摘要gydF4y2Ba
用于治疗中枢神经系统疾病的基因疗法的发展受到了有效穿过血脑屏障(BBB)的腺相关病毒(aav)有限可用性的阻碍。在这里，我们报道了在病毒衣壳上显示细胞穿透肽的AAV9变体的合理设计和两个变体的鉴定，AAV.CPP。16和AAV.CPP。21，with improved transduction efficiencies of cells of the central nervous system on systemic delivery (6- to 249-fold across 4 mouse strains and 5-fold in cynomolgus macaques, with respect to the AAV9 parent vector). We also show that the neurotropism of AAV.CPP.16 is retained in young and adult macaques, that this variant displays enhanced transcytosis at the BBB as well as increased efficiency of cellular transduction relative to AAV9, and that it can be used to deliver antitumour payloads in a mouse model of glioblastoma. AAV capsids that can efficiently penetrate the BBB will facilitate the clinical translation of gene therapies aimed at the central nervous system.
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确认gydF4y2Ba
我们感谢K. J. Smith和H. Hirai对手稿的反馈，G. Freeman提供了PD-L1抗体，A. Charest和R. Piranlioglu提供了GBM1694细胞，H. Jin提供了AAV试剂，D. Feng, Y. Ni和B. J. Scott提供了技术援助。这项研究得到了布里格姆妇女医院杂项基金的支持(给F.B.)。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
F.B.在E.A.C.的建议下构思并监督了这项研究;王永勇、王俊杰、杨林、杨强进行了实验并收集了数据，数据的输入来自于金伟、杨泽、杨春、王志勇、王俊林;h.n.、S.E.L.和c.f c.c对方法论有贡献;f.b.、y.y.、j.w.、Y.L.和Y.Q.分析了数据。F.B.和Y.Y.根据所有作者的意见撰写了手稿。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
F.B.和E.A.C.从本研究产生的专利中获得特许权使用费(专利申请:PCT/US19/41386, PCT/US21/12746和PCT/US22/73051)。F.B.是AAV基因治疗初创公司Brave Bio Inc.的联合创始人和科学顾问。其他作者宣称没有利益竞争。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展数据gydF4y2Ba
扩展数据图1首轮体内选择揭示了进一步优化的潜在候选。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，静脉注射1 × 10后21天小鼠矢状面荧光图像gydF4y2Ba10gydF4y2Ba单链AAV-EF1α-H2B-RFP的vg。白点表示rfp阳性细胞。比例尺:全脑切片为1000 μm，插片为30 μm。gydF4y2BabgydF4y2Ba，静脉注射1 × 10后21天小鼠矢状面荧光图像gydF4y2Ba11gydF4y2Bavg的选择AAVs-EF1α-H2B-RFP。比例尺:全脑切片为1000 μm，插片为300 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba，通过使用ImageJ计数转导的rfp阳性细胞来量化转导的脑细胞百分比和AAV转导的相对折叠变化。每组n = 3只小鼠，均数±s.e.m, Tukey 's后验单因素方差分析。gydF4y2Ba
Bip插入序列优化产生了更多的AAV变体，进一步增强了脑向性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，标准5-mer Bips序列，以及优化过程中的衍生物。gydF4y2BabgydF4y2Ba，静脉注射1 × 10后21天小鼠矢状面荧光图像gydF4y2Ba11gydF4y2BaAAVs-EF1α-H2B-RFP的vg。比例尺:全脑切片为1000 μm，嵌段为300 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba，通过ImageJ计数rfp阳性细胞来量化大脑中转导的脑细胞百分比和AAV转导的相对折叠变化。gydF4y2BadgydF4y2Ba， AAVs转导的肝细胞相对于DAPI反染色的百分比。白点表示rfp阳性细胞。每组n = 3只小鼠，均数±s.e.m, Tukey 's后验单因素方差分析。gydF4y2Ba
扩展数据图3 AAV.CPP脑转导。16和AAV.CPP。21in four common mouse strains.
lgydF4y2Ba，静脉注射1 × 10后21 d, C57BL/6J、BALB/cJ、FVB/NJ和129S1/SvlmJ小鼠脑区代表性荧光图像gydF4y2Ba11gydF4y2BaAAVs-EF1α-H2B-RFP (AAV9，gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba；AAV.CPP.16,gydF4y2Ba超高频gydF4y2Ba；AAV.CPP.21,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．白点表示rfp阳性细胞。比例尺:500 μm。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba在高剂量AAVs (1 × 10)下，定量C57BL/6J中转导的脑细胞gydF4y2Ba12gydF4y2Ba每组n = 3只小鼠，均值±s.e.m，单因素方差分析，Tukey 's后验。gydF4y2Ba
图4 AAV.CPP病毒基因组分布。BALB/cJ中16 vs AAV9。gydF4y2Ba
5 × 10gydF4y2Ba11gydF4y2Bavg AAV - cagg - gfp - wpre静脉注射BALB/cJ小鼠，21天后分离AAV基因组DNA。选定中枢神经系统区域的AAV病毒基因组(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)及周围器官(gydF4y2BabgydF4y2Ba)以WPRE为靶点的引物进行qPCR检测，归一化至小鼠基因组(以胰高血糖素为靶点)。n =每组4只小鼠，均数±s.e.m, Student’sgydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
图5 AAV.CPP对少突胶质细胞、运动神经元和外周组织的转导作用BALB/cJ中的16和AAV9。gydF4y2Ba
安妮gydF4y2Ba，转导的少突胶质细胞(Olig2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，并以百分比进行量化。比例尺gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba: 25 μm。比例尺gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba: 10 μm。每组3只，均数±S.E.M.gydF4y2BafgydF4y2Ba脊髓切片免疫染色。用ChAT抗体观察运动神经元。比例尺:左2根250 μm，右2根50 μm。gydF4y2BaggydF4y2Ba外周组织的转导及相对折叠变化的定量。BALB/cJ小鼠静脉注射1× 10后3周观察gydF4y2Ba12gydF4y2Bavg AAV.CPP。16-CAG-H2B-GFP or AAV9-CAG-H2B-GFP. Mean ± s.e.m., n = 4-8, Student’stgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba
图6 AAV.CPP的影像学、western blot和组织学分析。16- apd - l1处理的gbm小鼠。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，小鼠胶质母细胞瘤(GBM)模型手术时间表。gydF4y2BabgydF4y2Ba生物发光成像验证肿瘤植入后第7天肿瘤形成的例子。gydF4y2BacgydF4y2Bawestern blot检测肝脏和肌肉中aPD-L1-HA的表达。gydF4y2Bad-fgydF4y2Ba，经aav . cpa .16- apd - l1治疗的长期存活小鼠的苏木精-伊红染色脑切片的代表性图像。可见残留肿瘤组织极少，提示GBM已根除。gydF4y2BaggydF4y2Ba免疫染色显示AAV.CPP。16-mediated expression of aPD-L1-HA and astrogliosis in one long-term-surviving animal. Scale bar inggydF4y2Ba: 25 μm。每组n = 3-5只小鼠，均数±s.e.m, Tukey后验单因素方差分析。gydF4y2Ba
图7肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的流式细胞术分析。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，所有面板的门控策略。根据SSC-H和FSC-H参数选择淋巴细胞群，然后通过FSC-H和FSC-A门控去除双胞。CD45标记所有免疫细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba，代表性的流式细胞术图及T细胞(CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)及其亚型(CD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，IFNggydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，颗粒酶BgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，CD25gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/Foxp3 + /CD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba亚群)。每组n = 3-11只小鼠，均数±s.e.m，单因素方差分析，Tukey 's后验。gydF4y2Ba
图8抗PD-L1单克隆抗体在GL261小鼠GBM模型中的促生存作用。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，研究PD-L1单抗在GL261 GBM模型中的作用的实验时间表。大剂量PD-L1单抗(339.6A2，小鼠IgG1， κ;共2.25 mg)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， Kaplan-Meier生存曲线显示在GL261 GBM模型中PD-L1单抗或对照的生存结果。每组n = 6，采用Log-rank检验来定义统计学显著性。gydF4y2Ba
图9 AAV.CPP系统治疗的前生存效应。16-aPD-L1在遗传性GBM肿瘤模型中的作用。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，实验时间轴。将人野生型EGFR过表达和Ink4a/Arf-PTEN共缺失的GBM1694肿瘤细胞植入BALB/c小鼠构建GBM模型。1 × 10gydF4y2Ba12gydF4y2Bavg (aav。cpp)16-CAG-aPD-L1-HA were administered at day 5 post tumor implantation.bgydF4y2Ba， Kaplan-Meier生存曲线显示AAV.CPP的生存时间。16-aPD-L1或PBS对照。每组n = 6，采用Log-rank检验来定义统计学显著性。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
源数据gydF4y2Ba
源数据图1-6和扩展数据图1-9gydF4y2Ba
源数据。gydF4y2Ba
图5 .来源数据gydF4y2Ba
未加工的西方墨迹。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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姚勇，王俊，刘勇。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba腺相关病毒血清型9的变体，增强了啮齿动物和灵长类动物的血脑屏障穿透能力。gydF4y2BaNat,生物医学。英格gydF4y2Ba6gydF4y2Ba， 1257-1271(2022)。https://doi.org/10.1038/s41551-022-00938-7gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41551-022-00938-7gydF4y2Ba
