简介

采用工程免疫效应物的过继细胞疗法是治疗治疗方案有限的血液病和实体恶性肿瘤的一种有前途的新方法1，2，3.，4，5，6，7，8，9．自体嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法该药物率先进入临床转化和商业化，对侵袭性B细胞恶性肿瘤患者有显著改善，在许多病例中产生了长期持续的缓解。然而，尽管取得了这些成功，挑战依然存在。CAR - T细胞疗法的复杂制造过程增加了成本，延长了静脉到静脉的时间，因此对于那些由于疾病迅速发展而急需治疗的患者来说是一个障碍。此外，对患者自身细胞作为来源材料的要求限制了资格，因为许多患者经常经过大量预处理和治疗lymphopenic，并且可能没有足够的细胞来产生可行的产品。在临床中，CAR - T细胞相关的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性是另一个值得关注的问题，需要住院患者监测。鉴于这些限制，人们对探索现成的、可以普遍应用的细胞来源越来越感兴趣。由于T细胞通过T细胞受体(TCR)识别并介导一种针对非我的反应，CAR - T细胞在免疫系统中的应用同种异体的设置需要额外的基因编辑步骤来移除TCR以降低风险移植物抗宿主病(GvHD)。另一方面，自然杀伤细胞(NK)以人类白细胞抗原(HLA)不受限制的方式识别它们的目标，因此不存在这些风险，使它们成为通用细胞免疫治疗的有吸引力的候选者10．NK细胞效应功能由一系列复杂的激活和抑制受体控制，这些受体可以区分健康细胞和“应激”细胞11．受体-配体接触产生的累积线索决定了NK细胞是否传递“杀死”或“不杀死”信号。健康细胞通过识别自我主要组织相容性复合体(MHC) I类分子，结合抑制杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)是阻止NK细胞功能的信号。相比之下，通过缺失自我识别机制，NK细胞攻击异常的自我细胞，如肿瘤细胞，这些细胞下调MHC I类分子的表达，试图逃避T细胞的反应，并上调由DNA损伤或恶性转化等应激诱导的激活配体12，13，14，15，16．

这些不同的属性为NK细胞的异体治疗应用提供了独特的优势。随着创新策略的加速发展和允许更深入的生物学研究的新一代技术的出现，各种NK细胞产品可以设计用于癌症治疗。在这篇综述中，我们描述了NK细胞的这些独特特性是如何用于过继NK细胞免疫治疗的，并概述了不断发展的工程策略，以增强NK细胞的效力和持久性，以及通过下一代CAR分子、工程化TCR和与细胞接合物的预络合，将NK细胞的特异性重定向到肿瘤。最后，我们对未来的挑战和机遇进行了展望，因为我们面对实体肿瘤并保护免疫效应细胞免受肿瘤微环境内的抑制压力，同时还设计了监测和减轻无意安全问题的策略。

NK细胞的生物学特性

尽管工程T细胞免疫疗法取得了成功1，2，3.，4，5，6，7，8在美国，临床效益仅限于一小部分患者和少数适应症，因此凸显了对新策略的需求。利用先天免疫来扩大抗肿瘤反应的范围是一个有吸引力的选择。在先天免疫系统中，NK细胞是特化的免疫效应细胞，被怀疑在肿瘤免疫监测中起作用10在临床前和临床研究中观察到，低NK细胞活性与增加癌症易感性和更高的转移风险相关17，18，19．NK细胞由CD34发展而来+骨髓中的祖细胞，尽管尚不清楚它们是来自一组独特的前体细胞，还是来自同时产生T淋巴细胞、B淋巴细胞和髓系细胞的多能祖细胞20.．与T细胞和NKT细胞不同，NK细胞缺乏克隆型TCR和负责信号转导的相关CD3复合物的表达。NK细胞通常根据表面蛋白CD56和CD16: CD56的相对表达分为两类明亮的CD16低/ -(免疫调节，细胞因子产生)和CD56昏暗的CD16+(细胞毒性)21．然而，最近在高参数细胞术和单细胞蛋白质基因组学方面的进展导致人们认识到，NK细胞实际上可能表现出更大的表型异质性，超出了这两个亚群，从而产生具有不同功能特性的不同细胞群22．

NK细胞具有很强的细胞毒性，在与靶标形成免疫突触后，通过释放溶细胞颗粒和细胞毒性细胞因子引起强烈的反应23．此外，它们可以通过Fc识别抗体包裹的细胞rm \({\{\伽马}}{\ rm {RIIIA}} \)(CD16)受体和触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞因子的产生24．NK细胞也被描述为“免疫调节”，因为它们能够产生一系列细胞因子和趋化因子，通过这些细胞因子和趋化因子帮助形成B细胞和T细胞的反应，并影响树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的功能11．这种广泛的属性揭示了与NK细胞功能相关的复杂生物机制网络，并支持NK细胞在免疫治疗中的价值。

NK细胞的记忆功能

早期研究报告了NK细胞在巨细胞病毒感染小鼠模型中的记忆样反应25，26这种行为通常与先天免疫细胞无关。在这些研究中26，27当IL-12和IL-18组合刺激小鼠NK细胞时，获得了以IFN产生增加为特征的功能性表型\ (rm{\伽马}}{\ \)．有趣的是，在静息期后，这些细胞能够在细胞因子刺激或激活受体的参与下重新激活，并表现出增强的IFN\ (rm{\伽马}}{\ \)类似于适应性免疫细胞记忆性质的反应。后来，托德·费尼格(Todd Fehniger)的研究小组假设，人类的NK细胞也应该被赋予类似记忆的特性。与这一假设一致，他们的研究表明，用IL-12、IL-15和IL-18预激活的人类NK细胞，然后休息1-3周，能够在增强的IFN驱动下产生强大的反应\ (rm{\伽马}}{\ \)在随后暴露于细胞因子或K562白血病细胞后产生28．从那时起，更多的研究小组在各种免疫环境中描述了类似的记忆功能，包括对人类这种反应的观察29，30.．

NK细胞来源和供体选择

在癌症患者中，NK细胞通常表现为功能失调的表型，其特征是基因表达谱的改变和细胞毒功能的降低31，32，从而降低了自体NK细胞治疗应用的可行性。此外，自体制造平台很麻烦，如果患者不能提供足够的细胞进行下游加工和工程，可能会限制其可访问性。

由于异基因NK细胞不会引起GvHD，目前的NK细胞治疗方案主要依赖于异基因来源，以避免与自体方法相关的负担。NK细胞有多种来源(图2)。1)，即外周血单个核细胞28，29，30.，脐带血28，29，30.，33，34，35，36，37永垂不朽的细胞系38，39，40、造血干细胞和祖细胞33，34，41而且诱导多能干细胞(万能)42，43．所有来源都可以提供有临床意义的细胞剂量，适用于CAR受体工程，并已过渡到人体研究。然而，它们具有独特的优势和挑战，并且可能具有不同的潜在转录、表型和功能特性44．

图1:不同NK细胞来源的优势和局限性。
图1

自然杀伤细胞(NK)可以从几种不同的来源获得，每种来源都有其自身的优势和潜在的挑战。嵌合抗原受体(CAR) NK细胞已经成功地从不同的平台工程，包括脐带血35，37，外周血52，112，264， NK-92细胞39，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274诱导多能干细胞(iPSC)衍生的NK细胞43，48，49．ADCC，抗体依赖性细胞毒性;造血干细胞、造血干细胞和祖细胞;MDACC，德克萨斯大学MD安德森癌症中心。

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NK-92是首个获得美国食品和药物管理局(FDA)临床试验新药批准的基于NK细胞的免疫疗法，是一种均质、永生化NK淋巴瘤细胞系，可在体外扩增以实现大细胞数量38(表1)．NK-92细胞缺乏大多数KIRs的表达，因此不太可能被抑制，这使得它们对细胞治疗有吸引力38．然而，它们的癌变来源引起了安全问题，并且在患者给药前需要对nk -92衍生细胞产品进行照射，这反过来又会对其在体内的长期持久性和整体治疗潜力产生负面影响37．另一个缺点是，由于缺乏CD16的表达，NK-92细胞缺乏通过ADCC介导细胞杀伤的能力。

表1 car工程NK细胞治疗产品的临床研究
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NK细胞也可以来源于CD34+祖细胞体外分化33．在首次人体临床试验中，Dolstra等人在接受过继转移HSPC-NK细胞的轻度残留疾病阳性急性髓系白血病(AML)老年患者中显示了临床疗效34．尽管初步结果令人鼓舞，但在更大的患者群体和各种适应症中探索HSPC-NK细胞的安全性和有效性的临床研究将有助于确定这些细胞的潜在临床应用范围。未来的工作还需要解决HSPC-NK细胞是否可以有效地改造以实现增强的肿瘤特异性。

由于诱导多能干细胞具有克隆生长和高膨胀能力，以及体外分化能力，可以制造大量同质NK细胞产品，因此对NK细胞来说是一种有吸引力的来源。一个潜在的缺点是ipsc来源的NK细胞通常表达低水平的内源性CD16，尽管这可以通过基因工程缓解45．另一个可能的问题是，诱导多能干细胞可能含有与其起源的体细胞组织一致的DNA甲基化特征46．这种“表观遗传记忆”可能会影响与供体细胞不同的特定细胞系的发育，因此，在使用iPSC平台时应该考虑到这一点47．尽管如此，越来越多的基因工程iPSC-NK细胞候选细胞正在出现在临床前研究中，其中一些已经过渡到临床试验48，49，50，51．在I/II期试验中，表达CAR的iPSC-NK细胞在复发或难治性(R/R)弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中表现出令人鼓舞的结果，无论是单药治疗还是联合cd20靶向药物治疗43，49．

原代NK细胞可从外周血中获得(PB-NK细胞)28，29，30.，36或者来自脐带血(CB-NK细胞)33，34，35，37．CB-NK细胞可以通过血库冷冻，而PB-NK细胞需要apheresis健康捐赠者和特定捐赠者的收集在Dario Campana于2005年领导的工作中，PB-NK细胞作为第一次成功将CAR构建物交付到NK细胞的平台。52)，今天，PB-NK细胞为目前临床测试中的各种产品提供了基础(表1)．脐带血NK细胞在car重定向抗肿瘤细胞毒性和临床活性方面有良好的记录，由我们的团队首创35，37．在我们的研究中，我们证明了基因工程脐带血来源的CD19- car NK细胞对抗R/R CD19的有效临床疗效+淋巴系统恶性肿瘤的I/II期临床试验37．

来自所有这些来源的NK细胞已被证明具有过继细胞治疗应用的优点和缺点。来源材料的多种选择为治疗策略的设计提供了一定程度的通用性，使平台能够专门针对每个患者群体和疾病指征的需求进行定制。

