CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞不影响SIV水库建立在艺术gydF4y2Ba

艾滋病毒治疗的关键障碍是潜伏性感染细胞的人口窝藏集成replication-competent病毒(即“病毒水库”),无限期地持续抗逆转录病毒治疗(ART)治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)来华的人gydF4y2Ba^{1克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba}。负责建立和维护机制的水库仍不完全理解人类艾滋病毒感染和猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的恒河猴(gydF4y2Ba解剖gydF4y2BaRMs),代表了大多数非人类灵长类动物模型用于感染艾滋病毒和艾滋病gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

许多证据表明,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-cell-mediated细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性起着重要的作用在控制病毒复制急性HIV / SIV感染gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。首先,甲流病毒血症的衰落后发生病毒特异性CD8的出现gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,这表明这些细胞参与的初始控制病毒复制gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}。第二,病毒突变体可以CD8逃脱gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞反应迅速成为病毒固定的人口,因此展示强大的进化压力对CD8的病毒gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba}。第三,CD8的损耗gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在急性猴免疫缺陷病毒感染导致的废除甲流病毒血症的衰落gydF4y2Ba^{12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}。值得注意的是,最近的研究还表明,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞抑制病毒通过溶生产机制,抑制艾滋病毒/ SIV转录gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba},从而导致小说范式CD8的根据gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞控制病毒血症通过规范化的细胞毒性T淋巴细胞和溶细胞抑制的病毒生产gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们使用了先前验证体内抗体介入CD8的实验系统gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞耗竭gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}研究病毒的机制负责建立水库在SIV-infected ART-treated RMs。本研究的结果是,CD8的关键gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞不影响SIV水库建立在艺术。gydF4y2Ba

CD8后病毒血症的衰减较慢gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞耗竭gydF4y2Ba

在当前的研究中,21个印度,成人RM(扩展数据表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)静脉注射感染猴免疫缺陷病毒(注射)10000 IU的编码gydF4y2Ba_{mac239MgydF4y2Ba}包含~ 10000 clonotypes比例大致相等gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba,一个标准的艺术疗法(替诺福韦/ TDF Emtricitabine /贸易委员会,Dolutegravir /壳体在第14天开始感染后(p)。RMs(图被分成三组。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba):(1)8动物收到一个50毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}剂量的anti-CD8α-depleting抗体MT807R1 1 d SIV感染(组1:Pre-infection CD8之前gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗);(2)8动物收到MT807R1艺术开始前1 d(组2:与CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗);和(3)5动物作为控制(第三组)。RMs都对待艺术50周,然后进行分析治疗中断(ATI),之后他们监控验尸前12周。gydF4y2Ba

在第14天决定开始艺术pi和耗尽CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与CD8淋巴细胞在一天13 pigydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗组是基于之前的研究,确定了出现SIV-specific CD8 T细胞和细胞毒性T淋巴细胞的存在压力(以逃避突变的病毒准种)14 d p。gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}。在当前的研究中,我们量化SIV-specific CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在未用尽的第14天pi集团利用体外刺激SIV肽和CD8的频率测量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD95gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba2,T细胞表达Granzyme B, CD107a TNF-α和IFN-γ这些肽(扩展数据图。gydF4y2Ba1 a, bgydF4y2Ba)。正如所料,当研究CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从淋巴结T细胞收集(LN)未用尽的RMs的外周血单核细胞(PBMCs)从先前的研究还使用SIVgydF4y2Ba_{mac239gydF4y2Ba},我们发现SIV-specific CD8强劲gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞反应是出席第14天pi在所有的动物。因此,这些数据证实,体内抗原暴露的相对较短的窗口(0 - 14天皮。)就足以产生病毒特异性CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞反应。与以前的研究一致gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}、治疗与MT807R1后跟一个快速损耗CD8的99.7 - -99.8%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血液中的T细胞pre-infection和与CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗与基线相比(图组。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)。在LN,基线示例并不可用,CD8的水平gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞后MT807R1政府pre-infection分别为99.6%和95.3%,与CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗组,分别比未用尽的动物(扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba这些细胞的淋巴细胞耗竭之后,重新MT807R1管理局(扩展数据图后42天。gydF4y2Ba2 d, egydF4y2Ba)。正如所料,CD8的调整gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞CD8的频率增加gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞表达ki - 67和PD-1血液和LN(无花果。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2外:我gydF4y2Ba)。如扩展数据图所示。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba,重新繁衍CD8的大部分gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞CD28中gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD95gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba中央内存(TgydF4y2Ba_{厘米gydF4y2Ba})或CD28gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD95gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba记忆效应(TgydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}亚种群,慢CD28的调整gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD95gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba幼稚细胞(TgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba)。值得注意的是,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞耗竭与重大变化无关循环CD4的水平gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞与未用尽的动物(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。同样的,我们没有观察到任何重大变化在组织循环或LN-based CD4的分数gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞表达ki - 67(扩展数据图。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba),或者在循环或LN-based CD4的分数gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTgydF4y2Ba_NgydF4y2Ba或TgydF4y2Ba_{厘米gydF4y2Ba}细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba5 fgydF4y2Ba)。相比之下,一个温和但显著增加CD4的分数gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTgydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}观察血液和LN RMs属于“pre-infection CD8”呢gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗组(扩展数据图。gydF4y2Ba5 c, f-hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

当时的艺术启蒙(第14天皮),所有RMs显示出类似的血浆病毒血症(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 a、bgydF4y2Ba),与先前的研究一致gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba,类似的条形码多样性(扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。然而,纵向定量测定病毒血症的前3周期间艺术揭示了RMs的缓慢下降1 - 2(即pre-infection和与CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗)(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba),而控制。特别是,我们发现病毒血症在21天,28和35 p。我(th一个t我s, days 7, 14 and 21 from ART initiation) was significantly higher in the CD8^+gydF4y2Ba枯竭的组织与控制(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)。同样,病毒载量7 d下降率这两天0到7损失率起始和14天、21天损失率起始CD8明显降低gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba枯竭的组织与控制(图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。这尽管慢病毒血症的衰落,RMs达到艺术的完整病毒学抑制在5个月内,病毒血症低于60册每毫升血浆(扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

经典的病毒动力学的研究后病毒血症的艺术展示了一种两相的衰变gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}。大部分的等离子体病毒是由短暂的有效感染细胞(gydF4y2BatgydF4y2Ba_1/2gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba1 d),而第二个人口和半衰期的周使得病毒血症贡献较小。假设艺术也同样有效地抑制新创轮猴免疫缺陷病毒复制在所有组,观察明显慢衰落的艺术CD8后病毒血症gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba耗尽RMs表明,CD8的缺失gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,体内寿命的有效生产大部分血浆病毒感染细胞长和/或每个被感染的细胞产生的病毒粒子数较高,可能由于实验取消SIV-specific CTL活性。gydF4y2Ba

CD8的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在t细胞耗竭SIV-DNAgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba

确定CD8的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗的大小病毒水库下艺术,我们下一个测量总细胞相关的水平(CA) SIV-DNA血液,LN-derived CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在前4个月的治疗T细胞。如无花果所示。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2BaCD8的损耗gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞并没有改变总的CA-DNA的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在第14天皮细胞。重要的是,SIV-DNA的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞后拒绝艺术具有相似动力学RMs的所有组织,和聚合类似每天116和56的艺术水平的血液和LN,分别(无花果。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)。我们下一个测量CA SIV-DNA的递减率gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞不同时间点之间在艺术血液(0和14天;14天、28天的评分;天28和42)和LN(0和14天;14天、28天的评分;天28和56)和组之间没有发现差异,除了快衰落的孤立的发现天0至14的LN pre-infection损耗组与对照组(无花果。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

