HSFA1a调节植物热应力响应和改变了3 d染色质组织enhancer-promoter交互gydF4y2Ba

线性基因组的概念已经被一个新兴的理解高度复杂和动态的三维组织细胞核内的染色质gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba}。染色质是一个紧凑,multiscale-organized和动态结构:在真核生物中,DNA缠绕在组蛋白八聚物(H3, H4, H2A、H2B)gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba再次,这种结构折叠形成染色质循环、领域和地区,组织基因组多尺度gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba。定义染色体占领领土在细胞核内,所显示的三维荧光原位杂交(3 d-fish)由高通量方法和染色体构象捕获(高c)显示优惠每个染色体本身的交互gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

在哺乳动物中,染色体进一步组织到拓扑关联域(TADs)基因组区域优先形式相互联系而不是周围的序列。TADs提出了允许协调监管的基因位于泰德内通过允许接触远端管理序列的泰德和限制其访问序列外的小男孩;尽管这种模式仍在争论gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。协会“染色质隔间”形式。活动(一)车厢代表活动染色质组蛋白标记定义的活跃,高密度的基因,转录率升高由高RNA聚合酶II (RNAPII)活动。相比之下,B部分代表不活跃的染色质的组蛋白标记所定义的,DNA甲基化,增加了转位因子的数量gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}。在规模较小,染色质循环的形成与启动子区域汇集了远端管理序列,从发起人或隔离gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba。这些短和远程交互调节邻国和遥远的基因的表达gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。染色质循环可能涉及自动调节转录因子(TFs),召集他们结合的基因组区域gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

所有这些组织水平定义在动物和植物中观察到:A和B隔间沿着基因组交替,主要隔间在端粒的地区和B隔间pericentromeric地区各种作物物种gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。然而,植物染色质组织展示了几个动物的区别。首先,植物TAD-like结构表示只有25%的大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba)基因组gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba75%的人类gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba。然而,这种低的TADs大米是目前我们如何定义TADs,可能的结果不能反映植物基因组的特点gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。同样在小麦(gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba),TAD-like结构对应于大型高纯度异染色质域转座的元素,而不是重新组基因gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。术语“基因间的凝聚间距器”(图标)提出了描述这些结构,因为他们似乎凝结沉默染色质之间允许循环形成基因以外的图标,形成转录工厂。其次,机制控制染色质折叠植物和动物之间的不同。在动物身上,cohesin复合物挤出染色质通过环状的形状,直到染色质结合两个收敛在特定CTCF CTCF蛋白质结合位点,定义边界gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。然而,植物基因组显然缺乏CTCF同系物,因此如何TAD-like域结构在植物尚不清楚。gydF4y2Ba

尽管染色质结构的总体结构是非常健壮的器官和生长条件,详细分析了染色质折叠显示在开发过程中可以调制gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba根据细胞类型gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba或者在应对环境的变化gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。在植物,一些染色质结构的变化,以应对各种压力可能协调全球转录组修改适当的细胞和生理反应。染色质构象对基因调控的重要性在应对环境压力gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已经被很好地记录下来了gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}。然而,以及应力诱发染色质重组作物是否不太理解,只有少数研究检查了工厂应对温度变化。水稻染色体decondense冷应激下,减少远程交互超过1 Mb和a - b室增加互动gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。相反,暴露在热应力降低了a - b之间的短程相互作用隔间,一和b室的相互作用降低gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

基因表达也由机构或分离控制远端监管之间的交互元素(REs)和推动者,如enhancer-promoter交互。在植物,这样的远程启动子之间的相互作用和远端管理与大型基因组序列中最突出的物种,如玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba)gydF4y2Ba^{23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。调制这些相互作用对压力的反应可能功能相关,已被证明在果蝇gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba和人类细胞gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba,但基本上仍是无人涉足的植物。gydF4y2Ba

在这里,我们研究了chromatin-based监管RE-promoter接触和核DNA重组如何影响基因表达。为此,我们捕捉到这些联系人使用时间进程的时序动态分析茄(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba)在热应力(HS)。我们发现商品产生深刻的变化在染色质的可访问性,以及动态启动子之间的相互作用和远端>我们进一步表明热休克因子(HSF) TF HSFA1a大师转录监管机构热应激反应的植物gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba,起着关键作用的动态形成promoter-enhancer接触加热在几个位点的反应。这些结果让我们提出一个模型改变染色质的可访问性和约束力的HSFA1促进promoter-enhancer接触诱导基因表达的形成以应对海关。gydF4y2Ba

番茄染色质高度封闭和围绕转录工厂gydF4y2Ba

探索番茄染色质结构,我们执行一个immuno-detection实验间期体细胞核使用抗体针对两个不同的组蛋白修饰,9组蛋白H3赖氨酸乙酰化作用(H3K9ac)和组蛋白H3赖氨酸27 monomethylation (H3K27me1),分别与转录活性染色质和结构异染色质。Immuno-staining透露这些标记并不是均匀分布在细胞核,表明不同的常染色质和异染色质隔间茄:常染色质发生在核的中心结构异染色质发生在核外围(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