值得注意的是，供体间的差异性可能会影响NK细胞的分布，从而影响临床结果。因此，全面了解产品特性对于定义具有更强效力和持久性的生物标志物至关重要。从免疫学的角度来看，当跨越HLA-KIR基因型边界给药时，供体来源的NK细胞可能是有利的，因为HLA-KIR配体差异可能有助于克服肿瘤免疫逃避。在基于NK细胞的免疫治疗的早期，该领域认识到，在HLA单倍型不匹配的移植物与KIR配体不相容的受者中，移植后AML复发的概率显著降低53．尽管kil - hla基因型的供体选择仍然是一个积极研究的领域54，55，56，57有证据表明，这种方法在T细胞缺失的异基因造血干细胞移植(alloHSCT)中具有潜在的好处。58，59，60，61，62，63，64，65，66．需要进一步的工作来确定这一策略是否能成功地应用到NK细胞治疗管道中。

增强NK细胞的适应性和抗肿瘤功能

嵌合抗原受体

嵌合抗原受体(CARs)是合成的融合蛋白，包括细胞外抗原识别域和触发细胞激活的细胞内信号部分。最常见的是，来自所需抗体的单链可变片段(scFv)用于抗原结合域，尽管也构建了许多由天然细胞受体的细胞外部分组成的CAR模式，利用受体-配体相互作用的自然特异性67，68，69．CARs可以在免疫效应细胞上表达，目的是重新编程它们对特定目标的特异性(图。2)．car工程T细胞疗法是第一个出现的，各种产品开发用于免疫肿瘤学应用1，2，3.，4，5，6，7，8．此后，该领域不断扩大，NK细胞也被整合到基因工程管道中70，71．car通常是为T细胞设计的(包括CD3\ (rm{\ζ}}{\ \)和T细胞共刺激分子)已被用于生成CAR - NK细胞，研究表明，这些细胞可以有效和特异性地靶向肿瘤，同时保持理想的安全性37(无花果。3)．

图2:重定向NK细胞特异性的策略。
图2

自然杀伤(NK)细胞对肿瘤细胞的特异性可以使用不同的策略进行重定向。一个，b嵌合抗原受体(CAR) NK细胞35，37，43，112，264(面板一个)和T细胞受体(TCR) NK细胞94(面板b)的方法都建立在稳定的基因工程上，赋予NK细胞合成受体，分别识别细胞外和细胞内的肿瘤抗原。c|双特异性和三特异性接合器96，98，99，One hundred.，102，103，105，106，275部署双向或三向抗体，使NK细胞与各自的肿瘤细胞目标交联，从而避免了复杂的基因编辑的需要。HLA，人白细胞抗原;MHC，主要组织相容性复合体;scFV，单链可变片段。

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图3:CAR设计的原则和策略。
图3

一个，b|嵌合抗原受体(CAR)分子从简单的第一代设计在过去二十年中发生了巨大的发展276(面板一个)，转至第二代52，277，278和第三代39，279加入共刺激分子的CARs(面板)b)，最后，现代CAR设计类似于模块化系统，包括优化的细胞外域用于目标识别，细胞内共刺激分子用于有效的自然杀伤(NK)细胞激活，以及增加的有效载荷可增强NK细胞功能。c- - - - - -e目前的策略利用了CAR信号和功能的核心原理，并提供了创新的方法来提高肿瘤识别和增强细胞活化，使用复杂的结构设计来靶向多种肿瘤抗原69，280(面板c)，提供细胞因子支持35，37(面板e)并激活辅助细胞毒性通路。集成逻辑门控电路，指导选择性杀伤靶向恶性细胞，同时保留健康组织，可能会提高安全性90，92，93(面板d)．aCAR，激活嵌合抗原受体;急性髓系白血病;DAP12, dna激活蛋白12;EMCN Endomucin;HLA，人白细胞抗原;造血干细胞;iCAR，抑制性嵌合抗原受体;scFV，单链可变片段。

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在这些令人鼓舞的结果的激励下，人们对基于与NK细胞生物学相关的激活信号设计CARs越来越感兴趣(图2)。3 b)．这种方法的例子包括dnax激活蛋白12 (DAP12)和DAP10，它们已被用于取代CD3\ (rm{\ζ}}{\ \)在一些研究中72，73，74，75，76．这些连接蛋白是细胞内信号结构域，通过募集PI3K起作用，并与激活分子如NKp44有关，激活KIRs (KIR2DS和KIR3DS)和NKG2C(参考文献)。72，76)．类似于CD3rm \({\{\ζ}},\)DAP12还含有免疫酪氨酸激活基序(ITAMs)，一旦磷酸化，启动级联信号，最终释放细胞毒颗粒和促炎细胞因子，如TNFα和IFNγ72．DAP10虽然不具有ITAM结构域，但已被证明可以通过NKG2D-DAP10轴的信号传导诱导NK细胞的强杀伤活性76．

在过去的几年里，CAR - T细胞的行为，一旦锚定在细胞表面，已经引起了相当大的兴趣，特别是在观察到，在某些情况下，CAR - T细胞表现出独立于抗原接合的基础活化水平的升高，称为主音的信号77，78，79，80，81．尽管研究仍在继续探索这一现象的潜在原因，但已有报道称CARs可能通过CD3与TCR-CD3复合体结合\ (rm{\ζ}}{\ \)结构域和可能增强T细胞激活82，83．最近，研究表明，存在于一些CAR框架中的CD28跨膜结构域介导CAR与内源性CD28的异二聚，从而触发T细胞激活84，85．这些观察结果表明CARs在细胞膜上不是静止的，而是倾向于与内源性受体相互作用。尽管我们对这些受体在NK细胞中的关联还知之甚少，但可以想象的是，CARs可能与NK细胞膜上的许多激活受体中的任何一个形成协同伙伴关系，从而导致协同激活。

努力也集中在完善基于car的策略，这是由这种疗法的临床转化所激发的，这促使人们对克服患者所经历的挑战的方法进行了研究。基于car的细胞治疗的一个关键障碍是抗原逃逸，肿瘤通过抗原丢失或下调逃避免疫反应的过程。人们采用了各种策略来解决这个问题。靶向多种抗原是一种可行的方法，既增加了肿瘤检测的严格性，又延长了治疗的益处(图。3 c)．这通常是通过表达一个双顺子结构来实现的，它编码两个独立的CAR(每个CAR针对肿瘤上的不同抗原，并连接到两个独立的信号内域)，或者表达一个含有双特异性识别域的CAR，每个CAR串联针对不同的抗原，并连接到一个信号内域86．双car方法提供了更大的设计灵活性，适应信号域和受体格式的组合。每个CAR可以格式化为在目标交战时提供激活和共刺激信号。另外,反式-信号格式将这两种信号分开，并需要与两种抗原接触才能完全激活。对于双特异性CAR，抗原结合部分连接到单个受体，通常是第二代或第三代CAR87，88．在任何一种方法中，对抗原密度、膜定位和蛋白质结构的考虑都是重要的，以确保两种CARs在免疫突触上有效地结合它们的目标。尽管这些基于car的创新方法大多集中在T细胞上，但预计这些系统也可以应用于NK细胞是合理的。

改善car介导的激活控制的策略也已被探索，特别是关注于最小化由靶向、非肿瘤作用引起的毒性。通过使用逻辑门控CAR，促进选择性靶向已被证明可以缓解CAR - T细胞环境下的一些问题89，90，91，92，93(无花果。3 d)．最近的一项研究初步发现，当应用“或”和“非”时，控制CAR - NK活性是可行的。逻辑的CAR基因电路法92，93．在这项工作中，该团队通过二价CAR靶向AML细胞上的FLT3和/或CD33，并使用抑制性CAR与健康造血干细胞(hsc)上的抗原结合，并诱导“NOT信号”以防止细胞死亡92，93．

基于car的方法的一个关键限制是，在大多数情况下，检测能力仅限于表面蛋白。细胞内抗原，以多肽- hla复合体的形式出现，通过TCR自然检测。工程NK细胞表达TCR可以允许检测这些肽(图。2 b)．tcr引导的NK-92细胞最近已被证明能够介导成功的抗肿瘤反应94．虽然需要进一步的研究来验证这种方法的临床适用性，但一个潜在的优势是，由于NK细胞不具有内源性TCR，在TCR工程T细胞中已经报道了错配问题95这可能不是一个问题。然而，一个缺点是NK细胞不具备T细胞中发现的完整信号机制，因此可能会损害通过合成TCR被有效激活的能力。

NK细胞接合物

NK细胞还可以通过接合子被引导到肿瘤部位，接合子通过触发NK细胞上的激活受体来引发强烈的NK细胞介导的抗肿瘤反应，同时将靶抗原结合到肿瘤细胞上96，97，98，99，One hundred.(无花果。2摄氏度)．其他NK接合剂策略包括三特异性和四特异性设计，旨在通过靶向肿瘤上的多种抗原或通过交联细胞因子部分来支持NK的扩张和存活来增强抗肿瘤作用101，102，103，104，105．细胞接合物的使用绕过了工程的需要，不需要载体介导的基因转移，因此代表了一种更简单、成本更低的制造过程，可以提供能够诱导car样活性的产品。

在使用NK细胞接合物靶向血液系统和实体性恶性肿瘤时，各种临床前研究显示了有希望的结果96，97，98，99，One hundred.，101，102，103，104，105，106．最近的研究表明，通过在AML细胞上使用一种靶向CLEC12A的三特异性分子，并通过人源化抗cd16单域抗体和IL-15激活NK细胞，可以对原发性患者来源的AML细胞产生强大的NK细胞介导反应(参考文献)。105)．此外，一种靶向两种NK激活受体(CD16和NKp46)的三功能激活因子被证明可以驱动强大的抗肿瘤反应，最终在临床前模型中实体性和转移性恶性肿瘤的设置中有效控制体内肿瘤生长106．

最近，我们的小组证明，当与AFM13(一种双特异性接合物，在NK细胞上结合CD16和在白血病或淋巴瘤靶上结合CD30)复合时，tb -NK细胞表现出增强的CD30杀伤+肿瘤细胞，导致car样反应One hundred.．此后，我们将这种方法应用于R/R CD30的临床治疗+霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL) (NCT04074746;107))。随着越来越多的策略过渡到临床试验，评估负载接合体的NK细胞抗肿瘤作用的持久性，并确定是否需要多种治疗来获得持续的治疗益处，也将非常重要。

细胞因子钢筋

尽管CAR和TCR工程技术寻求通过基因重定向其特异性来增强NK细胞功能，但也有一些举措旨在有效地激发NK细胞在体外和/或体内，以维持最佳的抗肿瘤功能和持久性。据描述，新分离的NK细胞与已引物的NK细胞相比具有较低的细胞溶解能力108．解决这一限制的一种方法是细胞因子介导的激活，目前正在研究各种方法29，One hundred.，109，110，111，112，113，114．结合IL-2、IL-15和IL-21补充NK细胞的体外扩增表明，这些细胞因子增强了细胞毒功能，支持高增殖率，同时保持细胞处于健康、未耗尽的状态115．

现在已经很清楚，当在IL-12/15/18存在的情况下培养时，PB-NK细胞转变为一种称为细胞因子诱导的记忆样NK细胞的表型29．细胞因子诱导的记忆样NK细胞在移植前和移植后R/R复发髓系肿瘤患者中均显示出临床疗效29，30.．工程记忆类NK细胞表达CAR增强抗肿瘤反应，导致抗NK耐药恶性肿瘤的效力增加111，112．此外，在我们自己使用NK细胞接合剂AFM13的临床试验中，用IL-12/15/18预激活NK细胞以诱导记忆程序，从而增强了对CD30的反应+淋巴瘤One hundred.(无花果。2摄氏度) (NCT04074746(参考。107))。

虽然这些数据强烈地表明了细胞因子启动的优势，但持续的体外刺激使NK细胞“细胞因子成瘾”，并导致在缺乏体内细胞因子支持的情况下注入这些细胞时，持久性下降115．为了避免这一问题，并仍然利用细胞因子激活的好处，该领域已经转向了基因工程，通过修改NK细胞来产生细胞因子，以支持细胞效力、增殖和持久性(图2)。3 e)．这种自分泌支持已经引起了极大的兴趣，car工程NK细胞正在出现，并伴有补充的细胞因子信号35，37，48，49．细胞因子装甲可以编程，使可溶性细胞因子释放到环境中，或以膜结合的形式设计，以诱导细胞对细胞相互作用的反应116．以可溶性形式，由工程NK细胞产生的细胞因子可以介导旁观者效应，从而激活肿瘤微环境(TME)中存在的其他免疫效应细胞，如T细胞或髓系细胞，从而潜在地进一步增强抗肿瘤反应117．我们的团队以及其他团队已经证明，在临床前模型中，与CAR单独相比，il -15装甲CAR NK细胞在体内表现出更好的持久性35，48，49．这些发现在CD19患者的临床研究中得到了证实+淋巴样恶性肿瘤，治疗一年后，我们在其中许多人体内检测到CAR - NK细胞循环37．对于每种细胞因子装甲方法，重要的是确定最佳的细胞因子剂量策略，以支持增强功能和持久性，但不会通过诱导代谢衰竭而损害NK细胞的功能，如先前报道的那样118．

克服免疫抑制

TME由严酷的代谢景观组成，其特征是免疫抑制代谢物、葡萄糖和氨基酸剥夺、缺氧和酸性的异质混合，这些因素共同阻止了有效的抗肿瘤免疫。特别是在实体肿瘤中，缺氧是免疫细胞功能障碍的常见驱动因素。研究表明，在缺氧的TME中，NK细胞功能受损，部分原因是抑制细胞如骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(T注册细胞)和M2巨噬细胞，以及缺氧对NK细胞功能的直接影响119，120，121，122．据报道，抑制NK细胞中的缺氧反应性HIF1a信号可以增强NK细胞的效力并释放NK细胞介导的抗肿瘤功能123．

肿瘤通常表现出异常的代谢行为，导致高水平的乳酸，重要营养物质的消耗和有毒分解代谢产物，腺苷和活性氧浓度的增加109．此外，不受控制的增殖，功能失调的血管和免疫抑制细胞亚群的存在导致免疫效应细胞冒险进入TME的悲惨命运。为了克服代谢性免疫抑制的不利影响，目前的策略主要集中在两个领域:改变肿瘤的代谢构成或修改免疫细胞中的基因表达程序，以保护它们免受TME中的抑制性代谢物的影响(图2)。4)．研究表明，血液中乳酸脱氢酶(LDH)和TME的高水平与黑色素瘤患者的不良预后和检查点治疗的低反应有关124．虽然仍处于临床前阶段，糖酵解抑制剂和乳酸脱氢酶阻滞剂可能提供有利地调节TME的机会。最近的一项研究表明，用乳酸脱氢酶A (LDHA)抑制剂GSK2837808A治疗患者来源的黑色素瘤细胞，在体内和体外都能改善T细胞的抗肿瘤细胞毒性125．TME中的乳酸水平也可以通过靶向其转运蛋白MCT1和MCT4而降低，正如阿斯利康的AZD3965化合物所示，目前正在临床研究中(NCT01791595)。126))。

图4:克服NK细胞功能抑制因子的基因工程策略。
图4

一个- - - - - -f恶性肿瘤微环境(TME)严重损害免疫细胞功能134．目前的策略是利用工程工具来破坏TME(面板)中的抑制信号一个)，并通过趋化因子受体的异位表达改善免疫细胞归巢到肿瘤床(面板d)．显示了通过基因工程靶向的自然杀伤(NK)细胞相关途径的选择。包括靶向消除抑制检查点的基因工程策略156，164，167，168(面板b, c)以及细胞外受体的破坏，这些受体感知抑制性刺激，包括TGFβ140，141和腺苷135(面板一个)在临床前已被证明可以有效地靶向途径来增强NK细胞的代谢适应性和持久性，目前正在努力将这些发现推进到临床。内源性受体的消融允许组合治疗方法，例如通过使免疫细胞抵抗皮质类固醇诱导的免疫抑制(小组)e)，这是先前在严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)定向细胞毒性T淋巴细胞(ctl)中建立的原则。281．敲除CD38(面板f)使NK细胞对cd38介导的兄弟自相残杀具有抗性，这使得NK细胞和抗cd38靶向单克隆抗体的组合策略在治疗多发性骨髓瘤的背景下成为可能50．B注册细胞，调节B细胞;MDSC，髓源性抑制细胞;NKG2A, CD94/NK 2族成员A受体;含免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体TIGIT;T注册调节性T细胞。