下一个决定CD8的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗在CD4的分数gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞窝藏replication-competent病毒,我们使用了一个SIV-adapted最近版本的完整描述前病毒DNA化验(IPDA)gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。这个化验代表一个可靠的替代细胞窝藏replication-competent病毒的直接测量quantitative-viral测定产物gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba,这是不可能执行由于小数量的收集细胞。如无花果所示。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 c, dgydF4y2Ba的纵向评估IPDA的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在血液和LN显示两组CD8之间的相似的动力学gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba枯竭的RMs和控制。此外,我们比较了每10 SIV完整DNA复制的速度下降gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞之间的各种艺术后的时间点血(0天、28天的评分;天28和56;天56和105)和LN(0天、28天的评分;天28和56;天56和105年),又没有发现三组之间的主要区别,除了天56和105年之间下降更快的血pre-infection损耗组和淋巴结的与损耗组(图。gydF4y2Ba2 g hgydF4y2Ba)。此外,我们测量,在同一时间点,CD4的分数gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞表达hypermutated前病毒最近使用验证hypermutated前病毒DNA化验(HPDAgydF4y2Ba^26gydF4y2Ba),又没有发现显著差异在HPDA如今衰落的动力学gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba三组细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba7 e, fgydF4y2Ba)。总的来说,这些数据表明CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗pre-infection或执行与不改变受感染血液或细胞LN的衰减动力学。gydF4y2Ba

上述分析表明,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞耗竭与慢病毒血症在艺术的首次下降。然而,我们观察到在减少和控制猕猴类似早期SIV-DNA总数的下降gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和SIV-DNA都没有长期影响gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞或IPDAgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和HPDAgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。一个潜在的解释是,短暂的细胞产生的大部分血浆病毒循环SIV-DNA只代表一小部分,其中还包括长寿细胞gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。因此,更快失去短暂的细胞可以更难检测高比例的长寿SIV-DNA上面gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。此外,大多数感染细胞和血浆病毒的主要来源可能是内脏相关组织如LN和淋巴组织,这是一个病毒复制和CD4的主要网站gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞耗竭的SIV模型gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。更好地量化后的病毒动力学的艺术,我们开发了一个数学模型,其中包括一个短暂的人口有效感染细胞和第二人口长寿的潜伏性感染的细胞。这些人群的寿命模型包含不同,以及不同的每个细胞病毒生产和微分灵敏度CD8-mediated CTL瞄准。我们安装这个模型对病毒血症合并后的数据,随着时间的推移CA-RNA和CA-DNA估计CD8的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞有效和潜伏性感染细胞(图gydF4y2Ba2 i (kgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 a - cgydF4y2Ba)。这个模型再现了预期的两阶段治疗后病毒动力学衰减,代表第一阶段快速失去短暂的细胞产生高水平的病毒。模型的拟合参数显示了三个重大变化在感染动力学CD8的结果gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗。首先,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗影响感染动力学在早期感染,导致更高分数的短暂有效感染细胞的治疗(对照组为48.7%、71.4%和76.0% pre-infection和与损耗,分别;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001的比较控制和每个治疗组)(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。此外,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞耗竭与死亡的速度较慢,有成效地感染细胞(控制,0.65 dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}vs pre-infection损耗,0.38 dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(gydF4y2BaPgydF4y2Ba0.49 < 0.001 vs控制)和与损耗,dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.010 vs控制))(扩展数据图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)。此外,CD8损耗导致更高层次的平均血浆病毒生产长期受感染的细胞pre-infection耗尽动物(控制,5.2×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba猴免疫缺陷病毒RNA复制毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}每10 / CA-DNA副本gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞vs pre-infection, 1.86×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001 vs控制),与8.7×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.14 vs控制))(扩展数据图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗ATI后不会影响病毒反弹gydF4y2Ba

大部分的艺术启蒙和感染细胞发现在最初的阶段衰减不成为稳定的一部分潜在的储层gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba。在目前的研究中,我们发现CD8的没有明显效果gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba消耗在这个人口。作为一个功能的评估CD8的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba枯竭油藏规模,我们下一个执行一个ATI 50周后艺术开始,也就是说,当病毒血症中无法在所有治疗动物(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。这是最健壮的方法来评估临床显著的持久性潜伏性感染细胞的人口。如无花果所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,所有RMs经历了反弹的病毒血症在15 d从ATI,没有动物显示控制的病毒血症(扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。而病毒血症曲线下的面积没有明显不同团体,我们注意到一个趋势增加了病毒复制post-ATI RMs属于组1(即pre-infection CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗)。确定这一趋势可能归因于SIV-specific CD8的缺乏gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,我们评估CD8的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD95gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba2,T细胞表达Granzyme B, CD107a TNF-α和IFN-γSIV肽在体外刺激PBMCs期间收集的艺术在19周皮。(扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。我们发现类似SIV-specific CD8的频率gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8 t细胞反应gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba枯竭的组织和控制,这表明在CD8抗原暴露gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞reconsitution足以产生SIV-peptide特定反应尽管艺术上的动物。正如所料,ATI后观察到的较高的病毒血症与CD4检测增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞激活,ki - 67的分数来衡量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba9 b, cgydF4y2Ba)。定量确定是否以及在多大程度上CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaATI损耗影响病毒血症的反弹之后,我们使用先前描述的方法集的副本数量的比例不同的条形码和病毒的增长率gydF4y2Ba^{18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba}。符合相似的病毒动力学的反弹,我们发现了一个类似的活化率(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba每天)和增长率的病毒血症(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)在所有组。此外,我们发现选点病毒载量不统计组(图中不同。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)。总的来说,这些数据表明病毒动力学的分析后反弹ATI的功能评估的总体大小水库replication-competent病毒未能揭示枯竭和未用尽的动物之间的任何统计上的显著差异。因此,这种分析证实,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba耗尽之前SIV感染或立即进行抗逆转录病毒疗法之前不会导致扩大的水库。gydF4y2Ba

当前的研究实验措施CD8的角色gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞在水库建立持久的艺术。这项研究涉及CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba耗尽之前SIV感染或立即使用抗逆转录病毒疗法之前,进行了14天皮。CD8的主要研究结果gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗(1)与长寿命的有效病毒感染细胞和/或增加生产在每个细胞的基础上,(2)不大幅增加的大小受感染的细胞群在血液或总SIV-DNA LN的gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和细胞窝藏完整的前病毒和(3)不大幅增加持久的大小水库功能评估通过分析病毒ATI后反弹。我们相信这些结果代表着我们的一个重大进步的理解机制负责建立持久水库下艺术。gydF4y2Ba

两个涉及CD8的先前的研究gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗在艺术开始表明,CD8 SIV-infected RMsgydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞不减少有效感染细胞的寿命gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba};然而,在这些研究中,艺术开始在慢性SIV感染,也就是说,当ctl的功效已经受病毒逃避和疲惫。在目前的实验中,艺术开始在急性感染,代表峰值的时间特异性细胞毒性t淋巴细胞活动的功效gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。符合这种模式,我们观察到一个清晰的CD8的效果gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗在病毒血症的斜率下降,我们假设有关主要SIV-specific ctl的消融,来降低病毒复制急性HIV / SIV感染(审查期间ref。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)。值得注意的是,另一种可能性,CD8病毒血症的下降较慢,观察gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba枯竭的群体是由于增加数量的病毒生产CD4 /增殖激活gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(由于homoeostatic刺激或以应对更高的抗原水平)是不支持的CD4的测量gydF4y2Ba^+gydF4y2Baki - 67gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。在这项研究中,CD8损耗影响的CD4水平gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba比先前的研究t细胞激活似乎不那么引人注目gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba}。这部分差异可以解释为在目前的实验中,RMs接受CD8损耗CD4的时候gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞激活也受到急性SIV感染和艺术启蒙,因此可能稀释CD8的直接影响gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗在CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞激活。gydF4y2Ba

证据支持一个主要角色ctl在急性HIV / SIV感染包括(1)病毒特异性CD8的观察gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞反应扩大在甲流的减少血浆病毒血症gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba};(2)病毒对CD8 CTL逃避突变出现在回应gydF4y2Ba^+gydF4y2Bat细胞的压力gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba};(3)特定的mhc i等位基因与疾病进展慢gydF4y2Ba^{36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba};和(4)精英控制器与多官能度表型与ctl,体外增殖能力和潜在的死亡gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}。因此,正式的演示,CD8的去除gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-cell-mediated CTL活动期间急性SIV感染导致更长寿命的有效病毒感染细胞和/或增加生产在每个细胞的基础上大量的实验证据的证据相吻合CTL的抗病毒作用。gydF4y2Ba

然而,引人注目的是意想不到的发现CD8的当前的研究gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗没有引起显著增加的大小持续的潜在储层评估直接或通过动力学分析的病毒血症ATI后反弹。有几个,non-mutually独家假说来解释这个观察:(1)细胞的大部分被CTL注定死不管怎样通过virus-mediated细胞病变效应和/或activation-induced细胞死亡;(2)大多数的细胞形成坚持水库不经历足够水平的活跃的病毒生产由CTL活动目标;和(3)的大多数细胞形成坚持水库不ctl的目标因为特定解剖组织学位置和/或特定的表型变化(即一级downmodulation)。尽管目前的实验并没有解决这些潜在的贡献事件,值得一提的是,这项研究揭示了一个清晰的脱节CD8的强大作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba介导的ctl在控制病毒生产和防止水库的建立很大程度上无效的作用下的艺术。值得注意的是,目前的实验没有解决的可能性,这种anti-reservoir ctl效应可能是通过接种感染或使用前核对基准点抑制剂,这将是进一步研究的主题。gydF4y2Ba

尽管所有动物是持久地抑制ATI的时候,正式,某种程度的剩余(也就是说,< 60拷贝/毫升)和/或瞬态(也就是说,在没有进行抽样)病毒血症出现在艺术、如图所示为艾滋病毒感染gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba}。在这种情况下,残余病毒生产和/或复制也可以导致观察到稳定病毒的宿主。gydF4y2Ba

在最近的一系列研究中,我们表明,除了抗原,CD8 MHC-class-I-restricted CTLgydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞通过溶抑制艾滋病毒/ SIV生产,non-MHC-I-restricted机制导致的转录抑制病毒gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba}。CD8所扮演的角色gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-cell-mediated转录抑制的SIV在当前实验尚不清楚,因为我们既没有正式证明这种影响存在体内感染的早期阶段期间,我们并不是没有能够量化的作用抑制病毒复制比规范CTL活性。从理论上讲,是可能的,CD8的去除gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-cell-mediated转录抑制导致了长时间的检测有效SIV-infected通过促进细胞活性病毒转录,因此协同加强CTL切除引起的寿命增加。然而,即使在这种情况下,删除CD8的效果gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-cell-mediated SIV转录抑制将推迟而不是压制的建立持久的水库,除非这个溶细胞活动的结果报道pro-survival有效SIV-infected细胞的影响。出于这个原因,最简洁的解释当前的研究的主要结果是由CD8猴免疫缺陷病毒的抑制转录gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞并不是一个主要决定因素的观测数据。gydF4y2Ba

持久艾滋病毒/ SIV水库的可能性是由细胞没有容易CTL活动不管责任机制(直接延迟形成,解剖保护区,可怜的内在CTL效率等等)有重要意义的潜在的治疗方法来消除这种水库。在这方面,我们计划未来实验的动力学水库建立使用当前的实验方法(也就是说,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗和早期艺术启蒙)将研究在RMs SIV感染CTL-eliciting之前接种疫苗。进一步的研究旨在识别特定的分子和细胞机制的早期建立持久艺术是抵抗CD8下水库gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT-cell-mediated CTL活动可能使小说的发展,免疫策略,将大大减少热源的大小ART-treated感染艾滋病毒的人。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

所有动物实验进行了以下指导原则建立的动物福利法案和美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物,第八版。所有的程序都是埃默里大学机构批准的动物保健和使用委员会(允许YER2003384)。动物保健设施艾莫利大学国家灵长类动物研究中心是由美国农业部认证的评估和认证协会国际实验动物保健。gydF4y2Ba

动物,猴免疫缺陷病毒感染,CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba损耗和抗逆转录病毒治疗gydF4y2Ba

本研究包括21个印度RMs坐落在亚特兰大的埃默里大学国家灵长类动物研究中心,乔治亚州(3女性,18岁的男性;在研究开始的3 - 4年)。gydF4y2Ba

所有的动物都Mamu * B08gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}和Mamu * B17gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba};以下Mamu * A01猕猴gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba34917年:RSa17 RDm17 RTz16 RPk17, 34896年,RUn17, ROg18 RGa18。gydF4y2Ba

RMs被感染静脉注射10000 IU的条形码SIVmac239M包含大约10000 clonotypes出席比例大致相等gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。猕猴被分层在三组(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba):8猕猴收到一剂anti-CD8α-depleting抗体,MT807R1, 50毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}前1 d感染;8猕猴收到相同剂量的MT807R1开始前1 d艺术;5猕猴作为对照组。在14 d p。,一个d一个我ly triple formulation antiretroviral therapy (ART) was initiated in all RMs, consisting of dolutegravir (DTG; 2.5 mg kg^{−1gydF4y2Ba}dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}提供的欢悦制药),泰诺福韦disoproxil延胡索酸酯(TDF;5.1毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}由基)和emtricitabine (FTC;40毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}dgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}由基)提供维护前50周ATI。ATI后,所有的动物尸体剖检之前进行了12周的观察。gydF4y2Ba

样本收集和处理的组织gydF4y2Ba

外周血(PB)和LN活检(腋窝或腹股沟区)进行了纵向和验尸如前所述gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba。短暂,血液样本用于完整的血细胞计数和常规化学分析,和等离子体被离心分离1 h放血。PBMCs密度梯度离心法从全血中分离出来了。LN活检,腋窝的皮肤或腹股沟区剪,准备手术。然后开一个切口皮肤LN,钝性剥离暴露和切除夹子。LNs被均质,通过一个70细胞过滤器分离淋巴细胞。所有样本处理、固定(1%多聚甲醛)在24 h的收集和分析。gydF4y2Ba

流式细胞术gydF4y2Ba

Multiparametric流式细胞仪上使用标准程序执行PBMCs和单核细胞来源于LN活检使用反马伯之前显示在RM。可交叉反应的gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}。在37°C以下抗体用于30分钟:CCR5-BV650 (1∶3 a9克隆;BD生物科学564999 CCR7 FITC)和(1∶150503年克隆;BD生物科学,561271),除了生活/死aqua可行性染料(1μl 1:20 PBS稀释,热费舍尔,gydF4y2BaL34966gydF4y2Ba)。下面的抗体被用于在室温下30分钟:CD3-APC-Cy7(1∶克隆SP34-2;BD生物科学,557757),CD4-BUV496(1∶克隆SK3;BD生物科学,564651),CD8α-BV711(1∶克隆RPA-T8;Biolegend, 301044), CD8β-PE-Cy7(1∶克隆SIDI8BEE;英杰公司,14-5273-82),CD45RA-Pe-Cy5 (1∶5 h9克隆;BD生物科学,552888),CD62L-BV786(1∶克隆SK11;BD生物科学,565311),CD95-BV605(1∶克隆DX2;Biolegend, 305628), PD-1-BV421(1∶克隆EH12.2H7;Biolegend, 329920), CD14-BV510(1∶克隆M5E2; Biolegend, 301842), CD20-BV510 (1:200, clone 2H7; Biolegend, 302340), NKG2A (also known as CD159a-APC) (1:200, clone Z199; Beckman Coulter,A60797gydF4y2Ba),CD28-BUV737(1∶克隆CD28.2;BD生物科学,612815),CD69-Pe-CF594(1∶克隆FN50;BD生物科学,562617),CD25-BUV395 (1∶2 a3克隆;BD生物科学,564034)和HLA-DR-PerCP-Cy5.5(1∶克隆G46-6;BD生物科学,552764)。后固定透化作用和固定/ Permeablization工具包(BD生物科学),细胞被染色和ki - 67 af700(1∶克隆B56;BD生物科学,561277)在室温下30分钟。所有的抗体使用遵循制造商的建议。数据采集进行一个光敏电阻II (BD生物科学)由流式细胞仪天后使用FlowJo软件和分析软件(版本10.8;TreeStar)。gydF4y2Ba

等离子体猴免疫缺陷病毒RNA, RNA和DNA细胞相关gydF4y2Ba

等离子体SIV病毒载量测定标准定量rt - pcr的灵敏度60册每毫升如前所述gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是从PBMCs丰富和单核细胞来源于使用CD4淋巴结活检gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞非人类灵长类动物隔离设备(Miltenyi生物技术)对一个LS列所有样本后,制造商的规范。丰富被整除到100万年或500万年CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞和细胞溶解在350年μl缓冲RLT + RNeasy +赖氨酸缓冲区(试剂盒)与1毫米2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)。总细胞相关SIVmac239M gag DNA和RNA量化如前所述gydF4y2Ba^{49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}。简单地说,细胞相关SHIV RNA和DNA水平总CD4同时测量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPBMCs分离出的T细胞和淋巴结(1000000到5000000个细胞)细胞溶解在缓冲RLT +(试剂盒)+ 2-mercaptoethanol。两个DNA和RNA提取使用Allprep DNA / RNA迷你包(试剂盒)。量化的刀gydF4y2Ba呕吐gydF4y2BaDNA进行提取的DNA定量PCR使用5′核酸酶(gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba人)测定ABI7500系统(PerkinElmer)。细胞数字量化,与猴子同时定量PCR进行白蛋白基因拷贝数。反向使用高容量互补DNA转录RNA逆转录(RT)工具包(热费希尔)和随机五个一。刀gydF4y2Ba呕吐gydF4y2Ba和恒河猕猴gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba基因被qPCR合成cDNA使用量化gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba男人普遍掌握混合二世(热费希尔)。引物和探针序列中详细补充表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

IPDA和HPDAgydF4y2Ba

与QIAamp基因组DNA提取的DNA从低温贮藏CD4迷你包(试剂盒)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从PBMCs T细胞丰富,淋巴结单核细胞。IPDA和HPDA表现如前所述gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。短暂,每个样本化验使用三个独立的双反应一式三份:SIV IPDA RPP30和gydF4y2BaenvgydF4y2Ba2 ltrc化验。使用的扩增子IPDA措施完好的前病毒gydF4y2Ba波尔gydF4y2Ba,另一个在gydF4y2BaenvgydF4y2Ba2标记探针,检测完整的前病毒和2未标记的探针竞争排除前病毒与G-to-A hypermutation。RPP30试验使用2主机RPP30基因的扩增子来衡量和纠正DNA剪切,并量化输入手机号。最后,gydF4y2BaenvgydF4y2Ba2 ltrc试验措施未整合的ltr圈复式IPDAgydF4y2BaenvgydF4y2Ba扩增子的扩增子具体LTR-LTR结;double-positive事件从这个试验是减去从完整的前病毒使用IPDA量化。反应是建立在总量22µl 10µl 2 x Bio-Rad ddPCR Supermix(没有三磷酸脱氧尿苷),引物的最终浓度600 nM和探针IPDA和200海里gydF4y2BaenvgydF4y2Ba2 ltrc化验;250或500海里引物和纳米探针RPP30化验。引物和探针序列详细补充表gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。水滴是使用Bio-Rad QX200自动化液滴发生器,然后thermalcycled根据补充协议详细表gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。单个液滴分析使用的端点荧光Bio-Rad QX200滴读者。数据分析是使用Quantasoft工作室软件进行的。井少于10000滴被排除在分析之外。gydF4y2Ba

SIVmac239M条码测序gydF4y2Ba

血浆病毒RNA是量化之前,rt - pcr测序Illumina公司MiSeq编曲如前所述gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。low-template样品,单基因组扩增(SGA),其次是直接Sanger测序评估频率和数量的独一无二的条形码。gydF4y2Ba

测定细胞内细胞因子诱导后SIV-Gag肽刺激gydF4y2Ba

低温贮藏淋巴结PBMCs单核细胞被解冻,休息和resuspended RPMI 1640中(康宁)补充10%的边后卫(峰值血清),100 U mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}青霉素链霉素(康宁)和2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺(Gibco)在CD107a-PEefluor660(5μl,克隆H4A3;英杰公司,61-1079-42),CD49D(1μl克隆9 f10;表达载体,14-0499-82)和CD28-BUV737(5μl,克隆CD28.2;BD生物科学,612815)。单核细胞被刺激6 h在37°C / 5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与SIVmacgydF4y2Ba_{239年gydF4y2Ba}重叠的插科打诨肽(NIH艾滋病试剂项目)的浓度1μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在Brefeldin (BD生物科学,555029)和monesin (BD生物科学,554724)。葡萄球菌肠毒素A和B (SEB /一线生物制剂)刺激ng在250毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}作为一个积极的控制。肽稀释剂(1%二甲亚砜)作为消极的控制。刺激后,细胞被洗,染色的细胞表面抗原结合后马伯:CD3-Alexa700(1∶克隆SP34-2;BD生物科学,557917),CD95-APC(1∶克隆DX2;BD生物科学,558814),CD4-BV711(1∶克隆L200;BD生物科学,563913),CD8 PerCP-Cy5.5(1∶克隆RPA-T8 / SK1;Biolegend, 344710)和生活/死亡可以解决的黄色(1μl 1:15 PBS稀释,生活技术,gydF4y2BaL34959gydF4y2Ba)。检测细胞内细胞因子的表达,单核细胞被固定和permeabilized FoxP3 /转录因子染色缓冲区组件(Tonbo生物科学)和彩色如下:TNF-α-BV650(1:10 0,克隆Mab11;Biolegend, 502938), IL-2-PE-Cy7(1:10 0,克隆MQ1-17H12;Biolegend, 500307), IFN-γ-PE(1:10 0,克隆B27;BD生物科学,554701)和Granzyme B-BV421 (1:10 0, BD生物科学,563389)。马伯都使用制造商推荐的测试卷。执行数据采集在BD FACSymphony (BD生物科学)由流式细胞仪天后使用FlowJo软件和分析软件(版本10.8;TreeStar)。的频率SIV-specific CD8记忆gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞产生单个细胞因子确定后背景减法。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据收集和分析不进行盲目的条件实验。基于我们之前的数据gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba在SIV-infected ART-treated RMs,样本容量至少8,我们能够检测样品预处理和post-CD8损耗之间的显著差异在等离子体RNA水平0.05与0.90的显著性水平。没有动物或数据点被排除在分析之外。数据分布是没有正式测试。统计分析,包括Kruskal沃利斯测试,韦尔奇gydF4y2BatgydF4y2Ba以及和曼惠特尼测试使用GraphPad棱镜v.9.0进行。数据提出了均值±s.e.m。,除非另有指示。一个gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

Mixed-effects造型gydF4y2Ba

mixed-effects造型的方法成立符合两阶段衰减模型的综合数据CA-DNA, CA-RNA和血浆病毒载量。Akaike信息准则(AIC)是用来比较不同模型结构(也就是说,治疗相关的类属特异性的固定效应和随机效应模型参数不同),和最低的模型AIC被选为首选的模型。看到gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba对数学模型和模型拟合的细节。gydF4y2Ba

估计再活化率gydF4y2Ba

重新激活率估计使用之前开发的数学模型gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba基于病毒式增长速度比不同页码clonotypes的病毒载量。并给出了数学模型的细节gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba