摘要gydF4y2Ba
在自然环境中检测内源性信号和精确控制遗传回路对于理解生物过程至关重要。然而，处理内生信息的工具是有限的。在这里，我们开发了一种可推广的内源性转录门控开关，在内源性启动子存在时释放单导向rna。当内源性转录门控开关与我们开发的高灵敏度crispr激活剂相关报告相结合时，我们可以可靠地检测内源性基因的活性，包括表达非常低的基因(相对于gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba；定量pcr分析)。值得注意的是，我们还可以使用这种方法监测活细胞中低水平表达的典型长非编码rna的转录活性。总之，我们的方法提供了一个强大的平台来感知潜在的细胞功能的内源性遗传元素的活动。gydF4y2Ba
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内含子编码的顺激子转录本用于编码和非编码rna的微创监测gydF4y2Ba
自然细胞生物学gydF4y2Ba开放获取gydF4y2Ba11月7日gydF4y2Ba
通过合成CRISPRa电路精确的肿瘤免疫重布线，同时获得/失去转录因子gydF4y2Ba
自然通讯gydF4y2Ba开放获取gydF4y2Ba2022年3月18日gydF4y2Ba
长链非编码RNA PAARH通过上调HOTTIP和激活HIF-1α/VEGF信号通路促进肝细胞癌进展和血管生成gydF4y2Ba
细胞死亡与疾病gydF4y2Ba开放获取gydF4y2Ba2022年2月2日gydF4y2Ba
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在此重新分析的先前发表的RNA测序数据可在登录代码下获得gydF4y2BaGSM2573084gydF4y2Ba．所有与数字相关的原始数据都列在源数据(统计源数据)中。所有western blot的原始图像都可以在Source数据中找到(未处理的western blot和凝胶)。所有向量的序列在补充图中提供。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．所有其他材料和数据均可按要求提供。gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢ION的FACS设施的Quan L.， Wu H.和Qian S.，以及光学成像设施的Wang Y.， Zhang Y.， Chen X.， Xiang D.和Q. Hu。我们感谢钟n和王q的技术援助。本工作得到了中国科学院基础前沿科学研究计划从0到1原始创新项目(批准号:;ZDBS-LY-SM001)，中国研发计划(批准号2017YFC1001300和2018YFC2000100)，中科院战略重点研究计划(批准号:ZDBS-LY-SM001)。国家自然科学基金项目(批准号:31871502,31925016,91957122,31901047)，上海市科技重大专项(批准号:XDB32060000);2018SHZDZX05)、上海市科委科技计划项目(批准号18411953700、18JC1410100、19XD1424400)和中国科学院国际合作计划项目(批准号:2018SHZDZX05);153 d31kysb20170059)。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
N.G.设计实验，构建载体，进行转染，生成细胞系并分析数据。j.h hu进行RNA FISH、免疫荧光染色，并协助构建载体。B.H.， j.a huang, Yu Wei, J.P, Yinghui Wei, X.S.和L.S.协助细胞系的生成和分析。Z.J.构建载体，进行qPCR分析和细胞系基因分型。X.H.、Q.X.和H.L.在细胞培养物中进行瞬时转染和分析。N.G.和X.F.进行了western blot。Y.S.和Y.Z.设计了合成的sgRNA序列，并分析了公开的RNA测序数据。C.Z.协助构建了向量。H.Z.和H.Y.构想了这个项目，设计了实验，监督了这个项目，并写了论文。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
额外的信息gydF4y2Ba
同行评审信息gydF4y2Ba自然细胞生物学gydF4y2Ba感谢Rory Johnson, Ophir Shalem和其他匿名审稿人对本工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展数据gydF4y2Ba
图1不同sgrna诱导的mCherry平均强度及miniCMV启动子的优化。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，不同sgrna诱导的mCherry荧光强度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2重复)。注意，在293T细胞中瞬时转染SPH、miniCMV和sgRNA 24小时后，用FACS定量了强度。gydF4y2BabgydF4y2Ba，不同微启动子诱导N2a细胞mCherry表达的代表性图像，瞬时转染24小时后，每个实验独立重复3次，结果相似。比例尺，200 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba，瞬时转染48小时后mCherry的平均荧光强度，gydF4y2BangydF4y2Ba=每组3次(miniCMV vs . Mini-TK，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;miniCMV vs . Luc2CPgydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;miniCMV vs . TRE3G，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，瞬时转染48小时后，不同TS间隔诱导的平均mCherry强度;gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复3次。gydF4y2BaegydF4y2Ba，不同TS间隔下sgRNA拷贝数对mCherry表达的影响，柱状上方数字表示每组重复数。gydF4y2BafgydF4y2Ba，瞬时转染48小时后，SPH-OminiCMV和不同启动子诱导的mCherry平均荧光强度。gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复3次。gydF4y2BaggydF4y2Ba代表性图像显示，SPH-OminiCMV诱导的mCherry水平高于常用的强启动子。tagBFP共转染以控制转染效率。每组独立重复实验2次，结果相似。比例尺:50 μm。所有实验均用质粒瞬时转染N2a细胞。所有数值均以均数±s.e.m.表示;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。统计源数据见源数据扩展数据图1。gydF4y2Ba
图2 SPH-OminiCMV诱导的基因表达水平高于sph介导的内源性激活和cmv介导的过表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， sph介导的内源性基因激活、CMV-和sph - ominicmv介导的外源性基因表达示意图。gydF4y2BabgydF4y2Ba，不同基因的相对mRNA表达量，gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复2次。统计源数据见源数据扩展数据图2。gydF4y2Ba
图3 SPH-OminiCMV的特异性和SPH-OminiCMV转基因mESCs的生成。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，通过在N2a细胞中瞬时转染SPH、OminiCMV和sgRNA，改进的报告系统对错配sgRNA的耐受性。轴:没有。的sgRNA TS;轴:没有。sgRNA。标尺表示平均荧光强度(红色，高;白,低)。sgRNA信息见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复2次。gydF4y2BabgydF4y2Ba，转基因示意图。gydF4y2BacgydF4y2Ba通过PCR对SPH-OminiCMV转基因mESCs进行基因分型，“+”表示阳性群体，“-”表示阴性群体，图像代表几个“+”群体。gydF4y2BadgydF4y2BaSPH-OminiCMV阳性菌群中瞬时表达sgRNA诱导mCherry表达的图像，具有3个实验的代表性。比例尺:200 μm。gydF4y2BaegydF4y2Ba， qPCR定量mCherry相对表达量;gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复3次。所有数值均以均数±s.e.m表示。统计源数据和未处理凝胶见源数据扩展数据图3。gydF4y2Ba
图4将tRNA-sgRNA-tRNA靶向插入3’utr不影响靶基因正常的蛋白生成。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba的3'UTR或内含子中插入了tRNA-sgRNA-tRNA的示意图gydF4y2BaActbgydF4y2Ba， mCherry的平均荧光强度。柱状图上方的数字表示每组的重复数(SPH-OminiCMV-Ents-Intron 1 vs .s。SPH-OminiCMV-Ents-3'UTR,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.5689;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，西方墨迹，gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复4次。gydF4y2BacgydF4y2Ba定量Western blots数据显示，tRNA-sgRNA-tRNA插入到的3'UTRgydF4y2BaActbgydF4y2Ba基因座不影响生产gydF4y2BaActbgydF4y2BaSPH-OminiCMV vs . SPH-OminiCMVgydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.3456;SPH-OminiCMV-Ents vs . P2A-mCherrygydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.6301;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。柱状上方的数字表示每组的重复次数。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba，插入tRNA-sgRNA-tRNA靶向gydF4y2BaLacZgydF4y2Ba在SPH-OminiCMV中mESCs不诱导mCherry的表达，柱状图上方的数字表示每组的重复数。所有数值均以均数±s.e.m.表示;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。统计源数据和未处理的western blots见源数据扩展数据图4。gydF4y2Ba
图5 SPH-OminiCMV-Ents能够在细胞分化过程中显示低丰度基因，将sgRNA阵列插入非表达基因中不会诱导mCherry表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，分化定量时mCherry表达的代表性图像gydF4y2BaEsrrbgydF4y2BaqPCR检测SPH-OminiCMV-Ents-的mRNA水平gydF4y2BaEsrrbgydF4y2Ba分化过程中的mESCs。比例尺，50 μm;gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复4次。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，显示mCherry表达和量化的代表性图像gydF4y2BaSox2gydF4y2BaqPCR检测SPH-OminiCMV-Ents-的mRNA水平gydF4y2BaSox2gydF4y2Ba分化过程中的mESCs。比例尺，50 μm;gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复4次。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，显示mCherry表达和量化的代表性图像gydF4y2BaTet1gydF4y2BaqPCR检测SPH-OminiCMV-Ents-的mRNA水平gydF4y2BaTet1gydF4y2Ba分化过程中的mESCs。比例尺:50 μm，gydF4y2BangydF4y2Ba每组重复4次。gydF4y2BaggydF4y2Ba的3'UTR中插入一个sgRNA或sgRNA阵列的示意图gydF4y2BaSema3agydF4y2Ba轨迹。gydF4y2BahgydF4y2Ba，量化gydF4y2BaSema3agydF4y2BaqPCR在ESCs中的表达gydF4y2BangydF4y2Ba= 3重复。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，显示mCherry表达的图像，4个实验的图像具有代表性。比例尺，50 μm。gydF4y2BajgydF4y2Ba，平均mCherry荧光强度。柱状上方的数字表示每组的菌落数量(SPH-OminiCMV- ents -one sgRNA vs . SPH-OminiCMV，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.5964;SPH-OminiCMV- ents - sgrna阵列vs . SPH-OminiCMV，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0761;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。所有数值均以均数±s.e.m.表示;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。统计源数据见源数据扩展数据图5。gydF4y2Ba
图6单一启动子下驱动dCas9和激活子mCherry的同质表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，矢量示意图。注意，dCas9和P65-HSF1分别由两个CAG启动子表达。gydF4y2BabgydF4y2Ba， SPH-OminiCMV-Ents-的FACS分析直方图gydF4y2BaActbgydF4y2Ba殖民地。gydF4y2BacgydF4y2Ba同一SPH-OminiCMV-Ents-的mCherry-high和mCherry-low细胞之间激活因子表达水平不同gydF4y2BaActbgydF4y2Ba殖民地,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3次重复(高5% vs .低5%:dCas9，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0028;p65-HSF1,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.9161;gydF4y2BaActbgydF4y2Ba，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0743;sgRNA,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0030;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2BadgydF4y2Ba， SPH(单个CAG)的示意图，注意dCas9和p65-HSF1的表达是由单个启动子驱动的。gydF4y2BaegydF4y2Ba， SPH(单CAG) - ominicmv - ents -的FACS分析直方图gydF4y2BaActbgydF4y2Ba殖民地。所有数值均以均数±s.e.m.表示;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。统计源数据见源数据扩展数据图6。gydF4y2Ba
图7 mCherry表达的FACS分析。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba分析流式细胞术数据，显示R1是如何被门控的(侧散射:SSC;前向散射:FSC)。gydF4y2BabgydF4y2Ba不同基因SPH(单CAG)- ominicmv - ents - 1 sgRNA、SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列和P2A-mCherry细胞的FACS分析代表直方图。每个实验都独立地重复了几次，得到了相似的结果。重复次数见图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba， SPH(单CAG)- ominicmv - ents - 1个sgRNA和SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列细胞对不同lncrna的代表性直方图。每个实验都独立地重复了几次，得到了相似的结果。重复次数见图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图8不同策略的并列比较以及分化过程中mCherry和Nanog蛋白水平的下调。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba分析流式细胞术数据，显示R1是如何被门控的(侧散射:SSC;前向散射:FSC)。gydF4y2BabgydF4y2Ba不同基因SPH(单CAG)- ominicmv - ents - 1 sgRNA、SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列和P2A-mCherry细胞的FACS分析代表直方图。每个实验都独立地重复了几次，得到了相似的结果。重复次数见图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba， SPH(单CAG)- ominicmv - ents - 1个sgRNA和SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列细胞对不同lncrna的代表性直方图。每个实验都独立地重复了几次，得到了相似的结果。重复次数见图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图9 SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列诱导mCherry最高表达。gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaSPH-OminiCMV-Ents-one sgRNA、SPH-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列、SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-one sgRNA和SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列系统的荧光强度比较。栏中的数字表示每组菌落的数量。未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。图中还显示了SPH(单CAG)- ominicmv - ents - 1个sgRNA和SPH(单CAG)-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列数据。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba；SPH-OminiCMV-Ents-one sgRNA和SPH-OminiCMV-Ents-sgRNA阵列数据如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac,gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，胚胎干细胞LncRNA表达基质。请注意，数据是从公共GEO数据库(gydF4y2BaGSM2573084gydF4y2Ba)和lncrna按表达量由高到低排列。图中以红色和黑色标记的lncrna。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba．共检测到FPKM值高于0的lncrna 14432个，FPKM值高于的lncrna 9640个gydF4y2BaPvt1gydF4y2Ba．所有数值均以均数±s.e.m.表示;未配对的两个gydF4y2Ba-gydF4y2Ba站在学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。统计源数据和gydF4y2BapgydF4y2Ba值gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在源数据扩展数据图9中提供。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
互补序列。gydF4y2Ba
补充表gydF4y2Ba
表1:sgRNA序列。表2:内源性基因激活的sgRNA序列。补充表3:插入sgRNA前体的sgRNA序列补充表4:用于识别sgRNA插入的引物。补充表5:相对表达量。补充表6:qPCR引物。gydF4y2Ba
源数据gydF4y2Ba
图1 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图1 .来源数据gydF4y2Ba
未加工的西方墨迹。gydF4y2Ba
图2 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图3 .源数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图4 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图5 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图6 .来源数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图1 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图2 .扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图3 .扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图3 .扩展数据gydF4y2Ba
未加工的凝胶。gydF4y2Ba
图4 .扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图4 .扩展数据gydF4y2Ba
未加工的西方墨迹。gydF4y2Ba
图5 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图6 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
图9 .源数据扩展数据gydF4y2Ba
统计源数据。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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引用本文gydF4y2Ba
高楠，胡杰，何斌。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba内源性启动子驱动的sgRNA用于监测低丰度转录本和lncrna的表达。gydF4y2BaNat细胞生物学gydF4y2Ba23gydF4y2Ba， 99-108(2021)。https://doi.org/10.1038/s41556-020-00610-9gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/s41556-020-00610-9gydF4y2Ba
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