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腺苷是ATP代谢的副产物，通过外核苷酶CD39和CD73的活性产生。在TME的缺氧条件下，作为缺氧驱动的嘌呤能信号通路的一部分，这些酶的表达上调，导致细胞外腺苷的积累，而细胞外腺苷又作为TME中T细胞和NK细胞功能的负调节因子，抑制其代谢和效应功能127，128，129，130．有趣的是，腺苷有助于激活抑制细胞，如T注册细胞，M2巨噬细胞和MDSCs，都是TME内的常驻种群。克服腺苷介导免疫抑制的治疗策略包括通过小分子抑制剂或拮抗抗体阻断肿瘤细胞上的CD73，这两种方法目前都在临床研究中(NCT04148937)。131)， NCT03454451(参考。132)和NCT03616886(参考。133))。此外，在临床前研究中，在CAR - T细胞和CAR - NK细胞中删除腺苷A2A受体的基因编辑已经显示出提高这些细胞效力和抗肿瘤功效的希望134，135，136，137(无花果。4)．

TGFβ信号是TME内免疫抑制的另一种机制，对NK细胞功能有有害影响。tgf β诱导的miR-27a-5p在体内外均可改善NK细胞毒性138．此外，配备高亲和显性阴性TGFβ受体的NK细胞可以抵抗TGFβ的作用并保持其效力139．同样，我们的研究小组通过靶向删除TGFβ受体，成功地使CB-NK细胞对TGFβ信号通路免疫(TGFBR2)140．我们随后提供的体内证据表明，在胶质母细胞瘤小鼠模型中，TGFβ信号通路的中断可保护NK细胞的细胞毒性141．

当我们试图调节TME中的免疫代谢时，重要的是实现生理平衡，因为一些代谢物是正常代谢的重要组成部分。尽管许多策略仍在开发中，但涉及TME调节和NK细胞工程的联合方法可能会降低免疫抑制，并支持强大的免疫细胞活性。

检查点中断

肿瘤已经进化出复杂的机制来逃避免疫监测，包括免疫检查点的参与，这可能会以与T细胞相似的方式抑制NK细胞。为了将阻断T细胞相关免疫检查点PD1和CTLA4的临床成功转化为现实，几个研究小组已经探索了在NK细胞环境下调节这些调节回路的潜力142，143，144，145，146，147，148，149(无花果。4 b)．尽管一些研究指出了它们作为功能抑制因子的作用，但它们在NK细胞生物学中的整体相关性仍存在争议146，150．有可能，支持NK细胞激活的信号网络构成了一个更微妙的画面，其中这些主要是T细胞标记与其他各种NK细胞调节因子协同作用151．其他已被调查的监管机构包括TIM3(参考文献。152，153)， T细胞免疫受体与免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)136，153，154，155，156和LAG3(参考。157)，他们的靶向使用单克隆抗体已被证明在体外逆转肿瘤诱导的NK功能障碍。

抑制性KIRs是NK细胞功能的有效负调节因子，当与HLA I类配体接触时，可以覆盖任何伴随的激活信号。鉴于其在抑制NK细胞功能方面的突出作用，抑制性KIRs引起了相当大的兴趣。Lirilumab是一种抗pankir2d抗体，其作用是通过阻断这些抑制性KIRs，使NK细胞感知到的多种且通常相反的信号信号转向净激活158．然而，在两项早期临床试验中，Lirilumab未能引起有临床意义的反应159，160．这些结果的一个潜在原因可能源于抑制KIRs在NK细胞教育和诱导中的重要作用许可．在这一假设下，由于Lirilumab持续阻断KIR而导致的长时间KIR抑制可能会对NK细胞功能产生负面影响161，162．

与KIR分子类似，CD94/NK 2族成员A受体(NKG2A)是另一种显著的NK细胞负调节因子，当其与同源配体HLA-E结合时，可抑制NK细胞的细胞毒性。Monalizumab特异性地破坏了这种相互作用，并导致先前治疗的复发或转移性头颈部鳞状细胞癌患者与西妥昔单抗联合使用时，有希望达到31%的客观缓解率163．Monalizumab目前正在针对其他实体肿瘤进行测试，包括结直肠癌和非小细胞肺癌以及异基因造血干细胞移植后。

这些方法的共同点是依赖单克隆抗体来调节患者的免疫细胞，由于单克隆抗体在体内的半衰期有限，这种策略需要多次输注。随着基因编辑能力的进步，可以稳定地修改NK细胞，以调节增强NK细胞效应功能的生物机制。一个例子是抑制性受体NKG2A的遗传破坏，这导致在接种HLA-E的异种移植小鼠模型中具有更好的肿瘤控制+肿瘤164(无花果。4 b)．此外，在开创性工作的基础上，建立了CIS(细胞因子诱导的含sh2蛋白)作为NK细胞功能的关键负调节因子165，166，我们和其他人成功地改造了NK细胞167，168缺乏这种细胞内细胞因子检查点。由此产生的CAR - NK细胞表现出增强的代谢适应性和增强的抗肿瘤活性(图。4摄氏度)．

这些研究预示了靶向遗传扰动调节NK细胞生物学的潜力。展望未来，我们预计无偏倚的高通量发现方法将以更系统的方式阐明特定遗传干预的功能后果，最终为下一代NK细胞免疫疗法的设计提供信息。

促进NK细胞向肿瘤的转运

NK细胞进入并穿透肿瘤床的能力是有效抗肿瘤免疫的关键前提，并与改善临床结果有关169，170，171，172，173．与其他免疫细胞类似，NK细胞通过TME中分泌的趋化因子受体及其同源配体的动态相互作用被引导到肿瘤位点174，175，176，177．近年来，越来越多的工作研究了如何调节这些相互作用来增强对肿瘤的有效归巢。而早期的研究主要集中在扩张性诱导的趋化因子受体上调178，179以及瞬态转染方法180，181由于内化和降解，趋化因子的表达迅速丧失182导致越来越多地采用基因工程策略来稳定地为NK细胞配备异位趋化因子受体182，183(无花果。4 d)．今天，现有的研究提供了令人鼓舞的临床前证据，支持调节趋化因子受体以增强NK细胞在包括多发性骨髓瘤在内的广泛难以治疗的肿瘤中向肿瘤床的运输184，185,胶质母细胞瘤182，肾细胞癌183，胰导管腺癌186和卵巢癌187．

尽管取得了这些进展，但仍存在三个重要障碍。首先，趋化梯度依赖于足够的肿瘤灌注，微血栓诱导的循环缺陷可能需要增加肿瘤微灌注的策略182．其次，TME中趋化因子的释放遵循不同的肿瘤特异性动力学，瘤内趋化因子水平可能需要人为提高以吸引工程NK细胞179．最近的工作通过使用装载CXCL16的间皮靶向抗体融合蛋白局部增加趋化因子浓度来解决这一问题，CXCL16在肿瘤细胞接触时在TME中被切割186．此外，最近的工作强调了辐射诱导的CXCL8的应用，以增强NK细胞向肿瘤的迁移188．最后，趋化因子-受体的相互作用可能是环境特异性的，根据所讨论的特定肿瘤类型，促进或废除NK细胞归巢，正如之前观察到的那样184，185．未来的研究将需要解决这些重要问题，并最终验证总体有希望的发现是否能在人体内趋化因子复杂和动态相互作用的背景下占上风。

临床经验

CAR - T细胞疗法已经导致了显著的临床结果，一些患者在CAR - T细胞持续存在的情况下实现了长达十年的缓解1，2，3.，4，5，6，7，8，9．这种新形式的细胞免疫疗法也显示出治疗各种癌症的潜力，推动了越来越多的新策略的发展，以这些成功为基础189，190，191．CAR - T细胞的经验阐明了成功开发安全有效的细胞疗法的许多要求，也揭示了与耐药机制和免疫效应细胞持久性障碍相关的关键挑战192，193．从CAR - T细胞的临床过程中获得的知识促成了新的细胞治疗方式的出现。在过去的十年中，该领域已经看到NK细胞成为一种强大的新型治疗候选者，具有生物学特性，可能有助于克服基于T细胞的方法的一些局限性。一个值得注意的发现是，早期临床数据表明，NK细胞非常适合用于异基因治疗，因为目前正在进行的临床研究尚未报告重大不良事件194．尽管安全性结果令人鼓舞，但还需要进一步的研究来阐明异基因NK细胞是否能够长期持久地逃避受体T细胞的排斥反应。越来越多的临床研究表明，来自外周血单个核细胞、脐带血、iPSCs、HSPCs和细胞系的NK细胞在治疗血液恶性肿瘤方面是安全有效的28，29，30.，33，34，37，39，48，49．此外，我们已经了解到，与T细胞类似，NK细胞很容易受到基因改造，许多临床候选细胞已被设计成更精确地靶向肿瘤(通过表达CAR)，并增加持久性(通过细胞因子装甲)。此外，不断努力增强运输到肿瘤部位(通过趋化因子受体编辑)(图。4 d)和屏蔽TME中的抑制因子(通过检查点抑制，代谢重编程(图。4)和耐缺氧)可能会提高临床效益。NK细胞也可能分化为一种记忆样表型，自然地延长NK细胞功能的持久性，并在再次遇到抗原时赋予回忆抗肿瘤反应的能力。记忆NK细胞目前正在进行治疗白血病的临床评估。此外，与参与分子预复合物的记忆类NK细胞提供了一种替代方法，可以在不需要长时间制造的情况下实现类似car的特异性One hundred.在临床中，这种策略正在推动与CAR - T细胞和CAR - NK细胞相似的反应。重要的是，无论采用何种方法，NK细胞疗法始终表现出良好的安全性，迄今为止，未观察到CRS或GvHD。

尽管已经取得了巨大的进展，并且在很短的时间内NK细胞已经成为免疫肿瘤学的重要工具，但大多数报道的成功仅限于血液系统恶性肿瘤，就像CAR - T细胞最初的功能一样。然而，挑战也一直存在。并不是所有的患者都对NK细胞疗法有反应，有些患者最终会复发。肿瘤耐药和复发的机制是什么?肿瘤细胞，以及同样的治疗性NK细胞，在它们相互作用的过程中进化了吗?了解影响患者反应的生物学基础对回答这些问题至关重要。在当前单细胞多组学能力的时代，我们已经准备好将这些挑战视为机遇(方框)1)．通过基因组学、蛋白质组学和表观基因组学分析相结合的方法来探究治疗进化，可能会提供有价值的见解，以了解永久性地“损伤”NK细胞进入一种对肿瘤的衰竭和低反应性状态，就像之前在T细胞中观察到的那样195，196．事实上，我们也可能发现代谢重编程的表观遗传根源，导致生物能量储备低和持久性降低。一旦这些机制被阐明，制定策略来逆转它们的作用并挽救细胞功能，或识别拦截有害相互作用的有利基因编辑，将在最大限度地提高细胞免疫疗法的效益方面发挥关键作用。此外，实施联合治疗方法可能为实现协同效应和提高工程过继NK细胞疗法的疗效提供了一种策略(表2)2)．整合抗体或小分子抑制剂以防止代谢物驱动的免疫抑制，或阻断检查点和免疫抑制机制(图2)。4 b，e)，例如，可能会导致多方面的结果:增强CAR - NK细胞功能，阻碍TME中抑制细胞的信号，并支持其他免疫效应细胞的功能197，198，199．最后，改造NK细胞使其对cd38介导的兄弟杀体具有耐药性，将使NK细胞为基础的治疗方法与抗cd38单克隆抗体相结合，并使NK细胞免疫治疗进入多发性骨髓瘤的早期治疗50(无花果。4 f)．

表2增强CAR - NK细胞治疗效力的组合策略
全尺寸表

尽管许多临床试验仍处于早期阶段，但通过迭代过程，我们将能够直接从患者那里了解每种癌症造成的障碍是什么，并将这些信息带回实验室，在那里治疗方法可以进一步细化为应对现实生活挑战的适用解决方案。从这些研究中获得的知识将作为建立未来临床研究的基础，在我们前进并瞄准实体肿瘤时，对取得成功至关重要。通过细胞工程策略和联合治疗方法，实体肿瘤的NK细胞过继治疗还需要解决和克服与肿瘤运输不良和免疫抑制TME中有限的持久性和效应功能相关的挑战。

确保NK细胞治疗的基因组保真度

鉴于对基础NK细胞免疫生物学的新见解产生的广泛范围和加速速度，我们预计新型工程细胞产品将会增加。因此，建立筛选和表征产物的平台以识别脱靶核酸酶活性引起的非预期遗传改变越来越重要。随着该领域的进展，一些基因组变化可能在不经意间导致致癌突变的担忧继续在背景中回荡。为了解决这一需求，美国国立卫生研究院(NIH)启动了体细胞基因组工程(SCGE)计划，其主要任务有两个:第一，为研究人员提供财政援助，以促进基因组编辑技术向临床的转移;第二，支持开发更全面的分析方法，以调查使用这些工具可能导致的潜在不良生物效应200．此外，还开发了各种研究基因组编辑保真度的平台，如GUIDE-Seq201, CIRCLE-Seq202和rhampSeq203这依赖于测序技术来公正地识别基因组中可能发生双链断裂的位点。此外，非预期的基因重排可以通过线性放大介导的高通量全基因组易位测序(LAM-HTGTS)等方法来阐明。204．随着这些工具的不断发展和新工具的开发，在细胞治疗开发中实施此类分析将至关重要，以确保更好地了解细胞产品(如工程NK细胞疗法)的安全性和有效性。

结束语

工程细胞免疫疗法继续经历巨大的增长，不同的模式迅速从临床前研究进入临床试验。最近关于转甲状腺素淀粉样变患者肝细胞体内编辑的报道是细胞和基因治疗领域的最新前沿205．在相关的努力中，一种使用脂质纳米颗粒实现T细胞靶向体内CAR转染的方法已经被开发出来，用于生成成纤维细胞激活蛋白(FAP)重定向的CAR - T细胞，以靶向心肌损伤背景下的心脏重塑206，207．此外，最近的研究表明，重定向到CD3、CD8和CD4的Nipah慢病毒载体可以特异性地将治疗基因(如CAR和TCR)传递到体内的T细胞群208．这些技术创新为现成的个性化治疗提供了一种新方法，其中靶向病毒载体易于获得，可根据需要给患者使用，从而绕过了大量体外制造的要求，降低了成本并加快了治疗交付。可以想象，靶向体内编辑也可以应用于肿瘤细胞，推动修改，以恢复它们对抗肿瘤药物的敏感性或消除耐药机制。虽然目前的研究主要集中在CAR - T细胞治疗，但体内工程也可能适用于基于NK细胞的治疗，例如增强内源性NK细胞的功能和持久性，或增加肿瘤对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性。

随着该领域继续快速创新，重要的是要了解与这些各种基因编辑策略相关的潜在安全风险，因为与可能的脱靶效应相关的担忧非常相关。最近，由于染色体异常、治疗相关的AML/骨髓增生异常综合征(MDS)或注入的CAR - T细胞产品的恶性转化，多个正在进行的细胞治疗试验停止209证明这些担忧是正确的，并提醒人们密切研究工程产品安全性的重要性。此外，至关重要的是，细胞治疗项目实施系统筛选产品的管道，以评估可能导致有害影响的潜在不需要的基因修饰。利用诸如NIH的SCGE计划等资源，可以提供启动这些行动所需的初步支持。

尽管基于NK细胞的免疫疗法被定位为一种安全的现成抗肿瘤疗法，但重要的问题仍然悬而未决。阐明决定NK细胞效力和持久性的关键参数将是重要的，因为该领域正在发展解决每种疾病适应症具体挑战的方法。此外，与使用共刺激信号、细胞因子装甲和与其他治疗方式结合相关的决定将在最大限度地延长过继转移NK细胞的寿命和益处方面发挥作用。最后，开发和实施NK细胞扩增和冷冻保存的最佳方法将是至关重要的，以确保高产品质量的持续性。从逻辑上讲，新兴的NK细胞治疗项目要想取得成功，就必须建立由研究人员、临床医生和监管官员组成的多学科团队结构，共同勾勒出临床转化的整体路径。