锌指抗病毒蛋白对RNA病毒的合理抑制作用gydF4y2Ba

锌指抗病毒蛋白(ZAP)抑制广泛的RNA和DNA病毒的复制gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba}通过识别病毒富含cpg的RNAgydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}并为减毒病毒疫苗的设计提供了机会。减毒活病毒疫苗比其他疫苗方法具有优势，因为它们表达完整的病毒蛋白库，因此呈现最广泛的抗原决定因子，以诱导持久的细胞和体液反应而无需佐剂gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba．然而，产生减毒病毒的合理方法很少，大多数减毒疫苗都是凭经验生产的。一种用于病毒衰减的方法是通过同义诱变重新编码核酸序列。使用这种方法的最初报告将密码子或密码子对替换为在人类基因组中很少发现的对应密码子，这一过程被称为“反优化”。gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}．然而，病毒RNA基因组的反优化可以对结构、稳定性和翻译效率产生多效性影响，通过无法直接预测的多因素机制赋予病毒衰减gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

密码子对去优化导致的衰减附带地增加了两个二核苷酸CpG和UpA (DNA中的TpA)的频率。gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．CpG二核苷酸在脊椎动物基因组中严重代表性不足，而TpA/UpA二核苷酸在整个生命树的生物体中代表性不足gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．CpG在脊椎动物基因组中的代表性不足，为ZAP蛋白利用的非自我RNA识别创造了机会gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}．ZAP n端结构域采用高度选择性的结合袋，只能容纳单链构型的CpG二核苷酸gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}．当一个ZAP分子与一个CpG二核苷酸结合时，单个CpG二核苷酸对病毒复制的影响可以忽略不计。相反，它是多个CpG二核苷酸的累积效应，使ZAP抗病毒活性gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}．然而，目前尚不清楚CpG二核苷酸数、并置和底层序列上下文如何影响病毒RNA的ZAP识别。此外，即使CpG二核苷酸赋予ZAP敏感性，以非引导方式引入CpG二核苷酸可以通过ZAP独立机制对病毒复制产生多向效应gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

不考虑衰减机制的病毒基因组重新编码可能产生免疫原性降低的病毒，这显然是任何疫苗都不希望看到的特性gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．由于ZAP-RNA相互作用可能具有免疫刺激作用gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba，最优编码策略将最大化ZAP绑定，并指定ZAP识别为衰减机制。然而，到目前为止，可用于实现这一目标的序列特征的描述还没有报道。gydF4y2Ba

以HIV-1为模型系统，我们定义了CpG二核苷酸数、间隔和周围序列如何影响ZAP敏感性。然后，我们应用这些参数设计了具有精确和稳定修饰的突变小核糖核酸病毒基因组，作为有效的减毒活疫苗，其复制在细胞培养和体内被ZAP特异性抑制。gydF4y2Ba

CpG二核苷酸和HIV-1复制gydF4y2Ba

HIV-1天然缺乏CpG，对zap有很大的抗药性，而CpG含量升高的突变衍生物对zap敏感gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}．我们首先介绍了两个独特的限制位点(gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba-gydF4y2BaClaI)gydF4y2Ba，每个都含有一个CpG二核苷酸，进入HIV-1gydF4y2BaenvgydF4y2Ba基因(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们同样重新编码了中间序列，没有任何已知的近端gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用的RNA调节元件，以包含零(CG-0)或43 (CG-43) CpG二核苷酸(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．CG-0病毒在未经处理和CRISPR/ cas9编辑的人MT4 t细胞系中与野生型(WT) HIV-1复制无明显区别，这些t细胞系仅表达外显子1编辑的无功能ZAP蛋白。相反，CG-43病毒像WT病毒一样在缺乏zap的MT4细胞中复制，但在表达zap的细胞中存在缺陷(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1氟gydF4y2Ba)．接下来，我们生成了一个HIV-1突变体的集合，这些突变体彼此之间只有一个CpG二核苷酸，其中1到23个CpG二核苷酸的位置靠近gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba如允许同义替换在gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba-gydF4y2BaClaIgydF4y2Ba有界区域(CG-1到CG-23)。虽然所有突变体在缺乏zap的细胞中复制与WT HIV-1无明显区别，但随着CpG二核苷酸数量的增加，病毒复制在表达zap的细胞中逐渐减弱(图)。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba)．总体而言，CG-1到CG-13复制良好，CG-15到CG-23复制较差，CG-14具有中间表型(图2)。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．感染后4 d感染细胞的百分比显示，引入CpG二核苷酸的数量与复制程度之间存在明显的相关性(图2)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．因此，单个CpG二核苷酸具有递增的影响，大约需要15个CpG二核苷酸才能深度抑制HIV-1复制。gydF4y2Ba

CpG二核苷酸的间距和碱基组成与ZAP活性的关系gydF4y2Ba

我们生成了第二个HIV-1突变体集合，每个突变体包含15个CpG二核苷酸，但每个CpG二核苷酸之间的间隔不同。在表达zap的细胞中，含有15个CpG二核苷酸(平均6或11个核苷酸)的病毒用近wt动力学复制。相反，CpG二核苷酸被14或32个核苷酸分离的病毒是有缺陷的(图2)。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)，而15个CpG二核苷酸之间的间隔进一步增加到平均40个核苷酸，其作用就会减弱。gydF4y2Ba

为了检查ZAP与这些突变病毒序列的结合，我们使用具有15个CpG二核苷酸的病毒进行了交联免疫沉淀试验，并结合RNA测序(CLIP-seq)，平均分离11或32个核苷酸。我们测量了CLIP-seq读取到每个核苷酸位置的频率gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba-gydF4y2BaClaIgydF4y2BaHIV-1基因组的间隔。而病毒RNA中不含CpG二核苷酸gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba-gydF4y2BaClaIgydF4y2Ba当CpG二核苷酸平均间隔32个核苷酸时，ZAP结合丰富(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．然而，当CpG二核苷酸定位在平均11个核苷酸的位置时，ZAP与修改后的序列的结合是最小的。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．因此，这些数据表明CpG二核苷酸之间足够的间距对于ZAP识别很重要。gydF4y2Ba

基于之前的CLIP-seq实验gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}和ZAP-RNA晶体结构gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}， ZAP特异性仅由目标CpG二核苷酸决定，而不是侧边核苷酸。然而，CpG二核苷酸存在的总体序列环境是否有助于ZAP抗病毒活性尚不清楚。我们生成了含有0或14个CpG二核苷酸(CG-0和CG-14)的HIV-1突变体，并以相同的方式突变了dna中周围的序列gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba-gydF4y2BaClaIgydF4y2Ba间隔包含最大可能数量的腺嘌呤(A+)，胞苷(C+)，鸟嘌呤(G+)或尿苷(U+)核苷酸(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．A、U或G含量升高的CG-0病毒(CG-0/A+， CG-0/U+和CG-0/G+)复制动力学接近野生型，而富含胞苷的病毒(CG-0/C+)表现出严重的复制缺陷，与ZAP的存在无关(扩展数据图)。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．CG-14/A+、CG-14/U+和CG-14/G+病毒在缺乏zap的细胞中复制与野生型相似，而CG-14/C+病毒表现出与CG-0/C+病毒相似的zap独立缺陷(图2)。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)．值得注意的是，虽然提高G含量(CG-14/G+)对病毒复制影响不大，但CG-14/A+和CG-14/U+病毒严重减弱，特别是在表达zap的细胞中(图2)。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)．因此，增加A或U含量明显增加了CpG二核苷酸赋予ZAP敏感性的能力。gydF4y2Ba

接下来，我们生成了7个HIV-1突变体，每个突变体包含15个额外的CpG二核苷酸，CpG富集序列位于整个细胞的不同位置gydF4y2BaenvgydF4y2Ba基因(扩展数据图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．所有这些病毒在缺乏zap的细胞中复制与WT HIV-1相似，其中5/7表现出zap依赖性衰减。例外的是两种病毒的cpg富集片段位于3′处gydF4y2BaenvgydF4y2Ba核苷酸位置110或889 (CG-15(110)和CG-15(889)，扩展数据图。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．值得注意的是，与其他HIV-1基因组区域相比，这两个区域的A和U频率降低，并且CpG二核苷酸之间的平均间隔在突变体中最低(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．值得注意的是，在cpg富集区间内增加CG-15(889)的腺嘌呤频率以产生CG-15(889)/A+会增加zap依赖的衰减，因此CG-15(889)/A+在表达zap的细胞中特别缺陷(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 d, egydF4y2Ba)．我们得出结论，对ZAP敏感性的明显位置依赖效应可能是由周围的核苷酸组成介导的。gydF4y2Ba

ZAP的选择性压力可以从病毒基因组中耗尽CpG二核苷酸gydF4y2Ba

哺乳动物病毒基因组中CpG二核苷酸的缺乏可能是由ZAP选择驱动的gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}．逆转这一特性以产生zap敏感的减毒活疫苗的潜在用途取决于减毒突变的稳定性。而据报道，密码子对解优化在体外传代过程中是稳定的gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}在ZAP选择性压力下病毒传代过程中，引入CpG二核苷酸的稳定性尚未得到评估。gydF4y2Ba

我们用含有15或43个CpG二核苷酸(CG-15和CG-43)的HIV-1突变体进行了长期连续传代实验。在整个实验过程中(43 d)，表达zap的细胞中CG-43的复制被严重抑制。事实上，CG-43从未感染超过1%的细胞群，也没有观察到典型的HIV-1复制的细胞病变效应。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．相反，CG-15病毒最初在表达zap的细胞中复制得很差，但在后来的传代中能够迅速感染大多数细胞群(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．序列分析显示，在脯氨酸或丝氨酸密码子的摆动位置发生了同义的G-to-A转变，导致每个CG-15实验重复中丢失一个CpG二核苷酸，与复制增加相关(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba)．将这些获得的点突变重新引入亲本CG-15基因组，结果表明，在表达zap的细胞中，单个CpG二核苷酸的缺失导致CG-15的适应度恢复。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．我们得出结论，通过引入大量CpG二核苷酸来衰减HIV-1存在难以克服的遗传和稳定的衰减障碍。相反，当选择压力施加时，大量接近阈值水平的CpG二核苷酸的存在使zap不敏感变体的出现。gydF4y2Ba

工程肠道病毒A71赋予ZAP敏感性gydF4y2Ba

委员会成员gydF4y2Ba引起gydF4y2Ba重要的人类病原体会导致发病率吗gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba大多数人缺乏有效的疫苗。其中一种小病毒是肠道病毒A71 (EV-A71)，可引起幼儿手足口病，偶有严重并发症，包括急性弛缓性麻痹、脑干脑炎和脑膜炎gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．EV-A71具有低频率的CpG二核苷酸(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，因此是一个很好的基因编码候选，以赋予ZAP敏感性，并产生潜在的减毒活疫苗。gydF4y2Ba

EV-A71基因组编码一个单一的多蛋白(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)，裂解产生结构蛋白(VP1, VP2, VP3和VP4)和非结构蛋白(2A, 2B, 2C, 3A, 3C, VPg和RNA依赖的RNA聚合酶)。为了监测EV-A71的复制，我们生成了一种编码NanoLuc荧光素酶的报告病毒，然后在病毒多蛋白的N端有一个2A切割位点，如前所述gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．为了重新编码，我们应用了上述使用HIV-1确定的CpG数、间隔和介入单核苷酸含量标准。我们重新编码了一个约1 kb的目标区域，该区域跨越2C、3A、VPg和3C编码序列，并且是任意选择的，除了它缺乏任何已知的近端之外gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用RNA调控元件(图;gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．在WT EV-A71中，该区域包含32个CpG二核苷酸和261个腺嘌呤(图5)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．我们改变了CpG二核苷酸的数量和分布，以及腺嘌呤含量，产生了3个突变体:(1)EV-A71/A+含有高频率的A核苷酸，但没有增加CpG二核苷酸的数量;(2) EV-A71/CG-48增加了16个CpG二核苷酸，与现有的32个CpG二核苷酸结合，产生了一个平均间隔19个核苷酸的48个CpG二核苷酸片段，但保留了WT单核苷酸组成;(3) EV-A71/CG-48/A+具有16个额外的CpG二核苷酸，定位如上，但在富A序列上下文中(图3)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．所有病毒在缺乏zap的细胞中复制良好(图。gydF4y2Ba4 d-fgydF4y2Ba)．虽然在WT EV-71、EV-A71/A+或EV-A71/CG-48突变体中未观察到复制缺陷，但EV-A71/CG-48/A+突变体在表达zap的细胞中特异性减弱(图2)。gydF4y2Ba4 d-fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

当EV-A71/CG-48/A+突变体在表达zap的细胞中重复传代时，荧光素酶活性随着传代而逐渐降低，最终低于检测限(图2)。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．相反，在缺乏zap的细胞中没有明显的复制缺陷，序列分析显示在传代过程中没有获得逆转突变。在ZAP缺陷细胞的所有EV-A71/CG-48/A+重复中，病毒RNA含量丰富，但在ZAP中，RNA水平低于检测限gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba单元(扩展数据图。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba)．此外，当我们使用NanoLuc检测跟踪病毒复制4天时，感染性病毒产量(TCID)的测定gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)和病毒RNA定量，在ZAP中EV-A71/CG-48/A+突变体复制的三项测量均显著降低gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba与缺乏zap的细胞相比(扩展数据图。gydF4y2Ba5汉英gydF4y2Ba)．因此，观察到的复制缺陷反映了ZAP的真正影响，而不是报告基因不稳定。CpG和A的富集稳定，EV-A71/CG-48/A+在此条件下无法逃脱ZAP。因此，使用HIV-1确定的控制ZAP敏感性的原则可以应用于不相关的RNA病毒，导致稳定的，ZAP依赖的衰减。gydF4y2Ba

编码EV-A71小鼠的zap依赖性衰减gydF4y2Ba

为了确定ZAP是否能抑制EV-A71/CG-48/A+的体内复制，我们生成了ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}C57BL/6小鼠系使用CRISPR引导rna靶向gydF4y2BaZC3HAV1gydF4y2Ba外显子1。可传播种系的编辑的ZAP等位基因包含2个nt插入，引入移码突变，取消ZAP表达(扩展数据图)。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba)．我们在EV-A71中引入了替换，这些替换是小鼠有症状感染所必需的gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba，从而产生“小鼠适应”病毒，以下称为mEV-A71和mEV-A71/CG-48/A+。这些病毒缺乏NanoLuc报告基因，但EV-A71/CG-48/A+表现出与上述NanoLuc编码EV-71报告基因结构相同的zap依赖复制缺陷。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)．因为我们在IFNAR中观察到更一致的mEV-A71发病机制gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}新生小鼠，我们穿过了ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}C57BL/6小鼠线到IFNARgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}C57BL/6鼠标线。然后我们感染了ZAPgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba/ IFNARgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}或攻击gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}/ IFNARgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}mEV-A71或mEV-A71/CG-48/A+并根据先前描述的0-4量表对疾病进展进行评分的新生儿;从无症状(0)到死亡或垂死(4)gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．肢体瘫痪事件(图;gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)在类似小鼠模型中EV-A71感染的特征gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba}mEV-A71感染ZAPgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba或攻击gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}在大多数情况下，疾病进展最终是致命的(图。gydF4y2Ba5 a - cgydF4y2Ba)．相反，ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}mEV-A71/CG-48/A+病毒感染小鼠，几乎全部为ZAPgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba小鼠感染后存活，临床评分较低(图2)。gydF4y2Ba5 a - cgydF4y2Ba)．其中20/26 mEV-A71/CG-48/A+感染ZAPgydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba小鼠没有表现出任何症状，而4只小鼠表现出肠道病毒特异性症状(即肢体瘫痪)，这些症状很快得到缓解(扩展数据图)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．两个杀死gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba一窝老鼠突然死亡，没有肢体瘫痪，这表明它们的死亡不是由于肠道病毒疾病。mEV-A71/CG-48/A+均感染ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠在死亡前出现肠道病毒特异性症状(扩展数据图)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．在mev - a71感染的ZAP中，肌肉中的病毒RNA水平相当gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba和攻击gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}mEV-A71/CG-48/A+-感染的ZAP低60倍gydF4y2Ba^+/+gydF4y2Ba与ZAP相比gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．PCR扩增子序列包括所有小鼠mEV-A71/CG-48/A+基因组的工程区域，其中病毒RNA可检测到(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)显示没有突变。这些数据表明mEV-A71/CG-48/A+在体内具有强而稳定的衰减，且其衰减严格依赖于ZAP。gydF4y2Ba

重新编码的EV-A71在小鼠中引发保护性免疫gydF4y2Ba

我们收集了ZAP的血浆gydF4y2Ba^+/+gydF4y2BamEV-A71/CG-48/A+分别接种1 d和5 d龄小鼠后5周(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．虽然模拟接种小鼠的血浆不能中和EV-A71，但mEV-A71/CG-48/A+接种小鼠的血浆可中和EV-A71感染，中和滴度为50% (NTgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba在1日龄感染的小鼠中(中位数NTgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba5日龄感染小鼠的滴度为627 ~ 1514(中位数NTgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba= 1162)(图gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．接下来，我们的目标是确定这些中和抗体是否在体内具有保护作用。由于mEV-A71的生产性感染在小鼠中是年龄敏感的gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba，我们进行了被动保护实验，在实验中，先前模拟接种或接种mEV-A71/CG-48/A+的雌性的新生儿后代受到WT mEV-A71的挑战。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)．在这种类型的实验中，哺乳的幼崽通过母乳获得抗体gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba．雌性幼鼠在1 d或5 d龄时接种mEV-A71/CG-48/A+(图2)。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)显示疾病减轻(1日龄和5日龄感染小鼠在第20天的中位临床评分分别为0.52和0.24)，与模拟治疗的雌性幼崽相比，存活率增加(1日龄和5日龄感染小鼠在第20天的中位临床评分分别为3.14和2.86)(图。gydF4y2Ba5克gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)．我们的结论是，在小鼠中复制zap减毒的mEV-A71/CG-48/A+会在接种雌性小鼠的后代中被动转移抗体，并对mEV-A71疾病具有保护作用。gydF4y2Ba

对影响HIV-1对ZAP敏感性的序列特征的描述(CpG的数量、间隔和上下文)使我们能够开发设计规则，我们应用这些规则来设计以严格条件方式强衰减的小核糖核酸病毒突变体。每个影响ZAP敏感性的CpG二核苷酸之间的紧密距离和在CLIP-seq中ZAP的结合表明，与相邻CpG二核苷酸结合的ZAP分子可能相互竞争，这与模型研究表明ZAP结合约13个核苷酸的RNA序列一致gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．紧密间隔的CpG二核苷酸也可能促进RNA二级结构，从而抑制ZAP的进入gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba．相反，宽CpG间距会降低灵敏度。ZAP与TRIM25的相互作用gydF4y2Ba^13gydF4y2BaZAP和KHNYN之间gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba，两个已知的ZAP辅助因子，似乎是由蛋白质-蛋白质接触介导的;因此，结合到相邻CpG二核苷酸上的ZAP分子和辅因子可能会合并，从而促进活性ZAP:TRIM25:KHNYN配合物的组装。gydF4y2Ba

RNA结合蛋白特异性的研究通常集中在对特定RNA序列的识别上。虽然许多rna结合蛋白可以识别特定的序列基序，但上下文特征，如侧翼核苷酸组成，对于确定目标特异性至关重要gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba．在病毒基因组中增加腺嘌呤或尿苷含量可能会增加对RNA酶的敏感性，例如在病毒RNA中切割UpA和UpU二核苷酸的RNAse L，并且我们注意到我们的A或u富集的病毒基因组包含更多数量的UpA二核苷酸gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．然而，A/U富集的病毒在缺乏ZAP的细胞中复制与野生型HIV-1相同，这表明由A/U富集造成的缺陷是ZAP特异性的。A或U富集的一个明显影响是降低稳定的二级RNA结构，可能会增加CpG二核苷酸对ZAP的可及性。gydF4y2Ba

病毒衰减的所有方法都必须在降低发病机制与降低伴随受损的病毒基因组表达和复制的抗原水平之间取得平衡。原则上，基于ZAP敏感性的病毒程控衰减可以通过CpG数和可访问性的变化进行调整。由于在HIV-1中赋予ZAP敏感性的RNA特征很容易转移到非常不同的病毒(EV-A71)上，这些方法可能是普遍适用的，而且几乎任何表现出CpG损耗的病毒都可能是这种编码方法的合适靶点。重要的是，到目前为止还没有在人类中发现ZAP的功能丧失突变，但需要进一步的研究来评估ZAP中现有的遗传变异是否会使一些人对富含cpg的病毒更敏感，以及我们在细胞培养和小鼠中观察到的HIV-1和EV-A71引入突变的稳定性是否可以推广到富含cpg的病毒接种的人。通过设计的ZAP敏感性来衰减可能对具有其他ZAP逃避机制的病毒无效，例如针对ZAP或辅助因子的消耗，尽管目前还不知道这样的病毒。值得注意的是，严格依赖于zap的衰减允许在缺乏zap的细胞中培养高滴度的活疫苗储备。其他的优势可能源于报道的观察，RNA识别的ZAP是免疫刺激gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．事实上，用富含cpg的A型流感病毒感染小鼠引起的免疫反应与病毒复制水平不成比例gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．通过非引导反优化的zap独立衰减可能会放弃这些好处。我们还注意到，本文所描述的原理也可能在基于核酸的基因传递载体的工程中被证明是有用的。事实上，从基因传递载体的DNA中消耗CpG二核苷酸被报道可以提高性能gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果识别了ZAP识别外源RNA的重要序列特征，从而能够对两种不同的RNA病毒进行高度特异性的合理衰减。我们的发现建立了工程cpg富集病毒的设计原则，这些病毒是有条件衰减的，可以在小鼠中引起保护性免疫反应，从而为合理设计具有疫苗潜力的减毒活病毒铺平了道路。gydF4y2Ba

细胞与动物gydF4y2Ba

人胚胎肾(HEK) 293T ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}TRIM25gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}细胞gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba， HeLa LCV1(非靶向控制)和ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}细胞gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}在添加胎牛血清(FBS)和庆大霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。一个杀死gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}如前所述，使用CRISPR-Cas9生成基于RD细胞的细胞系gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}以及靶向人类ZAP外显子1的向导RNA (5 ' - ggccgggatcacccgatcggtg -3 ')。MT4 LCV1和MT4 B1 ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}细胞系gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}在添加FBS和庆大霉素的RPMI培养基中培养。gydF4y2Ba

序列设计和质粒构建gydF4y2Ba

含有增强绿色荧光蛋白的HIV-1前病毒质粒gydF4y2Ba(EGFP)gydF4y2Ba基因gydF4y2BaNefgydF4y2Ba位置(NHG, GenBank: MF944225.1)被设计为包含唯一的gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba而且gydF4y2BaClaIgydF4y2Ba酶切位点分别位于核苷酸位置6325和6771gydF4y2BaenvgydF4y2Ba基因。之间的编码区组成的DNA序列gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba而且gydF4y2BaClaIgydF4y2Ba限制性内切位点被设计用于调节引入CpG二核苷酸的数量和位置以及背景单核苷酸频率，而不改变编码的氨基酸。对于改变了CpG二核苷酸数量的突变体，通过将5 '密码子的摆动位置替换为胞苷，或将丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸和丝氨酸密码子的摆动位置替换为鸟嘌呤，在密码子边界引入CpG二核苷酸。每个CpG二核苷酸周围的序列被保留，就像HIV-1 NHG野生型序列一样。对于每个CpG二核苷酸之间具有可变间距的突变体和在具有不同位置的突变体gydF4y2BaEnvgydF4y2Ba基因，采用类似的方法，在密码子边界或密码子内部修改密码子的摆动位置，引入一个CpG。同样，对于修改后的摆动位置，周围的序列保持了它们在野生型序列中出现的状态，但有一个例外:在一些间隔突变体中，四个丝氨酸密码子被取代(AGT/AGC—>TCG)。最后，通过保持CG-14病毒中14个CpG二核苷酸的位置，并将所有其他密码子替换为包含所需核苷酸的密码子，设计了具有修饰单核苷酸组成的突变体。例如，在A+突变体中，亮氨酸密码子(CUU)被含腺嘌呤的亮氨酸密码子(CUA)取代，精氨酸密码子(AGG)被含腺嘌呤的密码子(AGA)取代等等。在所有情况下，没有引入额外的CpG二核苷酸。所有序列都使用内部构建的脚本进行设计，并使用MaxEntScan检查是否无意中引入了拼接位点gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．合成DNA序列编码修改的序列被购买(Twist Bioscience)插入到HIV-1 NHGgydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba而且gydF4y2BaClaIgydF4y2Ba使用标准克隆程序修饰的前病毒质粒。gydF4y2Ba

编码肠道病毒A71株41的质粒gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba作为构建EV-A71突变体的基础。编码D1270和R1586之间肠病毒多蛋白区域的DNA序列被设计为在不改变氨基酸序列的情况下调节CpG二核苷酸的数量和位置以及周围腺嘌呤含量，如上所述。我们购买了编码修饰序列的合成DNA序列(Twist Bioscience)，并使用该方法插入EV-A71基因组质粒gydF4y2BaBstEIIgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSacIIgydF4y2Ba限制的网站。如前所述，生成编码NanoLuc荧光素酶的报告基因EV-A71gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba通过将NanoLuc基因插入EVA-71多聚蛋白N端2A切割位点。通过插入先前描述的小鼠自适应替换，生成了EV-A71野生型和EV-A71/CG-48/A+的小鼠适应版本gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．这些突变是VP2中的K149I, VP1中的Q145E和K244E。此外，为了改善这些病毒在人类细胞系中的复制，先前描述的取代(VP1中的H37K)gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba还介绍了。gydF4y2Ba

病毒生产gydF4y2Ba

生产HIV-1突变型和野生型病毒原液HEK293T ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}TRIM25gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}用HIV-1 NHG前病毒质粒和编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的质粒转染细胞。第二天更换细胞培养基，转染后48 h，收集上清，离心(10 min, 2000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba)并通过0.22 μ m过滤器过滤。根据制造商的指南，使用lentii - x浓缩器(Clontech)浓缩收集的病毒，并在无血清DMEM中重悬。gydF4y2Ba

如前所述，生成EV-A71野生型和突变型病毒gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．简单地说，病毒质粒是线性化的gydF4y2BaMluIgydF4y2Ba限制性内切酶和纯化柱。然后根据制造商的指导方针，使用T7 RiboMAX Express大规模RNA生产系统使用线性化DNA生成病毒RNA。然后使用TransIT-mRNA转染试剂盒在缺乏zap的RD细胞中转染病毒RNA。过夜孵育后，更换培养基，监测细胞病变效果。当在~80%的细胞中观察到细胞病变效应时，收集上清液并通过0.1µm过滤器过滤。病毒储存在缺乏zap的RD细胞中传代一次。所有病毒储存液在使用前保存在−80°C。gydF4y2Ba

HIV-1复制检测gydF4y2Ba

用于传播感染，1.5 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaMT4细胞被400个VSV-G伪型HIV-1 NHG感染在总共2 ml的完整RPMI中。感染后每天将细胞重悬，收集100µl细胞悬液并固定在4%多聚甲醛中，用100µl新鲜RPMI补充培养。gfp阳性细胞百分比用流式细胞仪测定，用FlowJo计算。对于长期病毒传代实验，7.5 × 10gydF4y2Ba^5克ydF4y2Ba用2000个感染单位的CG-43或CG-15 HIV-1 NHG突变体感染MT4细胞。每2 d将细胞重悬，100µl细胞悬液固定在4%多聚甲醛中，用流式细胞仪检测gfp阳性细胞的百分比。当gfp阳性细胞百分比大于85%时，收集上清液，通过0.22 μ m过滤器过滤，作为接种物感染新鲜的MT4细胞。用TRIzol从传代上清液中分离病毒RNA，用SuperScript III第一链合成系统进行逆转录gydF4y2BaenvgydF4y2Ba使用以下引物进行扩增:5 ' - acagaaaaattgtgggtcaccgtcctattatggg -3 '和5 ' -GCTGGTAGTATCATTATCGATTGGTATTATATCAAG-3 '。然后通过位点定向诱变将在逆行病毒(S115 G6565A, P118 G6574A)中鉴定的突变引入HIV-1 NHG CG-15构建。病毒储存的产生如上所述，并在扩散感染试验中评估其复制。gydF4y2Ba

EVA-71复制测定gydF4y2Ba

在37°C下，以0.02的感染倍数(MOI)感染HeLa细胞1小时。然后将细胞在PBS中洗涤两次，并在37°C的完全DMEM中培养。在指定的时间点，收集100µl的培养上清液，与25µl的5x浓缩被动裂解缓冲液(Promega)在室温下孵育5分钟。NanoLuc荧光素酶活性根据制造商指南使用Nano-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测定。长期病毒传代实验，细胞感染后4 d，收集上清液，离心(10 min, 2000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba)并通过0.22 μ m过滤器过滤。将收集到的病毒稀释，在MOI = 0.02时用于再感染细胞。中位组织培养感染剂量(TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)使用细胞病变效应读数确定，并按先前描述的方法计算gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba使用RD ZAPgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}靶细胞。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

细胞在添加β-巯基乙醇的NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)中裂解。然后在72°C下加热20分钟，超声15秒。将蛋白质样品溶解在NuPAGE 4-12%， Bis-Tris蛋白凝胶(Invitrogen)上，转移到硝化纤维膜上，并用拦截阻断缓冲液(Li-Cor)阻断，并与以下抗体孵育:抗zc3hav1(兔多克隆抗体，16820-1-AP, Proteintech)在人MT4细胞系样品中以1:5 000稀释的PBS中添加Tween20，抗zc3hav1(兔多克隆抗体，abx124715, Abbexa)在5%牛奶中以1:300稀释的PBS-Tween20用于小鼠外周血单个核细胞样品和抗-α-微管蛋白(小鼠单克隆抗体，T5168, Sigma)。在4°C孵育过夜后，膜在PBS-Tween20中洗涤，用辣根过氧化物酶偶联二抗进行印迹，并使用C- digit化学发光western blot扫描仪进行显影。gydF4y2Ba

CLIP-seqgydF4y2Ba

所有CLIP-seq实验均按前文所述进行gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba经过以下修改。HEK293T杀死gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}TRIM25gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}用前病毒质粒和编码ZAP长异构体(ZAP- l)的质粒和三个连续c端血凝素(HA)表位标签转染细胞。第二天，更换培养基，加入4-硫脲培养16小时。然后用冷PBS冲洗细胞并暴露在紫外线辐射下。ZAP:用抗ha抗体免疫沉淀分离RNA复合物，并将RNA连接到荧光标记的3 '适配器上。RNA被分离并连接到一个5 '连接体上，使用SuperScript IV第一链合成系统(Invitrogen)进行逆转录。所得到的互补DNA文库使用Illumina引物进行扩增，并使用NovaSeq测序仪(洛克菲勒基因组资源中心)进行测序。读取按照前面描述的那样进行处理gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}并与HIV-1 NHG基因组相一致。gydF4y2Ba

小鼠实验和zap基因敲除小鼠的生成gydF4y2Ba

本研究中使用的所有小鼠都来自C57BL/6系或C57BL/6JgydF4y2BaIfnar1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}敲除系(MMRRC, 32045)gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba．除了被动保护实验中专门使用雌性小鼠(以产生免疫坝)外，研究人员使用了两性小鼠。所有的动物实验都是根据洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会进行的。gydF4y2Ba

C57BL/6小鼠由洛克菲勒大学CRISPR和基因组编辑资源中心通过合子注射Cas9与靶向小鼠外显子1的引导RNA合成gydF4y2BaZC3HAV1gydF4y2Ba基因(ZAP-B引导序列:5 ' - agtacttgcgacggcagacgcg -3 ')。对结果的幼崽进行尾巴处理，并提取基因组DNA。引物为ZAP-SA-F1 5 ' -GGGGTCTAACTTCACAGGAGT-3 '和ZAP-SA-R1 5 ' -CCTCACGTCTAGCCTGGAAC-3 '。鉴定出2个DNA损伤，其中1个(+2插入)通过育种纯化至纯合子。糟了!gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}IFNARgydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}将纯合子的zap -敲除小鼠与C57BL/6杂交生成小鼠gydF4y2Ba^{/ IFNAR1−−gydF4y2Ba}老鼠(B6.129S2 -gydF4y2BaIfnar1gydF4y2Ba^{tm1AgtgydF4y2Ba}/Mmjax)从杰克逊实验室购买。gydF4y2Ba

小鼠mEV71感染gydF4y2Ba

为评价mEV-A71及其突变体的复制和致病性，采用1日龄乳鼠腹腔注射1 × 10的方法gydF4y2Ba^5克ydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba小鼠适应的mEV-A71(野生型)或mEV-A71/CG-48/A+。每天监测幼崽的症状，共持续20天。如前所述，测量临床评分gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba经过以下修改:0，健康;1、弱/昏昏欲睡;2、单肢瘫痪;3、四肢瘫痪;4、死/垂死的安乐死。当观察到四肢瘫痪48小时没有恢复时，受影响的小鼠被人道地安乐死。为了检测病毒RNA，小鼠在感染后6 d被安乐死。收集后肢骨骼肌，在处理前用RNAlater溶液(Thermo)保存。根据制造商指南将器官在TRizol LS试剂中解冻并均质。利用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)对分离的RNA进行逆转录，利用定量RT-PCR对病毒RNA分子进行定量gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba人基因表达母核苷酸和以下寡核苷酸:探针EV-A71: 5 ' - 6fam - attccaaaagaaagcactatccagagc - mgbnfq -3 '，正向引物:5 ' - gaacctcgtcctgggaagatagctcc -3 '，反向引物:5 ' - tcgccgggctcagagtggcct -3 '。gydF4y2Ba

被动保护实验，女ZAPgydF4y2Ba^+/+gydF4y2BaIfnar1gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}先前感染mEV-A71/CG-48/A+病毒的小鼠以及6周龄的模拟处理的雌性小鼠与naïve配对gydF4y2BaIfnargydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}男性。由此产生的后代通过如上所述的腹腔内途径感染mEV-A71野生型。如上所述，每天监测感染小鼠直到断奶年龄。gydF4y2Ba

EV-A71中和抗体测定gydF4y2Ba

mEV71/CG-48/A+接种小鼠于感染后4周和6周采血。如前所述，等离子体被热灭活gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba，与EV-A71 NanoLuc报告病毒连续稀释，37℃孵育1 h。然后用病毒感染HEK293T细胞，并在37°C下进一步培养48小时。然后用被动裂解缓冲液(Promega)裂解感染细胞，并按上述方法测定纳米荧光素酶活性。NTgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba在GraphPad Prism中使用非线性回归(无加权的最小二乘回归)计算滴度。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有统计分析均使用GraphPad Prism 9进行。传播感染数据以均数±s.d表示。为了比较病毒突变体和ZAP的存在，使用了双向方差分析(ANOVA)和Šídák的多重比较检验。定量病毒RNA和荧光素酶活性绘制为均值±s.d。对于等离子体中和数据，均绘制了平均值和扫描电镜。我们在之前C57BL/6小鼠感染模型实验的基础上，选择了相应的样本量进行动物实验gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba．为了评估感染小鼠临床评分的统计学意义，我们进行了双向方差分析，而生存概率的差异则使用Mantel-Cox检验进行评估。详细的统计检验，样本量以及gydF4y2BaPgydF4y2Ba每个实验的数值都在各自的图例中描述。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba