，所有部分都通过PCR扩增，并通过Gibson克隆组装以获得pMG8。为了得到pJK19，我们替换了gydF4y2BaymCitrinegydF4y2Ba在pMG8中gydF4y2BaymCeruleangydF4y2Ba经Gibson组装。gydF4y2Ba

进化拯救试验gydF4y2Ba

将yJK26和yMG10c在2%琼脂YPD板上进行空间竞争，进行进化拯救实验。从琼脂平板上单细胞培养2天的菌落中，挑选部分菌落在液体YPD培养基中培养过夜。第二天将细胞重新接种到新鲜培养基中，再生约3小时。将两株菌株按1:9耐易感菌比例混合，用gydF4y2BaOgydF4y2BaDgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba测量。混合培养1 μLgydF4y2BaOgydF4y2BaDgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba≈20株接种于6孔板上，充以15 mL培养基，风干。接种后1 h的菌落图像见补充图。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．环己酰亚胺和gydF4y2BaβgydF4y2Ba将-雌二醇以所需浓度(环己亚胺为50 nM，雌二醇为2、4或6 nM)预混在介质中。菌落在治疗前培养5或9天，每天成像。在处理当天，以90 μL滴注潮霉素BgydF4y2Ba\(41.5 \ \压裂{{{{{{{{rm \{毫克 }}}}}}}}}{{{{{{{{\ rm{毫升 }}}}}}}}}\)gydF4y2Ba储存在井边的小液滴。总共生长了92个菌落，至少有5个菌落在相同的化学环境中。5天后开始对每种条件的6个菌落进行治疗(50 nM环己亚胺+ 0,4,6 nM雌二醇和0 nM环己亚胺+ 0 nM雌二醇(补偿接种量))，除了0 nM环己亚胺+ 0 nM雌二醇(未补偿接种量)，其中只有5个菌落进行治疗。第9天分别用50 nM环己酰亚胺+ 0和4 nM雌二醇接种18个菌落，50 nM环己酰亚胺+ 6 nM雌二醇接种17个菌落，无补偿接种和补偿接种分别用6和5个菌落。克隆的初始数量是通过从单细胞分辨率图像中手动计数克隆来估计的。从12个蜂群中，我们测量了每个蜂群156个克隆的平均值，结果是，克隆总数≈14500 - 15000个。gydF4y2Ba

在不同环己亚胺浓度下，菌株之间的适应度差异是通过接种的菌落的最终图像来测量的，这些菌落中生长较快的细胞(yMG10c)在生长较慢的细胞(yJK26)中含有低分数(2.5-10%)。在菌落的不同半径处测量生长较快的无性系的开放角，并与参考文献中的式10拟合。[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]来计算增长率差异。对于50 nM环己亚胺，yJK26和yJK10c的适合度差异为gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba= 1.26±0.64%(采用14个无干扰克隆测量)。yJK26和yMG10c在没有环己亚胺的情况下gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba= 0.09±0.08%(使用8个非干扰克隆测量)。yJK26c与yMG10c的适应度差异在方法误差范围内为中性。蜂群实例和测量值见补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa、b。gydF4y2Ba

通过测量突变无性系在菌落生长过程中的频率变化来估计yJK26的突变率。1 μL的yJK26细胞在YPD与gydF4y2BaOgydF4y2BaDgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba≈20接种于含有不同浓度雌二醇的琼脂板上，每日成像。补偿突变体在蜂群外围的频率被测量为蜂群半径的函数，并在6个蜂群中平均(见补充图)。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)为0,2和4 nM雌二醇和12菌落为6 nM雌二醇。假设中性，突变频率的任何变化都是由于突变而发生的，可以用gydF4y2Ba

与gydF4y2BafgydF4y2Ba_{红色的gydF4y2Ba}由于红色无性系的频率，gydF4y2BaμgydF4y2Ba突变率，gydF4y2BargydF4y2Ba_0gydF4y2Ba初始半径，和gydF4y2BargydF4y2Ba表示当前菌落半径。将上述函数与测量的频率变化进行拟合，可得到每个细胞每次径向集落生长的突变率。采用正交距离回归法拟合和计算突变率的不确定度。参见补充图2c、d。gydF4y2Ba

成像与分析gydF4y2Ba

接种后和生长1天后，在Zeiss Axiozoom V16荧光显微镜上使用ZEN 3.0(蓝色版)和PlanNeoFluar Z 2.3x/0.57物镜对菌落进行成像。所有其他时间点均使用PlanApo Z 0.5x/0.125物镜。为了在图中显示，荧光图像是在斐济(V 2.0.0)进行的，以调整彩色地图。使用自定义的半自动管道来处理图像。首先，通过Ilastik (V 1.3.3)进行图像分割，这是一个基于机器学习的分割平台gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．该算法在不同日子随机挑选的图像上进行训练(训练数据可根据要求提供)。带有分割输出的菌落显微镜图像见补充图。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba．通过自定义MATLAB (R2020a)和python 3.8算法对分割图像进行进一步分析。gydF4y2Ba

克隆的发展轨迹gydF4y2Ba

克隆轨迹是通过在外围为每个克隆个体分配标签来重建的。为了标记，在成像的不同日子里使用角度位置。以生长一天后的图像为参考(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).每天将克隆的角位置与前一天的克隆位置进行比较，以分配id。全轨迹跟踪只是为了说明一个殖民地的目的，在主要文本中提出的定量分析中不需要。gydF4y2Ba

混合克隆的分类gydF4y2Ba

在实验和模拟中，从无补偿状态到完全补偿状态的转变通常是通过一种混合状态进行的，在这种状态下，克隆体前端由补偿和未补偿的细胞组成。由于实验数据受到成像限制和分割伪影的影响，我们将任何可检测到补偿的克隆归类为完全补偿，这反映在图中明显的尖锐过渡中。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab.但是，我们在图中对宽度分析排除了任何这样的模糊区域。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC以避免由于分割工件造成的系统偏差。由于这些限制不适用于重新生长穹顶的分类，因此图中的治疗失败分析。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba包括所有补偿的克隆，即使保留一些未补偿的细胞(见补充图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．对于具有完美类型分辨率的径向随机游走和基于代理的模拟，宽度分析中分别考虑了未补偿子克隆和补偿子克隆(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac,gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).请注意，在基于代理的模拟中，群体中未补偿的细胞仍然可能发生突变，导致明显的混合(参见补充视频2)。然而，这些大量突变对前沿进化动态和克隆命运的影响是可以忽略不计的。gydF4y2Ba

宽度分布估计gydF4y2Ba

克隆宽度分布(图d和e)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)表示用对数转换核密度估计(KDE)平滑的值gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．补充图。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba显示了底层直方图与使用非对称函数核的概率密度估计的比较gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba，即传统的高斯核，或者对数变换的高斯核。对数转换KDE的优点是，它对严格的正观测值产生估计值，在gydF4y2BaxgydF4y2Ba= 0不像传统的高斯KDE或不对称核的标准KDEgydF4y2Ba^45gydF4y2Ba．对于实验数据(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，我们应用一个像素大小的截止，以避免分割相关的工件。gydF4y2Ba

随机行者模型的描述gydF4y2Ba

随机行者模拟在python 3.8中实现。我们将每个具有野生型的抗性无性系之间的边界视为角空间中独立的、不相互作用的一维随机行者gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaηgydF4y2Ba（gydF4y2BaμgydF4y2Ba,gydF4y2BaσgydF4y2Ba)为具有均值的正态分布噪声gydF4y2BaμgydF4y2Ba和方差gydF4y2BaσgydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba是行走的偏差，中性克隆的偏差为零，适合度不足的克隆的偏差可以为正数或负数，这取决于随机行走者所代表的扇区的一侧。每个边界进行随机游走，这是扩散方程的一个解。扩散系数是系统中遗传漂变的度量。它用方差随高斯分布的随机步长表示gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

为了模拟克隆灭绝，我们让相邻的随机行走者在它们交叉时被消灭。随机游走的偏差gydF4y2BabgydF4y2Ba使用refs中的相等时间参数计算。［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]:gydF4y2Ba

为了检验我们从集体细胞动力学中产生的膨胀-选择平衡的假设，我们使用了一个有效的宽度依赖选择系数gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba=gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba（gydF4y2BawgydF4y2Ba)，其形状与图中实验观察到的形状相似。gydF4y2Ba2gydF4y2BaG (ref) [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．这里我们用了gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BawgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba临界宽度是否与参考中的临界宽度类似。[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，是一个自由参数。gydF4y2Ba

随机行者模型的参数化gydF4y2Ba

为了参数化随机游走模型，我们使用接种后测量的菌落初始半径和测量的适应度代价gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(见补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．获取的值gydF4y2BawgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba在有效选择中，我们将生长缓慢的无性系的平衡宽度与实验测量的平衡宽度进行了比较。的健身成本gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba的临界宽度= 0.013gydF4y2BawgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba= 280 μm最符合实验数据。为了估计系统中的遗传漂变，我们调整了扩散系数和初始克隆大小分布，以匹配实验克隆的存活概率(补充图)。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)．与实验最匹配的扩散系数为0.23 μmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．遗传漂变的强度控制着生存概率的变化。当大多数无性系体积都很小时，初始宽度分布控制着初始生存概率下降的斜率。在这里，我们的初始尺寸分布符合高斯分布，均值为20 μm，标准差为5 μm。相比之下，红色无性系1 d后的平均宽度为26±12 μm。类似地，我们比较了不同突变率的结果(见补充图)。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)．模拟中使用的突变率gydF4y2BaμgydF4y2Ba= 10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}μmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与实验测量值是否吻合良好gydF4y2BaμgydF4y2Ba= 2.65±0.25 × 10gydF4y2Ba^{−4gydF4y2Ba}μmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

基于主体的仿真gydF4y2Ba

基于议程的硅质肿瘤模拟通过修改版本的PhysiCell(版本1.8.0)进行，这是一个用于2D和3D肿瘤生长的开源平台gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba，使用BioFVM(版本1.1.6)gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba来解输运方程。gydF4y2Ba

该模型模拟生长，包括机械细胞-细胞相互作用，在化学微环境中，通过化学物质在系统中的扩散建模。细胞分裂和对邻居施加的物理力导致了密集的种群。在圆形狄利克雷边界条件下，代理不断消耗从外边缘扩散到系统的营养物质。这导致了生长层的出现，因为营养物质在种群中消耗殆尽(见补充电影)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

模拟中的每个细胞都有自己的特征，由其机械和化学环境定义。这些特征包括细胞大小、周期进展、生长速度和力学。我们初始化的系统类似于实验中的初始接种，有一个中空的致密细胞环，在外围散布有足够间隔的单个生长缓慢的突变体(16.6%)。这两种细胞类型的生长都依赖于营养物质的浓度，在极低浓度时生长会逐渐减缓，直到完全停止。模拟参数化参见补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细胞大小与菌落半径的比例被选择与实验不同，以适应计算成本的限制。虚拟种群增长到~2 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞，对应于起始菌落的10倍径向增长。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba