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胃质子泵HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba-ATPase-is p型atp酶负责酸化的胃液pH值1。这对应于那个壁细胞的跨膜质子梯度,已知最陡的阳离子梯度任何哺乳动物的组织。HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Baatp酶是一种重要的药物治疗胃acid-related疾病的目标。这里我们提出晶体结构的HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶在复杂和两个拦截器,vonoprazan SCH28080, luminal-open状态,在2.8的决议。药物有部分重叠,但分明绑定模式在管道运行从胃腔cation-binding网站。晶体结构表明,紧cation-binding站点的配置降低了pgydF4y2BaKgydF4y2Ba一个gydF4y2BaGlu820价值甚至足以使一个质子的释放到环境pH值1的胃。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们谢谢m .谷口的技术援助;t . Imagawa互补的猪胃HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶;p .村庄分享晶体筛选矩阵;d·麦金托什改善手稿;p·尼森和c Toyoshima关键讨论;和k谷口的初始阶段的支持这个项目。这项工作是支持的科研补助金(B),从JST波峰(JPMJCR14M4)和基础支持创新药物研究和生命科学研究(·);科学研究补助金(S),日本的新能源和工业技术发展组织(NEDO)和日本医学研究和开发署(艾湄湾)(Y.F.)。执行的同步辐射实验在BL32XU和BL41XU SPring-8批准日本同步加速器辐射研究所(JASRI提案数量:2011 b1240 2014 a1248 2014 b1165 2015 b1042 b2721 2016和2017 b2701)。我们感谢beamline人员的设施和支持。gydF4y2Ba
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自然gydF4y2Ba由于m . Palmgren h·保尔森,另一个匿名的评论家(s)为他们的贡献的同行评审工作。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者和联系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
·和Y.F.设计的研究。·和H.S.表达的蛋白质。·H.N.提纯和结晶蛋白质。·进行生化分析。·,H.N. and K.I. corrected the X-ray diffraction data. K.A. and K.I. analysed the structures. All authors interpreted the structure and wrote the manuscript.
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扩展数据图1胃H的结晶gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba净化HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在HEK293细胞atp酶表达。巷1:随着膜分数,巷2:通过国旗的树脂、巷3:洗分数,巷4:由国旗肽洗脱,巷5:TEV蛋白酶endoglycosidase-treated样本,巷6:直通Ni-NTA分数和直链淀粉树脂、巷7:集中峰值分数由凝胶排阻层析法。gydF4y2BabgydF4y2Ba的洗脱图affinity-purified HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶Superose6增加10/300。黑色,红色和绿色箭头指示洗脱体积的聚合,α-β-complex HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba分别atp酶和裂解EGFP。净化是复制,代表结果在图中所示。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba晶体的HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶的存在vonoprazan (gydF4y2BacgydF4y2Ba)或SCH28080和RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba)。酒吧,规模100μm。gydF4y2BaegydF4y2Ba,x射线衍射vonoprazan-bound晶体。2.3放大图像显示的衍射斑点的方向gydF4y2Bac *gydF4y2Ba轴,尽管晶体显示各向异性衍射。大多数晶体衍射斑点的2.8在类似的结晶条件和一些晶体衍射斑点比2.3,如图。gydF4y2BafgydF4y2Ba、水晶包装。非对称单元(分子在左下角,描绘成在无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)包含一个α-β-complex HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(α-subunit,浅蓝色;β-subunit、小麦;vonoprazan,洋红色),挤满了gydF4y2BaPgydF4y2Ba3gydF4y2Ba1gydF4y2Ba21对称。单位细胞和膜的近似位置飞机提供灰色和黄色框,分别。gydF4y2Ba
扩展数据图2晶体结构的胃HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶SCH28080。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba的总体结构luminal-open E2P HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶包裹着SCH28080(丝带(原理图)E2BeF)表示,如无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。绑定SCH28080和三个RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba离子分别显示为绿色和紫色的球体。插图,SCH28080的化学结构。gydF4y2BabgydF4y2Ba从Rb、洋红色网显示异常的峰值gydF4y2Ba+gydF4y2Ba波状外形的在5gydF4y2BaσgydF4y2Ba水平,这表明三个RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba离子(蓝色、黄色和红色框)绑定到HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(原理图)E2BeF(显示为彩色丝带)。蓝色,核苷酸域和致动器域之间的接口symmetry-related邻近分子(灰色丝带)。黄色,KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定的网站在磷酸化作用域,这是同源SERCA和NagydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶。红色,异常峰值在跨膜cation-binding网站找到。gydF4y2BacgydF4y2Ba(原理图)的分子表面E2BeF结构,从腔的一侧的膜。绑定SCH28080(绿棒)块的管道连接到cation-binding网站。gydF4y2BadgydF4y2Ba、结构如gydF4y2BacgydF4y2Ba,但删除绑定SCH28080,表明RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定到cation-binding站点(紫色)暴露在腔的解决方案。gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba,CgydF4y2BaαgydF4y2Ba的痕迹表明H原子模型叠加gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(冯)E2BeF(蓝色,绑定vonoprazan显示为球体)。gydF4y2Ba
扩展数据图3 TM2螺旋集群和疏水性。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba、致动器之间的接口和磷酸化作用域和胞质部分TM2的luminal-open E2P H的状态gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(冯)E2BeF (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba)和luminal-closed E2P SERCA的过渡态E2-AlF (PDB代码:2 zbg)gydF4y2Ba18gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba)所示。这两个原子模型是根据TM7-TM10叠加结构。破碎的盒子对整个分子结构(左上)表明该区域所示gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba从左(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba)或前(gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba)的分子。致动器域(绿色),TM1-TM2(蓝色),和TM3-TM4(青色)包突出显示。残留导致的疏水相互作用gydF4y2Ba19gydF4y2Ba(橙色的虚线圆)表示与类似的着色领域各自的结构组件。在H Phe170gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶是同源Tyr122 SERCA的。因为不同的磷酸盐类似物之间的协调几何(性能试验gydF4y2Ba3gydF4y2Ba−gydF4y2Ba浅蓝色;阿尔夫gydF4y2Ba4gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,粉红色)和tg主题(显示为黑颜色在每个模型)在致动器之间的接口和磷酸化作用域(见图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba关闭视图),执行机构的方位位置域两个结构之间的不同(大约30°,橙色箭头所示gydF4y2BabgydF4y2Ba)。因此,TM2的胞质部分显示了不同构象luminal-openα-helical结构之间E2P (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba)和解除循环结构luminal-closed E2-P形式(gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba)。CgydF4y2BaαgydF4y2Ba职位Ile119和Met334 HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(门门闩)及其同源残留SERCA (Ile71和Val300)红色(见图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2BaegydF4y2Ba鲁米那门关闭的示意图gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶。在luminal-open E2P状态(左),Ile119 (TM1)和Met334 (TM4)作为一个门闩保持直立cytoplasmic-side TM1-TM2包的位置(用虚线和箭头表示)。绑定counter-transporting KgydF4y2Ba+gydF4y2Bacation-binding网站诱发腔的门关闭(右),这是伴随着TM3-TM4包(图的横向运动。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)和downward-sliding运动TM1-TM2包在左面板(红色箭头)。TM1-TM2结果的滑动运动解除TM2的胞质部分和传动装置的旋转域相对于磷酸化作用域。最后,结合磷酸反应中心的磷酸化作用域是水解由于tg的位移循环。由于缺少互动Ile199和Met334 alanine-substituted突变体(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba),TM1-TM2包可能滑动;因此,鲁米那门关闭自发不管KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定到cation-binding站点。因此,引起自发的去磷酸化,产生KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba独立的atp酶活性。gydF4y2Ba
扩展数据图4 P-CAB-binding网站。gydF4y2Ba
逆的情节1 /gydF4y2BavgydF4y2Ba和1 / (KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)的野生型酶在不同浓度的P-CABs (vonoprazan: 0、5、10、20 nM (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba);SCH28080: 0、200、500和1000 nM (gydF4y2BabgydF4y2Ba),蓝色,绿色,黄色和红色圆圈对应各自P-CAB浓度),显示出典型的KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba竞争性抑制HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Baatp酶活性。一式三份的数据代表的意思是±s.e.m.指向每个表示KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba浓度;代表超过三个独立的测量结果。每个插图提供了它们的化学结构。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba,2gydF4y2BaFgydF4y2BaogydF4y2Ba−gydF4y2BaFgydF4y2BacgydF4y2Ba电子密度图(波状外形的2gydF4y2BaσgydF4y2Ba)vonoprazan - (gydF4y2BacgydF4y2Ba)和SCH28080-binding网站(gydF4y2BadgydF4y2Ba),从大约平行膜面。在gydF4y2BadgydF4y2Ba,SCH28080被描绘成小麦色清晰。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba的横截面P-CAB-binding网站垂直于膜面。截面表面浅蓝色所示,分子表面显示为浅灰色(碳),与其他颜色对应不同的元素(红、氧气;蓝色、氮;黄色、硫)。透明球体的每个P-CABs代表他们的范德瓦耳斯半径,显示紧密绑定的绑定的口袋里。gydF4y2BaggydF4y2Ba。跨膜区域的结构比较vonoprazan-bound(红色),SCH28080-bound(绿色)HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶和ouabain-bound NagydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(小麦),从鲁米那一边。结合乌本苷和毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba在钠离子gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶结构显示清晰。gydF4y2BahgydF4y2Ba、乌本苷和毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba离子是叠加在vonoprazan-bound HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶结构(丝带)。7个氨基酸的HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶,突变的高亲和性乌本苷提供绑定,表示(灰色棒),相应的氨基酸NagydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶在括号中表示。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba,绑定SCH28080叠加在结构所示gydF4y2BahgydF4y2Ba。看到gydF4y2Ba补充信息gydF4y2Ba获取详细信息。gydF4y2Ba
扩展数据图5gydF4y2BaFgydF4y2BaogydF4y2Ba−gydF4y2BaFgydF4y2BacgydF4y2BaP-CABs地图。gydF4y2Ba
的gydF4y2BaFgydF4y2BaogydF4y2Ba−gydF4y2BaFgydF4y2BacgydF4y2Bavonoprazan密度(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和SCH28080 (gydF4y2BabgydF4y2Ba5)波状外形的gydF4y2BaσgydF4y2Ba(蓝色网)立体视图所示。氨基酸参与绑定以棍棒表示。gydF4y2Ba
扩展数据图6 Rb Cation-binding网站gydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定,luminal-open E2P状态。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,特写cation-binding网站的HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(原理图)E2BeF认为大约垂直于膜从胞质(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),平行于膜从TM4 (gydF4y2BabgydF4y2Ba)。3.5残留位于相邻原子之间由虚线连接。绑定RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(紫色球)和水分子(红色)也表示。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba和Rb之间,比较cation-binding站点gydF4y2Ba+gydF4y2Ba丝带绑定(原理图)E2BeF(颜色)和(冯)E2BeF(小麦),显示Glu820倾向的侧链向RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba伴随着RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定(箭头)。只有极地残留在清晰的观察到的区域所示。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba阻挡(KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)gydF4y2Ba2gydF4y2BaE2-MgF Na的状态gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(浅灰色,PDB代码:2 zxe)叠加在RbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定(原理图)E2BeF H的状态gydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(彩色丝带)。粉色球用红色突出显示圈(网站I和II)表明绑定KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在NagydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Baatp酶的结构。原子模型是基于对齐TM7-TM10蛋白质的一部分。箭头表示位移的TM4腔的部分从luminal-open luminal-closed形式。TM5从结构中移除所示gydF4y2BadgydF4y2Ba和gydF4y2BafgydF4y2Ba为清晰。gydF4y2Ba
扩展数据图7氢键网络。gydF4y2Ba
一个跨膜cation-binding HgydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(冯)E2BeF显示,从TM6方面。只显示了极地残留物,以及每个残留提供之间的距离。球体表明立场负责NagydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定的网站(》)NagydF4y2Ba+gydF4y2BaKgydF4y2Ba+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶E1P-ADP状态gydF4y2Ba43gydF4y2Ba。Asp942的接近,彼此Arg946表明这些残留物形成盐桥。gydF4y2Ba
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视频1:晶体结构的H +, K + atp酶必将vonoprazan E2BeF(冯)gydF4y2Ba
原子模型的H +, K + atp酶(冯)E2BeF如图1所示gydF4y2Ba
视频2:Cation-binding网站E2BeF(冯)gydF4y2Ba
跨膜cation-binding站点的H +, K + atp酶(冯)与cytoplasmic-side E2BeF认为平行于膜正常。极性侧链可能参与了阳离子运输与它们之间的距离表示gydF4y2Ba
视频3:Cation-binding网站在Rb +绑定E2BeF(原理图)gydF4y2Ba
跨膜cation-binding站点的H +, K + atp酶(原理图)与cytoplasmic-side E2BeF认为平行于膜正常。绑定Rb +(紫色球)和极性侧链可能参与了阳离子运输与它们之间的距离表示gydF4y2Ba
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安倍,K。,Irie, K., Nakanishi, H.et al。gydF4y2Ba胃质子泵的晶体结构。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba556年gydF4y2Ba,214 - 218 (2018)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 018 - 0003 - 8gydF4y2Ba
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