提供高分辨率的染色质结构的西红柿,我们执行高c,一个全基因组检测dna dna的物理相互作用的方法gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba。我们观察到在主对角线一个强烈的信号,表明频繁的相邻位点(图之间的相互作用。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。高c图还显示一个强大的区分隔离结构异染色质和常染色质。评估的能力基因组区域形成一个特定类型的区划的域与特定的表观遗传特性,我们生成的皮尔森相关映射排序由多个染色质景观。为此,我们重新排序相关矩阵的行和列,而不是根据他们的位置安排在线性序列,我们安排箱通过增加信号的选择功能。值得注意的是,当排序根据PC1值(A和B之间的歧视隔间),10号染色体的矩阵显示清晰的分离到两种类型的区划的域(无花果。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)。这些结果强调,组蛋白是强烈与预测番茄的区室化结构。此外,集成高c交互矩阵与RNAPII染色质免疫沉淀反应结合测序(ChIP-seq)在不同的决议显示基因组之间的交互热点箱子包含积极转录基因,表明番茄染色质围绕转录工厂(补充图。gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)。我们使用anti-RNAPII抗体进行免疫染色实验和观察RNAPII焦点(补充图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。为进一步验证转录工厂的出现,我们进行了HiChIP实验中,一个敏感的方法来分析protein-centric染色体构象,使用一个anti-RNAPII抗体gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。这些分析证实,活跃茄在很大程度上是围绕染色质转录工厂(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba),如前所述在小麦gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

热应力强烈影响全球染色质的组织gydF4y2Ba

理解环境压力对番茄的影响染色质三维组织和基因表达,我们我们的分析集中在商品,影响这两个组件在不同的植物物种gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。为此,我们番茄植物暴露于高温(补充图1和6小时。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),这些时间点选择基于HS早期反应基因的表达gydF4y2BaHSFA2gydF4y2Ba1 h(暴露后达到顶峰,回到基础水平4到8 h后(补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。我们下一个执行RNA-seq获得全局视图的商品引起的基因表达的变化。我们发现与控制条件相比,一个小时的HS诱导基因的表达被认为与HS(补充图的反应。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。可视化动态基因表达模式,我们应用一个无监督,自组织映射(SOM)的机器学习方法gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}揭示差异表达基因之间的相关性(度)在多个治疗(补充图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。值得注意的是,这种分析显示,很大一部分的度HS一小时后恢复其表达原来的6小时后表达水平(补充图。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba)。确定在多大程度上影响染色质结构HS茄,我们测量核大小后0,1,6 h HS,发现原子核大小增加热处理后(补充图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

测试如果染色质结构重组和基因表达变化相关,热应力下我们进行了高c实验使用相同的条件用于转录组分析。定义HS对染色质结构的影响,我们测量的相对作用差异100 kb的决议(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。目视检查显示,植物暴露于海关,内的交互结构异染色质减少而常染色质内几乎没有观察到变化。量化这些影响,我们生成的扩展块交互频率在100 kb决议对基因组距离控制和热强调植物。我们发现商品减少引起染色质结构异染色质区域的交互而染色质交互在常染色质增强(图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。这些观察表明,消极地影响热的力量结构异染色质的分隔,常染色质和积极影响。尽管如此,我们不能排除这样一种可能性,即轻微增加交互检测的数量常染色质可以减少异染色质的相互作用的结果,这将增加机械的测序深度常染色质的交互。为了验证这一点,我们生成的鞍情节来衡量的程度(常染色质)和B(结构异染色质)隔间隔离在细胞核中。我们发现海关积极影响一相互作用和负面影响(图b交互。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。然而,我们综合RNA-seq 5 kb分辨率和高c数据在海关时间进程,发现HS度居住在域的分辨率高c不允许观察重大变化(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba通过intradomain),这表明监管动态可能发生接触。为了验证这个假设,我们使用ATAC-seq染色质标识访问网站识别假定的REs,可能身体与启动子的HS度(无花果。gydF4y2Ba2 f - kgydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。染色质易访问性的动态可视化模式在整个商品时间进程,我们应用一个无监督,SOM机器学习方法gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)。染色质易访问性模式由热应力动态修改,展出时间重新激活的变化。因为这些监管序列可以为成千上万的碱基对上游或下游基因的调节,一个简单的染色质可访问性和基因表达之间的联系可能并不总是准确的。因此,我们因此分类的所有访问染色质山峰分为两类:那些在1.0 kb转录起始点的上游(TSS-proximal)和那些远离基因(TSS-distal)。我们集中分析TSS-proximal峰值。使用聚类方法基于染色质水平的可访问性,我们确定了五个集群(我到V)(图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。染色质易访问性是必要的,但不充分,诱导基因的表达,这也是由组蛋白修饰和招募了TFs的可用性gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba。我们发现近端REs积极与相关基因表达的可访问性(无花果。gydF4y2Ba2 h,我gydF4y2Ba)。ATAC-seq的时间进程分析可以揭示顺序TF结合基于特征染色质的足迹。因此我们使用访问染色质HS时间进程的数据来确定分层基因调控网络调制热(图。gydF4y2Ba2我gydF4y2Ba)。我们发现,热应力转录因子(HSF)和其他家庭特遣部队(小块土地,Myb-related和AP2)只调节后不久HS(无花果。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba),而从乙炔TFs,同源框和TCP家庭表达下调后1小时的商品。此外,我们生成的特遣部队网络层次的考虑基因表达的变化以及具体TF结合位点的存在基因的启动子区域。我们发现在特定TF-binding染色质易访问性主题,它反映了TFs活动,恰逢窝藏易访问的结合位点的基因表达改变TF在启动子(图。gydF4y2Ba2 kgydF4y2Ba)。,我们的分析表明,TFs控制的顺序激活基因表达在热应激反应通过增加染色质易访问性:第一波的转录变化可能是由HSF和小块土地因素控制,并将涉及早期响应事件和第二波将随后发生的控制下WRKYs和安全和。gydF4y2Ba

远端和近端REs显示不同染色质签名gydF4y2Ba

活性物与特定组蛋白修饰在哺乳动物(例如H3K4me1和H3K27ac)gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}。来确定一个典型的染色质签名区分远端和近端REs茄,我们执行ChIP-seq控制和HS条件和分析水平的四组蛋白共价修饰之前与活跃转录:H3K4me3, H3K9ac, H3K18ac H3K27ac。我们发现,组蛋白的积累与这些修改商品(补充图下没有显著变化。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。然而,我们发现,核小体近端侧翼访问REs展示高水平的H3K9ac, H3K18ac, H3K27ac H3K4me3(无花果。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba,补充无花果。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。相比之下,核小体侧翼访问远端REs显示高水平的H3K9ac H3K18ac,适度H3K27ac和低水平H3K4me3(无花果。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)。这些数据,结合染色质易访问性数据,表明,核小体装饰着H3K9ac H3K18ac和缺乏H3K4me3可能表明活性增强剂在基因组的位置和可以用来注释增强器区域。gydF4y2Ba

在哺乳动物中,据报道,远端增强剂招募RNAPIIgydF4y2Ba^33gydF4y2Ba。我们假定这个特性也可以出现在远端活性增强剂。为了验证这个假设,我们执行RNAPII ChIP-seq番茄植物受到HS和分析其积累远REs特别活跃的商品后,在1小时。我们确定了大量的RNAPII结合位点tss附近也出现在我们发现的远端REs染色质分析(图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba,补充无花果。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。然后我们确定主题与这些HS-activated有关远端REs,发现近端和远端元素包含主题同样的TFs,表明相同的TFs可以绑定两个近端和远端REs(图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3 d染色质重组瞬变诱发promoter-RE应对海关的交互gydF4y2Ba

确定远端REs与推动者,我们进一步结合高c和捕获浓缩步骤(C-Hi-C),一个强大的工具来描述特定的染色质区域的空间和功能的关系。为此,我们生成的生物素化的RNA诱饵库专门针对212735启动子区域(补充数据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和执行C-Hi-C HS时间进程,揭示了不同染色质协会在海关。正如所料,C-Hi-C使识别大量的染色质联系,增加我们的分析的分辨率(补充图。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。有趣的是,我们发现,除了经典的1对1 RE-promoter联系人,我们观察到两种类型的交互暗示多个位点:(i)启动子与REs之一,被称为“promoter-centric中心”,和(2)一个与多个基因,名叫“RE-centric中心”(无花果。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba)。进一步剖析RE-promoter联系人的属性,我们进行了一次微分分析集成交互的数据控制和HS治疗。这一分析显示明显的动态变化(图RE-promoter不同类型之间的联系。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba补充数据gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)。远端REs被认为是进入物理接近他们的目标发起人通过染色质介导的三维循环结构蛋白如TFsgydF4y2Ba^{34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}。因此,我们假设RE-promoter染色质的力量相互作用可能与易访问性TFs的再保险和启动子。为了验证这一点,我们promoter-associated交互分为三类:(i)交互的锚都无法访问,(2)相互作用的只有一个锚是无法访问,和(3)交互的主持人都是可访问的。主播都是可访问的相互作用强度的交互作用强于只有一个锚或没有链接,访问(补充图。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。因此,HS诱发瞬态启动子/ RE交互与染色质易访问性的增加在网站。一起观察,近端和远端REs都浓缩在同一个TF结合主题分这些结果指向一个假定的DNA结合蛋白的作用如TFs促进或稳定这些交互。gydF4y2Ba

我们的综合分析显示,HSF绑定的主题是优等生中所涉及的REs promoter-enhancer交互后才1 h HS治疗。第一次详尽的概述HSF家族在植物中描述gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba,21个代表,属于三个类(A、B和C)根据寡聚化域的结构特点gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba。甲级hsf转录激活至关重要,而类B和C hsf没有激活函数,因为他们缺乏包含主题的酸性氨基酸残基gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba。以前的研究已经表明HSFA1a是主调节器的转录HS主要反应gydF4y2Ba^{27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}。有趣的是,以前的工作gydF4y2Ba美国lycopersicumgydF4y2Ba显示HSFA1a既是主调节器的HS和基底thermo-tolerance响应gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba。我们因此猜测HSFA1a可能涉及在早期HS RE-Promoter交互反应。为了验证这一点,我们首先确定HSFA1a绑定网站使用TF-DNA绑定试验称为DNA亲和纯化和测序(DAP-seq)gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba。这种方法显示大量(5034)的假定的HSFA1a结合位点(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。正如所料,这些结合位点附近的优先发现TSS的带注释的基因(补充图。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)与1035 HS度(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。有趣的是,这些潜在的重要组成部分结合位点被发现在染色质区域成为短暂访问后1 h HS(补充图。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。实现一个新创主题发现分析我们发现HSFA共识序列(TCTAGAANNTTCT)内安置HSFA1a DAP-seq山峰(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。整合DAP-seq和转录组数据显示,65%的假定的HSFA1a目标基因1 h HS后差异表达上调而被抑制35%支持认为HSFA1a行为主要转录激活因子(无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。接下来,我们探讨了染色质可访问性和HSFA1a-enriched位点之间的关系通过整合ATAC-seq和DAP-seq数据(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。很大一部分的染色质区域访问后1 h HS HSFA1显示绑定,而事实并非如此的染色质区域访问控制条件。然后我们测试之间的空间联系的强度是否HSFA1a结合位点和远端REs不同热应力与控制条件。要测试这个想法,我们生成聚合情节(聚合C-Hi-C矩阵)的均值量化聚合/堆叠C-Hi-C HSFA1a-distal再保险之间的子矩阵循环后的观察/预期转换C-Hi-C矩阵,为控制和HS条件。这些分析显示增加的强度HSFA1a-distal再保险接触后1 h HS相比控制(图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba(左)。因为我们以前观察到许多远REs被RNAPII绑定,我们执行一个HiChIP anti-RNAPII抗体检测的试验和测量的强度HSFA1a-distal交互。这一分析显示增加的数量和强度远RE-HSFA1a接触后1 h HS相比控制(图。gydF4y2Ba4 e, fgydF4y2Ba)。综上所述,我们的数据表明,HSFA1a RE-promoter交互中扮演着重要的角色。gydF4y2Ba

HSFA1a过程中起着重要作用的动态形成promoter-enhancer联系海关gydF4y2Ba

以确定的动态形成染色质循环引起的HS是依赖HSFA1a活动,我们进行了基因的方法。我们使用两个独立的gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba可拆卸的转基因线(gydF4y2Bahsfa1a-line1和hsfa1a-line2gydF4y2Ba)会使携带发夹RNA结构gydF4y2BaHSFA1agydF4y2Ba表达式gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba(补充图。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。根据先前的研究,我们发现,与野生型相比(WT)植物,gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba可拆卸的转基因植物显示缺陷的强劲增长暴露在HS(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。确定在HS-mediated HSFA1a基因表达的作用,我们在控制和执行一个转录组分析gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba可拆卸的转基因线进行1 h HS(无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。基因本体论分析抑制基因gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba降低转基因线相比WT植物显示显著富集基因HS响应(无花果。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)。我们发现247 HSFA1a由DAP-seq misregulated在确定目标gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba可拆卸的转基因线,186被表达下调(75.3%)和61(24.7%)调节(无花果。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba和补充图。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。这些数据进一步证明,HSFA1a充当一个积极的监管机构应对海关的基因表达。gydF4y2Ba

评估是否HSFA1a RE-promoter循环的形成,影响我们集中分析gydF4y2BaSolyc09g074475gydF4y2Ba和gydF4y2BaHSFA2gydF4y2Ba。这两个基因的选择,因为他们都是热敏HSFA1-dependent地,他们在启动子区域显示一个HSFA1a结合位点,和动态RE-promoter联系海关。此外,HSFA2众所周知作为一个关键组件的耐热性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。C-Hi-C和HiChIP-RNAPII透露一个离散的存在与再保险gydF4y2BaSolyc09g074475gydF4y2Ba和一个未经基因,这种交互增强应对HS(无花果。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba25一个gydF4y2Ba)。值得注意的是,这两个染色质循环的形成与一个强大的激活的基因在应对商品,从而表明该元素可以作为一个转录增强器。测试是否这个假定的再保险有潜力函数作为增强剂,我们生成一个构建包含这个再保险序列融合到一个最小的花叶病毒(CaMV) 35 S启动子驱动的表达荧光素酶(LUC)记者转换后的烟草gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子。我们发现与最小启动子相比,添加的gydF4y2BaSolyc09g074475gydF4y2Ba再保险序列的表达显著增加(LUC记者gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 8.40 e-05,学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(图)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。这些结果支持这个观点基因组区域可以作为转录增强剂。评估是否HSFA1a是染色质的形成所必需的循环管理序列,我们使用染色体构象捕获(3 C)其次是qPCR (3 c-qpcr)控制植物生长的条件或接受1 h HS。我们发现在WT植物,两个循环的力量,命名为A和B,增加1 h HS之后,而在gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba降低转基因线两个循环的强度没有增加而显著降低(循环:gydF4y2BaP1gydF4y2Ba= 3.20 e-05gydF4y2Ba,P2gydF4y2BaB = 3.20 e-05和循环:gydF4y2BaP1gydF4y2Ba= 8.15 e-05gydF4y2Ba,P2gydF4y2Ba= 4.23 e-05,学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(图)。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。关于gydF4y2BaHSFA2gydF4y2Ba轨迹,C-Hi-C HiChIP -RNAPII透露,这可能是由染色质循环和两个远端REs(命名为远端是和远端RE-B)(图gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba补充图。gydF4y2Ba25 bgydF4y2Ba)。这个染色质循环的形成与激活的gydF4y2BaHSFA2gydF4y2Ba,从而表明这些元素可以作为转录增强剂。为了验证这一点,我们跟着前面介绍的方法,发现控制最小启动子构建相比,远端REs的信号强度显著增加(是,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 3.21 e-04;RE-B,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.87 e-04)(无花果。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba)。我们使用3 c-qpcr HSFA1a是否影响这个远端RE-promoter循环形成,并发现消耗HSFA1a减少HS-specific的力量远假定的增强剂和之间的联系gydF4y2BaHSFA2gydF4y2Ba轨迹(gydF4y2BaP1gydF4y2Ba= 3.26 e-08gydF4y2Ba,P2gydF4y2Ba= 3.26 e-08,学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(图)。gydF4y2Ba5 hgydF4y2Ba)。进行了类似的实验有两个额外的候选人增强子与基因相互作用参与热应激反应,导致相同的结果(补充图。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。总的来说,我们的研究结果表明,HSFA1a过程中起着重要作用的动态形成和/或稳定promoter-enhancer交互支撑初始转录反应HS(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这项研究提供了一个深入分析番茄核架构通过集成capture-Hi-C ATAC-seq, ChIP-seq HiChIP, RNA-seq数据。结果突出染色质的不同层次的具体功能空间组织强调监管核组织作为一个整体的重要性。染色质构象茄强烈区划和围绕铺排网站的转录活性染色质类似转录工厂gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}。尽管转录工厂组织的精确机制仍然知之甚少,他们认为在集群重新发挥关键作用的基因gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba。在番茄核转录工厂的存在揭示了其重要性尤其在转录调控和转录响应的优化环境线索集中TFs离散核隔间。gydF4y2Ba

时空基因表达受动力学影响染色质的变化和纠缠不清的发育程序的控制以及对环境压力的反应gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}。在后生动物间期细胞核染色质分为TADs,认为汇集粘住的基因。在果蝇,HS引发戏剧性的3 d核组织的重排gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba,这表明泰德后生动物基因组的组织是塑料和重新配置以应对环境变化gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。然而,最近的一项研究在人类和果蝇细胞表明商品仅影响的一个子集enhancer-promoter交互而TADs和舱结构大多稳定在海关gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。在植物、HS诱发高阶结构异染色质重组的隔间gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。符合这些结果,我们发现HS茄负面影响染色质结构异染色质区域之间的相互作用,从而影响结构异染色质的实力划分。gydF4y2Ba

REs是非编码DNA序列包含绑定为一个或多个主题TFs参与目标基因的转录调控,也是3 d染色质组织的关键组件。这些序列作为近端或远端再保险及其活动是反映在他们的可访问性,可能由先锋TFs和染色质修饰符的作用gydF4y2Ba^{46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}。在动物中,远端REs相关的特定组蛋白标记H3K27ac H3K4me1,定义一个特定的染色质状态gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。相比之下,在植物,玉米和小麦的研究提出,H3K27ac H3K4me3和H3K9ac组蛋白标记优先与远端REs有关gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba}。在这里,我们专注于不同访问REs代表活跃REs,发现积极的远端和近端REs显示不同染色质签名。我们发现茄远REs的特点是核小体的存在丰富的H3K9ac H3K18ac和缺乏H3K4me3 flnaking地区最大的可访问性。重要的是,我们表明,其中一些有能力作为转录增强剂。gydF4y2Ba

3 d染色质结构动态控制REs的访问他们的目标基因通过促进或抑制RE-promoter交互。再保险可以为成千上万的碱基对序列上游或下游的基因调节,很难定义REs控制基因。测序技术的快速发展使得多个高通量实验方法测量染色质交互,包括Capture-Hi-C HiChIP,尤其有用检测enhancer-promoter交互。在动物中,发起人C-Hi-C一直用于远程RE-promoter交互的分析及其控制使用不同的细胞类型的基因表达。这些分析揭示了一个巨大的改变在RE-promoter交互发生在细胞分化gydF4y2Ba^{52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba}。在植物、RE-promoter交互分析了玉米使用HiChIP H3K4me3, H3K27me3 H3K27ac,确定长期RE-promoter相互作用导致的控制基因的表达gydF4y2Ba^{57gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba}。这一分析发现远程RE-promoter交互作用的存在。符合这一观察,使用capture-Hi-C和HiChIP方法茄,几千RE-promoter交互被发现。值得注意的是,我们发现启动子相互作用的几个例子REs以及再保险与多个基因相互作用的例子。这两种染色质可以分别定义为promoter-centric中心或RE-centric集线器gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的机制提出了动物形状的3 d基因组结构循环挤压模型,涉及到染色体的结构维护(SMC) cohesin复杂和锌指dna结合蛋白质CTCFgydF4y2Ba^{60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba}。植物基因组似乎缺乏CTCF同系物,但SMC复合物是高度保守的。因此,这个循环挤压可能保存在植物和涉及未知因素作为绝缘体。除了SMC与CTCF的作用,TFs作为蛋白质锚和确定3 d基因组组织gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba。TFs可能调解RE-promoter交互通过不同的机制,包括直接homo-dimerization蛋白质gydF4y2Ba^{62年gydF4y2Ba}招聘和辅助因子的蛋白质生成低聚物gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba君士坦斯TF起着关键作用,形成一个enhancer-promoter循环控制的表达gydF4y2Ba开花轨迹TgydF4y2Ba^{63年gydF4y2Ba}3 d,从而也表明TFs影响染色质组织在植物。然而,大多数植物的研究主要集中在破译TFs的角色在3 d染色质结构和基因调控在稳态条件下,提供线索的机制参与维护RE-promoter交互而不是它们的形成。破译的分子机制参与建立远端RE-promoter交互,我们进行了多维研究结合压力在不同的时间点。我们的数据表明,3 d染色质交互动态修改海关允许暂时进化的多样性之间的连接激活物和推动者。此外,我们综合分析显示绑定主题的HSF序列中来自参与RE-promoter联系人HS发作的治疗。这些数据表明,转录因子的HFS中家庭RE-promoter接触形成中发挥重要作用。在酵母的研究已经表明,HSF1介导的集群目标和动态影响基因组的重新配置gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba}。我们的番茄的数据表明,HSFA1a中起关键作用的动态形成promoter-enhancer接触和控制转录响应HS的发病。未来的工作将帮助确定循环形成是转录激活的先决条件,或者是相反的结果。很少有研究评估TFs的动态作用的形成染色质循环刺激,即使在动物。一项研究显示,KLF4 ZNF750 TFs,而不是内聚蛋白,是建立RE-promoter关键联系人,促进表皮细胞分化过程中基因表达gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba。总的来说,我们的研究结果揭示的复杂性远端和近端接触循环形成和提供的证据TFs的关键作用在控制转录响应通过染色质结构的3 d重构在动物和植物。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

番茄(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba)线在这项研究中使用的简历。M82和简历。很会赚钱的背景。的gydF4y2Bahsfa1agydF4y2Ba突变体line1和line2取自Dr.Fragkostefanakis的实验室gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。种子直接播种在土壤和植物生长在生长室24°C下工作时间长(16 h光)条件。热处理,还是植物治疗45°C 1 h和6 h在气候室(Aralab)。第四叶被用于所有的实验研究。gydF4y2Ba

疣状gydF4y2Ba

根据Latrasse等免疫染色实验gydF4y2Ba^{65年gydF4y2Ba}。短暂、第四还是番茄植物的叶子被固定,然后核是孤立的,放在poly-lysine幻灯片,和孵化一夜之间在4°C主要抗体(400倍稀释)H3K9me2 (Abcam ab1220) H3K9ac(微孔,07 - 352),H3K27me1(微孔,07 - 448)和RNAPII (Abcam ab26721)。幻灯片被洗,然后在室温下培养1 h在黑暗中与山羊anti-Rabbit Alexa萤石+ 488 (A11034英杰公司)和山羊anti-Mouse Alexa萤石+ 555 (A32727英杰公司)或山羊anti-Rabbit Alexa萤石+ 555 (A32732英杰公司)和山羊anti-Mouse Alexa萤石+ 488 (A32723英杰公司)二级抗体(400倍稀释)。DNA是复染色和4、6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) SlowFade钻石不变色越来越多的媒体。幻灯片直接成像在共焦显微镜(蔡司微系统)。gydF4y2Ba

分析与高通量测序transposase-accessible染色质gydF4y2Ba

大约100毫克的4-weeks-old番茄第四离开地面,经过100年µm过滤器使用原子核和核孤立隔离缓冲区(0.25蔗糖,10毫米Tris-HCl pH8, 10毫米MgCl2,特里同x - 100 1%, 5毫米2-mercapto-ethanol,蛋白酶抑制剂和0.1毫米)。原子核在2×re-suspended TD缓冲区(20毫米Tris-HCl, pH值7.6,10毫米MgCl2,和20%二甲基甲酰胺)和2.5µl Tn5转座酶(Illumina公司fc - 121 - 1030)。换位反应30分钟在37°C,和DNA纯化使用试剂盒MinElute工具包(试剂盒,Cat.No.28004)。DNA库放大了总共10个周期被Buenrostro et algydF4y2Ba^{66年gydF4y2Ba}和Jegu等gydF4y2Ba^{67年gydF4y2Ba}。DNA库检查质量和量化使用2100生物分析仪(安捷伦)并受2×75个基点由NextSeq 500高通量测序(Illumina公司)。两个独立的生物复制生成的。gydF4y2Ba

RNA-seq化验gydF4y2Ba

总RNA提取的第四叶还是番茄Nucleospin RNA设备(Macherey-Nagel),根据制造商的指示。RNA-seq图书馆准备从2μg总RNA的使用NEBNext超二世定向RNA图书馆准备工具包(内)根据制造商的指示。RNA图书馆检查质量和量化使用2100生物分析仪(安捷伦)并受1×75个基点由NextSeq 500高通量测序(Illumina公司)。两个独立的生物复制生成的。gydF4y2Ba

原位高c测定gydF4y2Ba

据Concia原位高c实验等。gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba使用DpnII酶(新英格兰生物学实验室)。DNA库准备使用NEBNext超二世DNA库准备工具包(内)根据制造商的指示(10周期PCR扩增步骤)。DNA库检查质量和量化使用2100生物分析仪(安捷伦)和库受到2×75个基点由NextSeq 500高通量测序(Illumina公司)。两个独立的生物复制生成的。gydF4y2Ba

C-Hi-C化验gydF4y2Ba

原位C-Hi-C,高c库用于捕获步骤。捕获是由使用SureSelect XT目标Illumina公司Paired-End浓缩系统多路复用测序图书馆(安捷伦)根据制造商的建议。番茄品种M82推动者都selected1.5 kb 212735年长度和探针(每个探针的长度= 120个基点)是为了捕捉所有启动子。捕获步骤执行使用1µg原位高c库遵循制造商的建议。库的质量评估使用2100生物分析仪(安捷伦)和库受到2×75个基点paired-end高通量测序NextSeq 500 (Illumina公司)。两个独立的生物复制生成的gydF4y2Ba

HiChIP化验gydF4y2Ba

核被隔绝的第四叶还是番茄植物使用相同的过程的原位高c实验。从Mumbach Hi-ChIP协议等。gydF4y2Ba^{68年gydF4y2Ba}然后应用使用DpnII限制性内切酶(内)和3 ug anti-RNAPII抗体(Abcam ab26721)。库的质量是由生物分析仪(安捷伦)和库受到2×75个基点paired-end高通量测序NextSeq 500 (Illumina公司)。gydF4y2Ba

ChIP-seq化验gydF4y2Ba

ChIP-seq化验进行第四叶还是番茄plantsaccording Bio-protocol Ramirez-Prado et al。gydF4y2Ba^{69年gydF4y2Ba}使用3 ug anti-H3K27me1(微孔,07 - 448),anti-H3K9ac(微孔,07 - 352),anti-H3K14ac(微孔,07 - 353),anti-H3K18ac(微孔,07 - 354),anti-H3K27ac (Abcam ab4729) anti-H3K4me3(微孔,07 - 473)和anti-RNAPII (Abcam ab26721)抗体。ChIP-seq图书馆准备使用NEBNext超二世从10 ng的DNA DNA库准备工具包Illumina公司(内)根据制造商的指示。两个独立的生物复制生成的每个时间点的热应力。DNA库检查质量和量化使用2100生物分析仪(安捷伦)并受1×75个基点由NextSeq 500高通量测序(Illumina公司)。gydF4y2Ba

放大亲和纯化DNA测序分析(AmpDAP-seq)gydF4y2Ba

据Bartlett AmpDAP-seq化验进行等。gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba与修改。短暂,gDNA还是西红柿的第四叶提取的支离破碎,图书馆使用NEBNext生成超二世DNA库准备工具包(内,# E7645S / L, # E7103S / L)。gydF4y2BaSolycHsfA1agydF4y2Ba开放阅读框架被转移到Gateway-compatible pIX-HALO表达载体并表示使用Promega TNT耦合的小麦胚芽提取系统(Promega,猫。不。L4130)。表达蛋白质固定化在玛格尼HALO-Tag珠子(Promega G728A),洗,孵化DNA库。珠洗后,DNA被筛选了放大和索引NEBNext引物(20 PCR循环使用)。DNA库检查质量和量化使用2100生物分析仪(安捷伦)并受1×75个基点由NextSeq 500高通量测序(Illumina公司)。两个独立的生物复制生成的。gydF4y2Ba

3 c-qpcrgydF4y2Ba

前不久番茄第四叶在1% (v / v)交联甲醛在室温20分钟。交联植物材料是地面和核孤立和处理5分钟0.5% SDS在62°C。SDS然后补充2% Triton x - 100。消解时进行一夜之间在37°C使用150 u DpnII酶(新英格兰生物学实验室)。限制性内切酶灭活通过添加1.6% SDS和孵化20分钟的62°C。SDS补充1% Triton x - 100。在22°C DNA被孵化的结扎5 h使用4000 u的T4 DNA连接酶(Fermentas)。反向一夜之间交联是由治疗65°C。DNA是由phenol-chloroform蛋白酶K治疗后恢复提取和乙醇沉淀。相对互动频率的计算是通过使用15 ng的DNA定量PCR。 A region uncut by DpnII was used to normalize the amount of DNA. Details for primers used for 3C-qPCR are listed in Supplementary Data3gydF4y2Ba。两个独立的生物复制生成的。gydF4y2Ba

Dual-luciferase化验gydF4y2Ba

荧光素酶活性量化使用试剂从双荧光素酶报告实验系统(Promega E2920)根据制造商的指示。gydF4y2Ba

ChIP-seq数据的分析gydF4y2Ba

trimmomatic - 0.38gydF4y2Ba^{70年gydF4y2Ba}用于削减使用以下参数:最小长度36个基点;意味着phr质量分数> 30;前导和尾随基地移除基础质量< 5。读取被映射到M82 V1.0gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba}装配使用Bowtie2 V2.3.5gydF4y2Ba^{72年gydF4y2Ba}1 bp(补充数据的权限不匹配gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。识别显著富集地区,我们使用MACS2 V2.2.7.1gydF4y2Ba^{73年gydF4y2Ba}用以下peak-calling参数:位置重复读取次数:1;mfold几点;核反应能量截止:0.05;extsize 200;广泛的高峰。在基因组区域,提取平均得分multiBigwigSummary deepTools包的命令gydF4y2Ba^{74年gydF4y2Ba}是使用默认参数对RPGC规范化大佬文件。gydF4y2Ba

差异表达分析gydF4y2Ba

单头读取使用的RNA-seq样本trimmomatic - 0.38的参数:30 bp的最小长度;意味着phr质量分数> 30;前导和尾随基地移除与基地质量< 5。星对准器gydF4y2Ba^{75年gydF4y2Ba}被用来映射读取M82 V1.0吗gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba}基因组组装(补充数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。原始读计数然后提取使用featureCounts V2.0.0实用程序从R Subread包基于M82_v1.1.0基因注释gydF4y2Ba^{71年gydF4y2Ba}。最后,我们使用DESeq2 V1.38.0gydF4y2Ba^{76年gydF4y2Ba}识别差异表达基因。基因与阅读数量≥50至少2样本分析考虑微分表达式。gydF4y2Ba

HiChIP和C-Hi-C数据分析gydF4y2Ba

生FASTQ文件预处理与trimmomatic - 0.38删除Illumina公司测序适配器。5′和3′末端质量分数低于5 (phr + 33)被修剪,修剪后读< 30 bp下降。然后将文件处理HiC-Pro V2.11.4gydF4y2Ba^{77年gydF4y2Ba}。读是一致使用Bowtie2 V2.3.5到M82V1.0组装与默认设置,除了参数“-score-min L,−0.6−0.8”(补充数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。无效的结扎产品(如悬空,碎片结扎在自己身上,和结扎并列片段)被丢弃。有效的对被用来产生原始交互矩阵在不同的决议。最后,”。h我c” files were generated with the software Juicer Tools and visualized with the tool Juicebox^{78年gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

识别和分析基因交互gydF4y2Ba

使用荷马V4.11有效对生成进行了进一步的分析gydF4y2Ba^{79年gydF4y2Ba}对于不同的分辨率(500 bp的短程相互作用和20 kb远程交互)。短程相互作用,相互作用的两个锚(基因组垃圾箱)与基因注释使用bedtools相交gydF4y2Ba^{80年gydF4y2Ba}。我们没有任何基因注释删除交互,self-loops和重复。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba