多通道监测人类大脑皮层的瀑样植入老鼠揭示视觉皮层的功能连接gydF4y2Ba

干细胞技术的最新进展产生了人类大脑皮层瀑样,三维神经网络来源于分化人类诱导多能干细胞(hiPSCs)概括一些大脑皮层的功能。这个生物工程进展显示保证下一代的疾病模型,为药物筛选平台和个性化医疗和移植神经假肢恢复特定的丢失,退化,或受损的大脑区域gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}。先前的研究表明,在培养皿中皮质瀑样表达谱匹配,胎儿和产后人类大脑皮层的发展gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}瀑样可以产生电生理学网络活动类似人类新生儿大脑的脑电图gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。与二维神经文化相比,皮质瀑样表现出复杂的神经组织的功能,如皮质层gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}和更大的程控多样性gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。动物模型相比,皮质瀑样保存人类个体患者的遗传背景gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。此外,最近的研究报告说,瀑样植入体内小鼠皮层可以建立的功能形成血管移植提供营养和氧气供应,防止瀑样坏死细胞死亡的核心gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba,延长主机轴突投射到周围组织gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

虽然这些有前途的体内研究瀑样研究奠定了基础,他们主要集中在当地和急性测量少量的细胞的神经活动。慢性功能性反应生成的外部感官刺激将瀑样移植到成年收件人还没有被证明。这将需要纵向研究专注于移植瀑样结构和电生理学的发展。目前现有的录音技术限制这样的多通道实验的可行性。解决技术差距,我们开发了一个基于光学透明石墨烯微电极技术的实验范式gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}纵向、多通道监测的发展成熟,功能集成人工神经网络长期植入retrosplenial皮层内的老鼠的大脑。使用清醒小鼠慢性植入retrosplenial内皮层,我们演示了纵向的录音电子对视觉刺激的反应从皮质瀑样和周围组织血管化的光学成像瀑样。这些纵向多通道记录允许我们研究神经活动传播整个瀑样/皮质边界,感官刺激功能反应生成的瀑样,和激增的调制不同活动的细胞移植瀑样周围皮层的神经活动。我们事后进行组织学分析研究形态集成和突触连接人类与周围的小鼠皮层瀑样。此外,我们将这种模式扩展到研究之间的差异反应麻醉植入瀑样和主机皮层。我们的工作提供了一个独特的多通道方法研究瀑样活动的演化及其与周围皮层功能集成在其体内成熟。我们的工作将为未来的研究铺平道路的功能整合人类瀑样移植关注广泛的科学问题和瀑样的潜在临床应用。gydF4y2Ba

瀑样和微电极阵列co-implantation允许纵向监测瀑样贪污gydF4y2Ba

石墨烯的光学透明度微电极可以无缝集成的电子记录和多光子成像optogenetic刺激gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。我们使用透明石墨烯微电极阵列结合电气录音和光学成像的异种移植皮质瀑样和周围的皮质。微电极阵列16 100µm电极垫之间相隔500µm,占地面积2毫米×2毫米(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在移植之前,我们进行了电化学阻抗谱(无花果。gydF4y2Ba1克ydF4y2Bab, c);平均阻抗大小约1.4 MΩ1 kHz。植入,我们保税的臀部微阵列组成的玻璃塞两个3毫米盖玻片和一个5毫米盖玻片。工作流的生成和植入皮质瀑样图中概述。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba。hiPSCs分化和聚合为三维文化以前设计的协议gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。一代7到9周后,单皮质瀑样是根据大小和形状选择植入。按照我们以前的工作gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba,我们有针对性的左retrosplenial皮层(RSC)植入网站。RSC密集的血管网络构成gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba异种移植的血管化的可能性,从而增加了瀑样。我们使用成人(8 - 12个月)NOD / SCID小鼠作为接受者。安装后的钛headpost,我们删除一个3×3毫米左右的颅骨和硬脑膜的目标区域。我们吸气1毫米左右gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}皮质的体积,同时避免大的动脉和静脉,放置一个皮质瀑样无效,并把石墨烯微电极阵列/玻璃总成上关闭曝光(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)。数组连接与一个定制的3 d打印的保护帽(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba上),而动物是国内笼子里(无花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba);帽子被在录音(无花果。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba,底部)。1周的恢复期后,电生理记录进行了六个老鼠每两周总共8到11周。大多数微电极阻抗保持稳定在研究期间(补充图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示了接触的代表动物植入后69天;广场马克石墨烯电极垫。异种移植已用红色标出,显示轻微的经济衰退和变色比周围的皮质。gydF4y2Ba

瀑样生成神经对感官刺激的反应gydF4y2Ba

我们首先采用纵向多通道监测方法调查瀑样是否可以生成一个感官刺激功能反应通过视觉刺激和记录随后的电反应。我们假设瀑样将开始建立机能活动视觉刺激与视觉皮层主机集成组织。Stimulus-induced电反应引发了利用光学光纤耦合项白光LED的光脉冲放置在动物的右眼的面前。在实验期间,我们观察到局部场电位联赛确实出现在电极通道上方瀑样在录音瀑样3周后植入直到实验终止(gydF4y2BangydF4y2Ba= 6动物,补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba结果显示代表从一个实验后69天瀑样小鼠皮层植入。图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示了一个brightfield植入网站的形象。6在植入电极通道瀑样用红色标记。在通道周围的皮质,最接近的视觉皮层被标记为蓝色。剩下的电极(黑)覆盖组织接近皮层之间的边界和优越的矢状和横向鼻窦。图gydF4y2Ba2中gydF4y2Ba显示记录的结果(低通滤波、250 Hz)从一个会话100 -光脉冲女士2赫兹交货4 s。石墨烯电极使可靠的低噪声单试验记录(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。联赛是一个一致的两相的形状在每个光脉冲的发生gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。渠道覆盖瀑样(红色)表现出视觉刺激的反应,当反应最强的测量(蓝色)渠道密切附近视觉皮质。平均LFP反应光刺激对所有16通道图所示。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba。联赛表现出连续性皮质/瀑样边境显示传播模式开始在该地区最亲密的视觉皮层植入瀑样(图和扩大。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。锂离子反应的瀑样匹配周围皮层和不间断的传播的锂离子从皮质瀑样建议功能连接时的记录。瀑样通道的联赛是最强的在后面的录音(> 50 dpi),如无花果所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,出现了3周左右post-implantation当第一个录音,包括光刺激(补充图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

宽带LFP信号(低通滤波、250 Hz)是细胞外的空间总和电位产生的几种机制包括突触传递、动作电位,内在传导电流和卷。这些机制的相对贡献和空间位置和特异性的联赛取决于频率。体积传导是指电流流动活跃的神经来源及其周围组织的影响被认为是瞬时跨渠道gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。因此,消除可能的体积进行信号之间共享渠道,我们独立分量分析(ICA)进行数据预处理。ICA是一个统计上的方法执行盲源分离的常见信号导致通道录音,如体积进行了信号gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}。通过手动删除信号组件共享所有渠道,我们确保噪声和由于工件体积传导(和其他环境因素如电噪音和鼠标运动)信号分析前被移除。更进一步,电生理信号皮层区域之间的旅游将有一个基于底层轴突预测的时间延迟gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。因此,测试是否LFP反应生成的本地瀑样的生物信号传播通过从皮质突触连接或他们探测到的信号由于体积传导,我们检查了锂离子的相对时间进程记录网站。我们观察到一个传播模式从该地区接近视觉皮层(右下角)和扩大植入瀑样区。我们量化这个传播向瀑样区域使用的振幅和延迟第一联赛审判的峰值平均(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)。峰LFP振幅的频道重叠和视觉皮层被大约200µV发生36女士刺激后发病。频道重叠瀑样也检测到联赛的振幅发生41.7 ~ 50µV女士刺激后发病。刺激发病之间的36个毫秒的延迟和锂离子响应测量的视觉皮层渠道匹配以前的观测视觉皮层诱发响应延迟在完整的老鼠gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}。5.7毫秒的延迟,我们观察到的最遥远的瀑样和皮质之间的通道(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,学生的单侧t测试补充图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)是在延迟的顺序观察到完整的视觉皮层和RSC地区文学gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。我们观察到的延迟时间的一致性的视觉皮层瀑样与文学之间的延迟时间之间的视觉皮层和RSC显示功能连通性和传播主机和移植瀑样。gydF4y2Ba

与Morlet小波频谱分析显示增加信号功率在几个频率在视觉刺激(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)为皮层和瀑样通道。首先,我们观察到的信号功率增加刺激频率及其二次谐波,与先前的功能性活动中描述一致的完整皮质的老鼠gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba、猫gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba,人类gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}(补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。第二,视觉光刺激导致增加伽马(30 - 150 Hz)的力量,这是符合以前的工作中执行完整的视觉皮层的老鼠体内gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。具体地说,我们注意到更多的权力在60 - 100 Hz,恰逢个人刺激的开始。值得注意的是,频道重叠植入瀑样还显示一个γ反应,被认为是更本地化的测量由于脑组织的高频信号的衰减的传播gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)。锂离子在高伽马频率范围(> 100 Hz)被认为是与当地飙升活动强烈相关gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。在研究猕猴,高伽马联赛的力量被发现与强化活动高度相关的神经元gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}。我们记录还显示高伽马范围活动瀑样和皮层渠道(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)表明活动起源于底层瀑样或皮质组织而不是体积进行了信号。总的来说,对视觉刺激的反应显然是频道覆盖瀑样(图中检测到。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba,通道1)以及皮层渠道接近视觉皮层(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba,通道2)。3周post-implantation瀑样显示LFP在周围皮层响应的振幅匹配,表明异种移植神经元建立突触连接与周围皮层组织和收到鼠标功能输入大脑。gydF4y2Ba

多部件活动调制在感官刺激的存在gydF4y2Ba

接下来,我们调查是否瀑样细胞的活动激增被周围皮层的神经活动调制石墨烯微电极使用录音和透明的。我们评估多部件活动(邮件用户代理)在0.5 3千赫带通过滤数据。类似于高频联赛,高频邮件用户代理信号更强烈的组织,因此主要反映当地的神经元活动(在100 - 200年µm记录电极)gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}。图gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba显示邮件用户代理的录音。我们选择了两个代表频道(红色、通道O1和O4)覆盖瀑样异种移植和两个渠道(蓝色、通道C2和C7)覆盖周围皮层(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。在所有渠道,我们观察到自发邮件用户代理事件,这被定义为时间点邮件用户代理了一个预定义的阈值−−3 4倍的标准偏差(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。自发邮件用户代理事件保持相对稳定的8 - 11周的实验,在当前利率大约2赫兹(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4动物,补充无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba岁),符合活动同样瀑样测量体外gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。到验证邮件用户代理记录局部空间和独特的每个通道,我们评估了邮件用户代理的痕迹gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。事件驱动的邮件用户代理平均是通过计算目标通道的邮件用户代理事件时间和所有16通道,计算平均邮件用户代理波形从1女士之前2女士之后每个目标频道的事件。如果相同的神经活动是由多个通道,类似的邮件用户代理平均会出现跨几个,附近的通道。如果通道独立的神经活动记录,那么邮件用户代理事件偏转只会出现在目标通道和所有其他渠道将平均为零。我们的研究结果表明,从每个渠道覆盖瀑样邮件用户代理事件记录或皮质地方和没有任何分布在其他渠道(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba7 b, cgydF4y2Ba)。1毫秒后计数通道之间的重叠事件的数量装箱,我们看到几乎没有同现的事件(无花果。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)。邮件用户代理的数量事件瀑样之间的重叠和皮层渠道未达到统计上的显著水平和下跌的可能性范围内(补充图。gydF4y2Ba7 egydF4y2Ba),支持邮件用户代理记录来自当地神经放电,因此记录电极覆盖瀑样瀑样神经元和不能在本地生成的来自周围的皮质频道。gydF4y2Ba

增加邮件用户代理渠道覆盖瀑样和电力观察皮层响应的视觉刺激(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。值得注意的是,也有权利改变邮件用户代理瀑样通道(图gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba、通道O1和O4)。然后我们调查了邮件用户代理是否在瀑样调制了LFP瀑样和主机周围皮层通过分析锁相(PLV)的邮件用户代理LFP值。PLVs接近零显示邮件用户代理事件随机LFP阶段,而PLVs等于1表示邮件用户代理事件与LFP同步信号。Buzsaki et al。gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba建议“验证本地信号的性质总是需要演示的联赛之间的相关性和局部神经元活动。”因此,我们进行了锁相分析调查当地锂离子的性质。示范阶段锁定联赛和邮件用户代理之间,我们验证了当地渠道,支持我们的联赛与透明电极记录主要记录在本地生成的神经活动。以前的研究已经表明PLVs增加或减少在光刺激gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}和搅拌gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba在体内实验中与完整的皮层。我们观察到PLVs增加δθ乐队在皮层和瀑样通道(下面点痕迹表明引导95%置信区间)(图gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)。的MUA-theta PLV时期刺激与倍没有刺激进一步的可视化绘制5赫兹(中心4 - 6赫兹θ乐队)LFP阶段在每个邮件用户代理飙升径向直方图(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba,gydF4y2BangydF4y2Ba= 60个频道O4和峰值gydF4y2BangydF4y2Ba= 67频道C7峰值)。确定邮件用户代理的空间范围相锁定,我们比较邮件用户代理渠道O4事件和C7联赛在所有16频道。在视觉刺激,邮件用户代理瀑样和皮层频道的信号显示显著增加锁相的θ乐队LFP在电极信号通道接近感兴趣的频道(邮件用户代理在哪里测量)和最强烈地接近通道附近的视觉皮层(图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba引导,星号标记95%置信区间的显著增加刺激与non-stimulated PLV)。瀑样的重大改变锁相类似于周围皮层和只发生在刺激,这表明瀑样形成功能性突触连接鼠标与周围的皮质。这些突触连接后来被证实使用事后免疫荧光染色对人类细胞质(STEM121),人类的核仁(nm - 95),突触后密度(PSD95),和人类——(hSyn)和non-species-specific synaptophysin (Syn)标记。gydF4y2Ba

移植麻醉相比,主机皮层瀑样反应不同gydF4y2Ba

看到功能对感官刺激的反应和移植活动激增的调制瀑样在清醒的录音,我们接下来问麻醉如何影响自发的神经活动瀑样与周围的皮质。像adult-born海马神经元融入已有的神经网络和嗅球gydF4y2Ba^{43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba},我们假设瀑样异种移植最初接收主要地方输入而长期预测,例如,从丘脑核和neuromodulatory中心,主要是缺席。作为麻醉已被证明影响远程预测,皮层的活动gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba,我们假设异种移植瀑样麻醉而表现出一种不同类型的活动主机皮层。在这里,我们分析了爆炸抑制的交替模式的特点是高LFP活动(破裂)和相对沉默的时期(抑制)gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba与1.5%异氟烷麻醉引起的(见,例如,补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。在代表记录执行植入后3周,无花果所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,六个通道被标记为覆盖瀑样和八个覆盖大脑皮层(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。异氟烷麻醉诱导减少大瀑样与周围皮层的神经活动,这是更严重的伽玛乐队与远程神经调节有关gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4罪犯gydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。归一化功率比表现出更大的对比度麻醉和清醒状态相比,尤其是对更高频率(图更加突出。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。较弱的活动瀑样相比,皮层的活动可以解释为缺乏胆碱能神经支配,这与γ相关联的活动gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。在清醒状态,瀑样活动总体上低于周围皮层为特定的频带(图没有选择性。gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba)。因此,瀑样反应不同的麻醉和周围的皮质。我们的研究结果表明,瀑样细胞adult-born类似于神经元的刺激活动与当地神经元但缺乏长期的预测gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

瀑样移植血管的主机和融入周围的皮质gydF4y2Ba

检查形态整合皮质瀑样与周围宿主组织,包括宿主血管的血管化,我们使用体内双光子成像和事后疣状。在每次录音时,植入网站的宏观结构是使用brightfield立体显微镜检查畅通由于透明度的微电极(见,例如,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。植入九到十周后,小鼠进行了双光子显微注射后血管内示踪Alexa萤石680右旋糖酐gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba。瀑样植入地区所有六个老鼠包含鼠标脉管系统。代表产生的双光子成像图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。后获得低放大率的地图整个曝光(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba(左),我们获得了高分辨率的Z栈内植入区域(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba中心)和周围皮层(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,对吧)。瀑样清晰可见的血管化,确认集成到主机皮质组织(见补充视频gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba的3 d投影区域内植入血管)。瀑样血管密度较低的地区相比,周围的皮质,在我们之前的研究中观测到的gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

8 - 11周后植入、动物牺牲,和大脑进行组织学分析与抗体检测人体细胞(nm - 95抗体特定人类核仁),内皮细胞(CD31)和神经核(NeuN)。我们发现纳米- 95阳性(即。,human) cells in all animals and noted some variability in the xenograft size across animals. Figure5 bgydF4y2Ba显示了一个代表日冕部分nm - 95染色后从一个动物。瀑样的区域注入染色明显nm - 95,确认人类细胞存活小鼠皮层为整个实验持续时间。一些纳米- 95阳性细胞迁移距离植入网站(6老鼠,无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba,对吧)。人体细胞检测到4毫米的植入网站迁移沿胼胝体(补充图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。在相邻的部分内皮细胞染色(无花果。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba),我们观察到血管遍历异种移植,这是符合我们体内双光子显微镜结果和显示了异种移植的血管化。NeuN co-staining与苏木精显示~ 48%瀑样贪污了神经细胞的表型的最后一次记录(图。gydF4y2Ba5 d, egydF4y2Ba)。瀑样细胞的神经元表型检测进一步支持的psd - 95瀑样区的突触后密度标记发现这是一个只在兴奋性神经元突触(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba。额外的染色nm - 95 (Ki67),增殖细胞和少突胶质细胞(Olig2)产生了瀑样成分组成的人类细胞~ 82%,7% ~ 5%增殖细胞,~少突胶质细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,无花果。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

最后,为了研究突触瀑样和皮质之间的连接,我们进行免疫荧光染色对人类核仁(nm - 95), pre-synaptic囊泡蛋白synaptophysin (Syn)和突触后密度(PSD95)。在无花果。gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba,我们检查了Syn(红色)和PSD95与人类细胞(绿色)(白色)(粉红色)划定的边界的移植瀑样(组织)和视觉皮层(视觉),(粉红色)划定的边界瀑样和retrosplenial皮层(RSC),并在胼胝体(CC)。我们观察到清晰的co-localization瀑样细胞和突触后标记的边界和鼠标视觉皮层(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba箭头),retrosplenial皮层(无花果。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba箭头),胼胝体(无花果。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba箭头),表明突触连接。此外,我们调查是否synaptophysin瀑样是内鼠标或人类起源和评价双向之间的突触连接异种移植瀑样和主机小鼠皮层后对免疫荧光分析。我们所知,没有mouse-specific synaptophysin标记,所以我们进行三重人类细胞质染色(STEM121), Syn和人类synaptophysin (hSyn) (gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)。关注Syn和hSyn的重叠,我们可以确定哪些突触前puncta是人类的起源。剩下的puncta标记阳性Syn但不利于hSyn算作突触前puncta鼠标的来源。图gydF4y2Ba6 d, egydF4y2Ba显示了突触前puncta和瀑样瀑样100µm视觉皮层内神经元预测边界瀑样中心,分别。我们观察到鼠标突触前puncta(空心箭头)与附近瀑样预测的边界(图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba(图)和中心。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba瀑样的),这表明老鼠神经元形成pre-synaptic瀑样连接。突触前puncta量化人类和小鼠的密度,我们观察到明显更大的密度边界的鼠标puncta瀑样中心相比,可能由于靠近小鼠皮层,和更大的密度的人力puncta瀑样的中心和边界相比,可能由于色散的人类细胞形态学结合小鼠皮层(图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)。我们也观察到人类突触前puncta STEM121染色在鼠标附近的视觉皮层瀑样的外缘(补充图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。我们的观察的鼠标突触前puncta瀑样和人类突触前puncta小鼠皮层的支持,最终的录音的时候,瀑样和鼠标视觉皮层双向突触连接。鼠标突触前puncta瀑样提供了证据的突触连接瀑样来生成所需的功能对视觉刺激的反应,如电生理记录观察到的。gydF4y2Ba

最近多能干细胞技术的进步使得代神经细胞系和皮质瀑样从hiPSCs孤立的外围组织(例如,皮肤活检)。虽然这些瀑样像一些功能的人类大脑的早期发展阶段,缺乏自然的大脑微环境培养瀑样可以影响重组的表型和成熟神经元。以前,我们已经表明,移植的人类大脑皮层瀑样到成年小鼠大脑导致他们进一步分化和形成血管gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba。在目前的研究中,我们进一步推动这个范式,引入光学透明石墨烯电极微阵列,使多通道纵向监测神经元活动的嫁接和周围宿主神经电路。这个设置允许我们检查形态整合瀑样皮质和揭示瀑样功能整合与内生感觉皮层。与传统的金属电极,我们不会有一个清晰的视野检查瀑样贪污和靠近感觉皮层无需拆卸电极和扰乱植入网站。这种组合的干细胞和neurorecording技术打开调查人工神经网络级功能障碍的潜在发展机会大脑疾病和瀑样可以提供好处神经假肢恢复失去了大脑不同区域的功能。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明,石墨烯微电极的植入并不妨碍发展和异种移植的血管化,并允许检查LFP和邮件用户代理神经元活动随着光学成像,包括双光子显微镜。使用这种技术,我们展示了一些差异瀑样的功能对感官刺激的反应。虽然LFP信号代表产生的细胞外的潜力空间集成几个机制包括突触传递,动作电位,内在水流和ephaptic传导,其位置和空间特异性取决于频率范围。我们验证了联赛的位置(1)关联联赛的邮件用户代理,(2)检查锂离子信号的时间延迟,(3)分析高频联赛,和(4)执行独立分量分析(ICA)作为我们的一个预处理步骤。这些分析表明,锂离子由通道记录和邮件用户代理信号重叠的瀑样都是由人类的活动产生的神经元。邮件用户代理事件的锁定联赛的渠道更接近人类视觉皮层提供了进一步的证据,参与了神经元网络响应的视觉刺激由于形成突触连接用鼠标皮层。的振幅trial-averaged联赛和自发的邮件用户代理峰值也随着时间的增加,表明改进的耦合瀑样的微电极阵列。根据与1.5%异氟烷麻醉,我们观察到选择性降低γ在瀑样活动与周围的皮质。放射性与胆碱能神经调节有关gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba。假设低胆碱能神经支配的异种移植相比,皮层,抑制胆碱能活性的麻醉瀑样将不成比例地降低γ力量相对于主机皮层。事实上,它已经表明,adult-born神经元获得第一个本地和后来的远程连接gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。麻醉剂的作用机制有很大的不同,影响大脑皮层的活动gydF4y2Ba^{51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba}和调查其他麻醉剂的影响异种移植瀑样将是一个有趣的未来应用这种方法。gydF4y2Ba

我们实验的成功依赖于工程柔性透明石墨烯设备。这个设置允许我们保持长期植入微电极阵列在鼠标皮层的电生理记录图像瀑样的能力植入网站在任何时间。为此,我们设计了一个轻量级headpost组装的保护性外壳连接石墨烯阵列数据采集系统通过ZIF连接器在录音。随着融合与玻璃窗插入数组,本届大会提供机械稳定性和耐用性在长期植入老鼠。本研究旨在获得组织学验证体内异种移植11周后的录音和成像;实验将在未来。这种技术的另一个未来的方向可能是利用电极的透明度,通过融合钙成像可视化飙升活动瀑样神经元或狂犬病病毒的轴突逆行追踪瀑样和鼠标皮层之间的预测和其他人与体内的细胞则展示了gydF4y2Ba^{53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba}和球状体体外gydF4y2Ba^{55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba}。这些方法没有建立特定细胞系为我们这个实验的时候,但可以开发,以供将来使用。gydF4y2Ba

而移植的人类在老鼠大脑皮层瀑样仍在起步阶段,我们的研究需要一步这个生物模型系统的综合功能评估。进一步沿着这条路,我们设想,这种干细胞和neurorecording技术的结合将用于建模疾病在生理条件下的神经回路,检查候选人治疗特定的遗传背景,和评价瀑样的潜在恢复特定的损失、退化或受损的大脑区域一体化。gydF4y2Ba

动物保健gydF4y2Ba

所有动物实验中描述本研究进行了按照美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物和被批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)加州大学圣地亚哥(协议S14275)。拥有非肥胖糖尿病(NOD) /重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠,年龄6 - 8周,从杰克逊实验室购买(JAX股票:001303)。在这项研究中,雌性老鼠8 - 12周的年龄。在标准条件下热压处理过的动物被关在笼子里(20 - 22°C,相对湿度40 - 60%)在12 h与随意光/暗周期获得食物和水。gydF4y2Ba

皮质瀑样代gydF4y2Ba

所有实验后批准和执行机构审查委员会(IRB)和胚胎干细胞研究监督(ESCRO)指导方针和规定。hiPSCs (WT83)用于生成皮质瀑样是从biopsy-derived皮肤成纤维细胞重新编程的gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。成纤维细胞从正常捐赠个人知情同意后适当的经批准的协议加州大学圣地亚哥机构审查委员会(# 141223 zf)。hiPSC殖民地培养Matrigel-coated菜(美国BD-Biosciences,圣何塞,CA)和美联储每日mTeSR1(干细胞技术,加拿大温哥华)~ 7天与1:1分离Accutase(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA): PBS。hiPSCs被镀成six-well板(~ 4×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/)mTeSR1补充10µM SB431542 (Stemgent、剑桥、马、美国),1μM Dorsomorphin(研发系统,明尼阿波利斯,美国),和5µM y - 27632(美国马EMD-Millipore,伯灵顿)和培养瓶之后暂停(95 rpm 37°C)。形成球体喂养mTeSR1(10μM SB431542和1μM Dorsomorphin) 3天后跟Media1 [Neurobasal(技术),1 x Glutamax(技术),2% Gem21-NeuroPlex(双子座生物制品、萨克拉门托、钙、美国),1% N2-NeuroPlex(双子座生物制品),1%的非必需氨基酸(NEAA;生命技术),1%青霉素和链霉素(P / S;生命技术),10μM SB431542, 1μM Dorsomorphin] 6天,每隔一天;1 x Glutamax Media2 (Neurobasal, 2% Gem21, NEAA 1%,和1%的P / S)与20 ng / mL FGF-2(技术)为7天,每天;Media2 20 ng / mL的FGF-2和EGF(美国新泽西PeproTech,落基山)6天,每隔一天;脑源性神经营养因子的镇定和Media2 10 ng / mL, GDNF,和NT-3(所有PeproTech), 200年μM L-ascorbic酸(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和1毫米dibutyryl-cAMP (Sigma-Aldrich) 6天,每隔一天。皮质瀑样随后被维护在Media2没有补充到使用。两个皮质瀑样用于移植。gydF4y2Ba

手术植入瀑样和石墨烯微电极阵列gydF4y2Ba

Headpost植入,颅骨切开术、瀑样植入和石墨烯微电极阵列植入进行一个手术。手术前12到24小时,动物收到0.53毫克/毫升磺胺甲恶唑、甲氧苄氨嘧啶0.11毫克/毫升、和40毫克/毫升布洛芬通过他们的饮用水。四个小时手术前,动物收到一个注入4.8毫克/公斤地塞米松(i.p)。对麻醉动物收到50毫克/公斤的鸡尾酒氯胺酮和甲苯噻嗪5毫克/公斤与0.1 -1%异氟烷氧补充手术期间。麻醉诱导后,动物收到单剂量为0.05毫克/公斤丁丙诺啡(南)和500毫克/公斤头孢唑啉(i.p)。脱毛后,头皮被消毒betadine和异丙醇。五十µL 2%利多卡因渗透入皮肤覆盖头骨。皮肤切除后,骨头被清理过,皮肤是附着在骨在伤口边界使用cyanoacrylate胶(VetBond)。然后,头骨被蚀刻60年代有35%磷酸凝胶(克尔牙科),这是被与无菌0.9%氯化钠溶液洗涤。然后,薄薄的一层粘合剂(OptiBond,克尔牙科)应用于骨与紫外光固化。 The headpost was attached with dental adhesive (Tetric Evoflow). For electrophysiology recordings, a reference electrode (#000 micro-screw) was implanted over the olfactory bulb and secured with dental adhesive. Then, a 3.5-mm diameter round piece of bone overlaying the implant region was removed with a dental drill. After dura mater removal, a ca. 1-mm diameter large piece of retrosplenial cortex overlaying the superior colliculus (−3.5 mm relative to Bregma, +0.75 mm relative to midline) was removed by aspiration. After stopping any bleeding from the aspiration site, a single organoid was placed inside the void. A graphene microelectrode array with 16 channels was bonded to a glass plug consisting of two 3-mm and one 5-mm coverslip glass and placed on top of the craniotomy, which was then sealed with dental adhesive (Tetric Evoflow). A holding cap^57gydF4y2Ba附加到headpost保护暴露和微电极阵列电线,而家里笼子里的动物;这是移除在实验。动物在手术结束时,收到一个注入100µL 5%葡萄糖氯化钠0.9%。动物收到0.05毫克/公斤丁丙诺啡(南)术后3天,和0.53毫克/毫升磺胺甲恶唑、甲氧苄氨嘧啶0.11毫克/毫升、饮用水和40毫克/毫升的布洛芬手术后5天。治疗0.53毫克/毫升饮用水中磺胺甲恶唑和甲氧苄氨嘧啶0.11毫克/毫升是手术后持续3 - 4周。gydF4y2Ba

石墨烯微电极阵列制造gydF4y2Ba

下面我们之前制造协议gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba}50-µm-thick聚二甲基硅氧烷(PDMS) spin-coated到4英寸硅片和退火150°C 10分钟。PDMS-coated晶片被用作粘合剂层保持衬底平面在随后的制造步骤。Fifty-µm-thick宠物在PDMS的电影被一个电极阵列基板。10纳米的铬和100海里的黄金被气急败坏的说到使用丹顿发现18溅射的宠物系统。金属线是用光刻和湿蚀刻图案(黄金腐蚀剂的TFA、铬腐蚀剂1020 ac)。单层石墨烯是转移到晶片使用泡沫传输方法gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba。设备是一夜之间在室温下晾干,然后在125°C烤5分钟退火PMMA基片皱纹增加石墨烯和宠物衬底之间的结合。移除PMMA,晶片浸泡在丙酮与温柔的吸量为20分钟,然后浸在互异丙醇,去离子水在30年代周期10分钟。石墨烯接触垫图案使用PMGI / AZ1512双分子层光刻和氧等离子体蚀刻(等离子体蚀刻PE100)。从石墨烯表面,去除有机残留物四步清洗方法:(1)浸泡的晶片AZ 1-Methyl-2-pyrrolidon 5分钟,(2)浸泡剂PG的晶片5分钟,(3)的晶片在丙酮浸泡10分钟,和(4)清洗晶圆与交替的去离子水和异丙醇在30年代增加10分钟。步骤1和2删除AZ1512 PMGI,分别。步骤3和步骤4删除任何剩余的有机残留物的晶片表面。数组被封装与7-µm-thick SU-8 2005 spin-coated到晶片和暴露在紫外线下模式有源电极面积空缺。最后一个干净的晶片使用10分钟的交替去离子水和异丙醇。然后,晶片烤20分钟从125°C和逐渐增加的温度到135°C到密封SU-8封装层。 The PET substrate was peeled from the PDMS-coated wafer and the arrays were cut out for electrochemical characterization and implantation in mice.

电化学表征石墨烯微电极阵列gydF4y2Ba

电化学阻抗谱(EIS)执行与Gamry参考600年0.01稳压器磷酸盐(Sigma-Aldrich P3813干粉溶解在去离子水)。使用三电极配置与Ag / AgCl作为参比电极,铂对电极。EIS测量从100 kHz到1赫兹在开路电位。整个电极配置系统是放置在一个白手起家的法拉第笼,消除噪音。gydF4y2Ba

电生理学数据记录gydF4y2Ba

动物和5%异氟烷麻醉(感应),维护保持在1.5%。在麻醉下,他们接受了头部固定,保护帽被免职,数组连接到记录设置。录音5 - 10分钟后在动物麻醉,麻醉了,动物可以恢复。ca。10分钟后,记录仍在继续。gydF4y2Ba

电生理记录进行RHD2000放大器板和RHD2000评价体系(Intan技术)。采样率设置为20 kHz,直流偏置与记录系统的内置过滤删除超过0.1赫兹。Intan数据导入MATLAB (MathWorks)和分析使用自定义脚本。gydF4y2Ba

视觉光刺激gydF4y2Ba

一项白光LED是连接到一个光缆提供光刺激。光源放置~ 1米远离动物和电生理学记录设备,避免串扰和电噪音。光纤电缆的顶端放置~ 3毫米从动物的侧眼睛照亮整个眼睛。5 - 100 ms光脉冲(即。,photic stimulation) were delivered at frequencies of 1, 2, 5, 10, 15, 55, and 85 Hz for intervals of 1–5 s with 10–20 repetitions per experiment. Stimulation was controlled through a DAQ system (National Instruments) driven by custom-written MATLAB codes. To synchronize stimulation and recording, a stimulus-locked trigger signal was delivered from the DAQ system to the Intan recording system.

视频录制gydF4y2Ba

在实验中,动物的录像进行检测身体,须运动。一项白光LED是放置在相机的视野,用于同步录像和审判触发电生理学记录和刺激。gydF4y2Ba

双光子成像gydF4y2Ba

动物麻醉与3 - 5%异氟烷氧和接受静脉注射100µL Alexa 680 -葡聚糖。动物被放置在记录平台加热毯。异氟烷麻醉持续了1.5%的氧气。图像获得使用一个天涯双光子激光扫描显微镜系统力量荧光显微镜配备一个超二世飞秒钛:蓝宝石激光(相干)耦合到一个光学参量振荡器(变色龙详细的紧凑、连贯)调到1240海里。Alexa萤石680年使用GaAsP成像探测器(H7422P-40滨松)。我们使用一个×4目标(XLFluor4x / 340 NA = 0.28,奥林巴斯)获得的低分辨率图像曝光。×20水浸客观(XLUMPlanFLNXW, NA = 1.0,奥林巴斯)是用于高分辨率成像。显微镜是利用PrairieView软件操作(力量)。gydF4y2Ba

电生理学数据分析和统计gydF4y2Ba

数据分析了在MATLAB (Mathworks v2019b)。执行图准备与插画家(Adobe,版本25.2.3)。数据预处理去除常见工件从清醒小鼠运动,60赫兹电力线路噪声,使用独立分量分析和共享卷进行信号EEGLab玉算法gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba}。电极阻抗高于4 MΩ被排除在分析之外。提取局部场电位(联赛),原始电生理记录被低通零相位滤波低于250赫兹使用一个八阶切比雪夫滤波器(designfilt。米,filtfilt.m)。提取多部件活动(邮件用户代理),原始数据是0.5和3千赫之间的带通滤波使用第六阶切比雪夫滤波器(designfilt。米,filtfilt.m)。邮件用户代理权力计算了全波整流,然后低通(< 100 Hz)过滤邮件用户代理。邮件用户代理力量平均后被刺激和峰值信噪比(信噪比)被计算为10 *日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(峰值/基线)与基线的平均功率刺激发病前1 s。对于光谱分析,谱图使用Morlet小波频谱分析是计算整个录音(10或20试验)和审判平均在每个记录光刺激后计算(补充图。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。每个联赛的山峰开始确定为每个电极通道(findpeaks.m)和彩色地图可视化表示的振幅和抵消了整个大脑的信号传播和电极阵列。统计学意义的延迟乘以被洗牌16通道延迟计算1000次,平均和标准偏差的计算延迟时间之间的通道配对,然后利用学生的一个样本,两面t测试(ttest.m)来计算gydF4y2BapgydF4y2Ba价值。邮件用户代理分析,邮件用户代理事件被检测到的点的邮件用户代理信号交叉−−3 4倍标准差阈值(根据记录信噪比)。事件驱动的邮件用户代理平均是通过计算目标通道的邮件用户代理事件时间和所有16通道,计算平均邮件用户代理波形从1女士之前2女士之后每个目标频道的事件。邮件用户代理事件重叠是由装箱邮件用户代理事件到1毫秒箱然后计算跨频道重叠事件的数量。意义计算通过随机改变事件的一个频道10000次,计算重叠的数量对另一个频道gydF4y2BapgydF4y2Ba值作为移位的重叠的次数计数超过未作平移变换的病例数。在每个阶段的联赛频率谱分量的计算从1到250赫兹和频率测定使用球方法(mtspecgramc修改功能。米,Chronux工具箱gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba})(时间带宽积3 - 5、5 - 9小蜡烛,零填充,和1 s窗口大小),和锁相值(PLV)计算了圆形的绝对值平均每个邮件用户代理事件计算的各个阶段(1000 - 2000年引导的样本大小50事件从每个采样试验包含60 - 100峰值)。PLVs引导95%置信区间被认为是重要的。然后,转接插座阶段为每个频率LFP在邮件用户代理事件相比,在相同的频道和频道之间进行比较。阶段是平均和策划作为极地直方图(频道)和颜色阴谋(跨渠道)显示每个通道的邮件用户代理之间的关系和所有其他渠道的阶段。瑞利的不均匀性进行了测试使用循环统计为MATLAB工具箱gydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}。PLV分析是对领导的刺激和关闭之间的间隔比较PLV刺激参数。对于麻醉分析,每个频带的平均功率(使用Morlet小波频谱分析计算)计算每个电极通道。然后,瀑样的平均力量和皮层渠道每个频带使用学生的两个示例,计算和比较了片面的t检验(ttest2.m)。gydF4y2Ba

组织学和免疫组织化学gydF4y2Ba

8 - 11周后植入,老鼠牺牲和灌注transcardially (PFA Heparin-PBS,那么4%与2%蔗糖)PBS。大脑被PFA和固定在4%与2%蔗糖PBS 12 - 18 h。固定后,大脑放入20%蔗糖约2周,然后转移到0.01 M磷酸盐处理之前免疫组织化学(包含IHC)。大脑是脱水和嵌入在石蜡。60到百冠状切片生成瀑样植入的地区使用切片机切5µm厚度。片被沾染了抗体NM95 /人类核仁(施用,Abcam ab190710), NeuN(施用;EMD微孔)、CD31(施用,Dianova), STEM121(豆类,Y40410;1:75),hSyn(英杰公司14-6525-80;1:750)或总synaptophysin(表达载体ma1 - 213;1:3000)。 Slides were stained on a Ventana Discovery Ultra (Ventana Medical Systems). Antigen retrieval was performed using CC1 (Tris-EDTA based buffer with pH 8.6, Ventana Medical Systems) for 24–40 min at 95 °C. Primary antibodies were incubated on the sections for 32 min at 37 °C. To minimize mouse-on-mouse non-specific staining issues, sections were incubated with a rabbit anti-Ms (IgG1, IgG2a, IgG3; Abcam ab133469; 1:1000) and then detected with a tertiary HRP polymer-linked anti-Rb (OmniMap; 05266548001; Ventana Medical systems). For immunohistochemistry, antibody presence was visualized used diaminobenzidine as a chromogen followed by hematoxylin as counterstain. Slides were rinsed, dehydrated through alcohol and xylene and sealed with a coverslip. A parallel set of sections was stained for H&E. For multi-channel IF, sections were stained sequentially with an antibody stripping step between each antibody/fluorochrome pair using the TSA-Alexa fluor dyes (Alexa 488, 594, 647). Slides were scanned with a slide scanner (Axio Scan.Z1, Carl Zeiss AG). Confocal images were acquired using a Leica SP8 confocal microscope at the University of California at San Diego Neurosciences Microscopy Core. Immunofluorescence images were analyzed using Leica Microsystems LAS AF Lite (Version 2.6.0 build 7266). Immunohistochemistry images were analyzed using ZEN 3.2 (blue edition, Carl Zeiss Microscopy GmbH). Individual immunofluorescence channels of merged images were brightness adjusted for better visualization (linear LUT with approximately 10 minimum and 150 maximum). Immunohistochemistry images were adjusted to set gamma approximately equal to 1 for better visualization.

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba