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胞质硫醇过氧化物酶PRXIIB是一种细胞内H2O2通过氧化还原继电器调节植物免疫力

摘要

H的快速生产2O2是植物对不同病原体反应的标志,在感知免疫原性模式的各种受体的下游信号传递中起着至关重要的作用。然而,植物感知H2O2对免疫的调节仍然知之甚少。我们表明内源性H2O2硫醇过氧化物酶PRXIIB通过Cys51的氧化作用感知免疫激活产生的产物,这对气孔免疫至关重要.我们进一步表明,在免疫刺激细胞中,PRXIIB通过Cys51与2C型蛋白磷酸酶ABA不敏感2 (ABI2)结合,随后转导H2O2信号到ABI2。这种氧化作用使H显着增敏2O2-介导的ABI2磷酸酶活性的体外抑制,是植物气孔免疫所必需的。总之,我们的结果说明了氧化还原继电器,PRXIIB作为H2O2ABI2作为目标蛋白,在植物免疫过程中介导活性氧信号。

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图1:气孔免疫需要胞质PRXIIs。
图2:ABI2家族PP2C是气孔免疫所必需的,并与PRXIIB形成缀合物以响应H2O2
图3:Flg22以rbohd依赖的方式诱导ABI2与PRXIIB特异结合。
图4:PRXIIB通过氧化还原继电器促进ABI2的氧化。
图5:氧化还原继电器致敏ABI2磷酸酶失活。
图6:ABI2的氧化还原半胱氨酸是气孔免疫所必需的。

数据可用性

支持本文结论的所有数据均在主图、扩展数据图和补充信息中提供。补充信息中还提供了源数据。

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下载参考

确认

我们感谢Z. Gong提供的三突变体Abi1 abi2 hab1.国家自然科学基金(31830019,3211001023,31521001)资助J.-M.Z;21922702、81973279、31770885发给J.Y.;32170288、31900222 - G.B.)、国家重点研发计划项目(2016YFA0501303 - J.Y.)、植物基因组学国家重点实验室(sklp2016b -2 - J.-M.Z.)、中科院战略重点项目(XDPB160201 - J.-M.Z.)、海南省优秀人才团队(J.-M.Z.)、蛋白质组学国家重点实验室(SKLP-K201703、SKLP-K201804 - J.Y.)。

作者信息

作者及隶属关系

作者

贡献

j.m.z, J.Y.和G.B.设计了这项研究。M.H.和G.B.进行了大部分实验,由X.Z. L.F.协助进行了化学蛋白组学和质谱分析。j.m.z, j.y., J.Z, J.L.和G.B.写了手稿,并附上了所有作者的评论。

相应的作者

对应到Guozhi Bi杨京Jian-Min周

道德声明

相互竞争的利益

作者声明没有利益竞争。

同行评审

同行评审信息

自然植物感谢Karl-Josef Dietz和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。

额外的信息

出版商的注意施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

扩展数据

图1 TPXs基因表达谱及定位。

所示为拟南芥eFP Browser中不同发育阶段指示基因转录水平的热图(http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi).颜色条表示日志10表达量,蓝色、白色、红色分别表示低、中、高表达量。右边显示了预测的或实验支持的亚细胞定位。

图2气孔免疫需要PRXIIs和GPXs。过氧化物酶基因编辑。

一个,突变GPX2, GPX5,GPX6Gpx2 gpx5 gpx6Gpx2-2 gpx5-1 gpx6-3)由CRISPR-Cas9生成的三突变体。b,基因突变prxIIB-1单突变体和prxIIB prxIIC prxIIDprxIIB-1 prxIIC-1 prxIID-1)由CRISPR-Cas9生成的三突变体。红色的核苷酸表示突变体中有单碱基插入。c,prxIIB单突变体和prxIIB prxIIC prxIID三突变体在细菌进入的限制中受到损害。这个实验重复了三次,得到了相似的结果。d, PRXIIB在prxIIB而且prxIIB prxIIC prxIID植物。采用抗PRXIIB抗体免疫印迹法检测PRXIIB蛋白。这个实验重复了三次,得到了相似的结果。ePRXIIB恢复气孔免疫prxIIB prxIIC prxIID三突变体。f,Gpx2 gpx5 gpx6在细菌进入的限制下,突变体受到轻微的影响。用于实验c、e,f对指示植物的叶片进行浸泡处理太平洋标准时间DC3000天哪−1.5 h,然后测定细菌数量。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为均数±标准差(n = 12,单因素方差分析,Tukey后验)。每个实验至少重复三次,得到相似的结果。

源数据

图3 flg22触发的H . H .积累2O2在外质体和细胞质中正常发生Gpx2 gpx5 gpx6而且prxIIB prxIIC prxIID突变体。

一个, Flg22诱导正常ROS爆发Gpx2 gpx5 gpx6而且prxIIB prxIIC prxIID突变体。4周龄植株的叶片条在H2O在一夜之间。加入1µM flg22,生成apoplastic H .2O2立即用鲁米诺法测定。H的相对含量2O2以相对发光单位表示。每个数据点以均值±标准差表示,n = 10。b, flg22诱导H .2O2在细胞质中不受影响Gpx2 gpx5 gpx6而且prxIIB prxIIC prxIID突变体。四周龄转基因植株的叶盘roGFP2-Orp1将相应遗传背景下的报告基因孵育于H2O过夜,置于光度计中,依次在405 nm和488 nm处激发,并在510 nm处记录发射。在记录过程中的指定时间点添加1µM flg22。405 nm/488 nm的激发比提供了H的相对量的指示2O2在细胞质中。每个数据点以均值±标准差表示,n = 10。每个实验重复三次,得到相似的结果。

PRXIIB的Cys51在flg22的作用下被磺化,aba诱导的气孔关闭是必需的。

一个, Flg22诱导PRXIIB Cys51的磺化作用。用H2O或1µM flg22 20分钟,总蛋白进行s -磺胺基体分析。Cys-SOH从flg22和H中定位到拟南芥TPXs2O处理分别以红色和蓝色表示。flg22 /小时2计算O比值,并用色谱图显示。请注意,没有Cys-SOH映射到PRXIIC, PRXIID和GPXs,这可能是由于蛋白(PRXIIC和PRXIID)的低丰度和/或基于DDA(数据依赖采集)的质谱分析的随机性质。b,野生型PRXIIB- flag和PRXIIB积累c51单片机-FLAG蛋白在T2转基因植物中的表达。对叶片总蛋白进行抗flag免疫印迹检测。这个实验重复了三次,得到了相似的结果。c, PRXIIB的Cys51在aba诱导的气孔关闭中至关重要。用100µM ABA浸泡4周龄的基因型植株叶片,2 h后测定气孔孔径。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为均数±标准差(n = 40,单因素方差分析,Tukey后验)。

源数据

扩展数据图5 H2O2诱导ABI2与PRXIIB, GPX2和APX1的关联。

一个.H2O2-诱导的prxib - abi2关联是剂量依赖性的。表达prxib - flag和ABI2-HA的原生质体经H2O2在指定浓度下,进行CoIP。免疫沉淀物在1mm DTT存在下洗脱。斑点下方的定量显示了归一化输入ABI2-HA的CoIP产物的任意密度单位。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为三个独立实验±sem的平均值(单向方差分析,Tukey后验)。注意5-20 μ M H2O2与无H处理相比,ababi2 - ha显著增加2O2控制当学生t -使用Test。b,外生H2O2诱导ABI2与PRXIIB、GPX2和APX1的关联。表达上述构造的原生质体用5 μM H处理2O210 min后进行CoIP。免疫沉淀物在1mm DTT存在下洗脱。斑点下方的定量显示了归一化输入ABI2-HA的CoIP产物的任意密度单位。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为三个独立实验±sem的平均值(单向方差分析,Tukey后验)。cH2O2诱导形成对DTT敏感的高分子量prxib - abi2产物。所示为图中相同免疫印迹的长时间暴露。2 b.prxib - abi2偶联的基础水平明显。每个实验重复三次,得到相似的结果。

源数据

扩展数据图6 flg22在原生质体中触发ROS产生的方式依赖于FLS2而且RBOHD

从指定的植物中制备原生质体,用1µM flg22处理,立即测量ROS并以相对发光单位表达。每个数据点代表mean±sd, n≥8个技术重复(200 μl原生质体为一个样本)。这个实验重复了三次,得到了相似的结果。

扩展数据图7 PRXIIB和ABI2氧化在体外

一个bH2O2诱导PRXIIB氧化,但不诱导PRXIIB氧化c51单片机.PRXIIB (一个)和PRXIIBc51单片机b重组蛋白用指定浓度的H2O2,孵育10分钟,加入MAL-PEG 2000结合游离硫醇。对蛋白进行SDS-PAGE检测,考马斯亮蓝(CBB)染色。硫醇的氧化阻止了MAL-PEG 2000的结合,并在SDS-PAGE上产生更小的蛋白质。PRXIIB的尺寸明显变小c51单片机与野生型PRXIIB相比,突变蛋白中缺乏Cys51硫醇,阻碍了MAL-PEG 2000与该位点的结合。c, ABI2不被H氧化2O2在体外在缺乏PRXIIB的情况下。ABI2重组蛋白用5 μM H培养2O2并加入MAL-PEG 2000以结合游离硫醇。对蛋白进行SDS-PAGE和CBB染色。每个实验重复三次,得到相似的结果。

源数据

扩展数据图8氧化ABI2内部的二硫键。

所示为补充表中氧化ABI2中与二硫键相对应的肽谱2.b和y离子被标记,并沿肽序列显示在图的顶部。

ABI2参与二硫键的Cys残基是与PRXIIB结合所必需的。

一个, ABI25 c废除与PRXIIB的联系。用100 μM H处理表达上述构造的Col-0原生质体2O210 min后进行CoIP。免疫沉淀物在1mm DTT的存在下洗脱,并进行还原凝胶和免疫印迹。右边的量化显示了归一化为输入ABI2-HA的CoIP产品的任意密度单位。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为三个独立实验±sem的平均值(单向方差分析,Tukey后验)。b, ABI25 c的形成2O2-诱导的高分子量配合物。Col-0原生质体表达ABI2- ha或ABI25 c-HA用100 μM H处理2O210分钟后,总蛋白通过非还原凝胶进行电泳。每个实验重复三次,得到相似的结果。

源数据

图10 PRXIIB Cys51有助于叶肉免疫,而不是ABI2氧化。

一个T2株的指示转基因系补充WTABI2而且ABI25 c免疫印迹法检测ABI2-HA蛋白积累情况。这个实验重复了三次,得到了相似的结果。bcPRXIIs是flg22诱导的叶肉细胞的抗病所必需的,依赖于Cys51。用H预浸润植株2O或flg22前一天渗透用太平洋标准时间DC3000,两天后测定细菌数。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为均数±标准差(n = 12,单因素方差分析,Tukey后验)。d在flg22诱导的叶肉细胞抗病性中,ABI2的氧化还原中继半胱氨酸不是必需的。用H预浸润植株2O与flg22前一天渗透配合太平洋标准时间DC3000,两天后测定细菌数。不同字母表示差异显著(P < 0.05)。数据为均数±标准差(n = 12,单因素方差分析,Tukey后验)。每个实验重复三次,得到相似的结果。

源数据

补充信息

报告总结

补充表

补充表1。LC-MS /MS鉴定prxib相互作用蛋白。补充表2。ABI2和PRXIIB上二硫键的鉴定。补充表3。本研究中使用的引物。

源数据

图2 .来源数据

未加工的西方墨迹。

图3 .源数据

未加工的西方墨迹。

图4 .来源数据

未加工的西方墨迹。

图5 .来源数据

未加工的西方墨迹。

图2 .扩展数据

未加工的西方墨迹。

图4 .扩展数据

未加工的西方墨迹。

图5 .源数据扩展数据

未加工的西方墨迹。

图7 .源数据扩展数据

未加工的西方墨迹。

图9 .源数据扩展数据

未加工的西方墨迹。

图10 .源数据扩展数据

未加工的西方墨迹。

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毕,G.,胡,M.,傅,L。et al。胞质硫醇过氧化物酶PRXIIB是一种细胞内H2O2通过氧化还原继电器调节植物免疫力。Nat。植物8, 1160-1175(2022)。https://doi.org/10.1038/s41477-022-01252-5

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