基于活动的E3连接酶分析揭示的E3连接酶酯化活动gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba,e3可以有不同的E2的偏好gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba获得广泛的覆盖面,所以我们准备好的生物素化的abp基于混杂E2 UBE2D2(转化),和HECT / RBR-specific E2 UBE2L3 (ABP2)。为我们准备好的控制abp E2-recognition组件中包含一个点突变干扰或损害E3连接酶绑定,UBE2D2 (F62A) (ABP3)和UBE2L3 (F63A) (ABP4)gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。泛素在转化和ABP3延长一个残留相对于之前报道gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba(乌兰巴托gydF4y2Ba_{1 - 74gydF4y2Ba}而不是乌兰巴托gydF4y2Ba_{1 - 73gydF4y2Ba}),这个标签RBR E3 HOIP的效率提高。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba描述biotin-labelled,截断ubiquitin-thioester中间,biotin-UbgydF4y2Ba_{1 - 73gydF4y2Ba}用于ABP2和ABP4 sr。高效液相色谱色谱监测紫外吸光度在214 nm(至于所有后续中间体和abp)。应急服务国际公司质谱(嵌入左)和deconvoluted质谱(插图)。预期质量= 9093 Da(−满足);发现质量= 9091哒。gydF4y2BabgydF4y2Ba,描述UBE2L3 ABP2。应急服务国际公司质谱(嵌入左)和deconvoluted质谱(插图)。预期质量= 29286。9 Da(−满足);发现质量= 29282哒。gydF4y2BacgydF4y2Ba,描述UBE2L3 ABP4 (F63A)。应急服务国际公司质谱(嵌入左)和deconvoluted质谱(插图)。预期质量= 29210 .8 Da(−满足);发现质量= 29206哒。gydF4y2BadgydF4y2Ba与扩展,表征探测器中间泛素C末端,biotin-UbgydF4y2Ba_{1 - 74gydF4y2Ba}sr用于制造转化和ABP3。应急服务国际公司质谱(嵌入左)和deconvoluted质谱(插图)。预期质量= 9249。2 Da(−满足);发现质量= 9247哒。gydF4y2BaegydF4y2Ba,描述UBE2D2转化。应急服务国际公司质谱(嵌入左)和deconvoluted质谱(插图)。预期质量= 29268 .8 Da(−满足);发现质量= 29264哒。gydF4y2BafgydF4y2Ba,描述UBE2D2 ABP2 (F62A)。应急服务国际公司质谱(嵌入左)和deconvoluted质谱(插图)。预期质量= 29192 .7 Da(−满足);发现质量= 29186哒。中间体和探测器已经准备和三倍以上特征相似的结果。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba、并行分析的神经母细胞瘤和abp SH-SY5Y细胞提取物进行了1 - 4。作为额外的控制,细胞不及时治疗或治疗与氧化磷酸化抑制剂寡霉素和抗霉素A,使活动依赖性RBR E3帕金的标签gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。ABP-labelled蛋白质丰富与链霉亲和素树脂对树脂紧随其后胰蛋白酶的消化。获得肽被视质/ MS分析。恢复蛋白质与E3-associated过滤包含域术语(环、HECT IBR,有关zf-UBR)和蛋白质只有不到三个光谱计数被排除在外。e3没有证明光谱计数超过14倍浓缩比控制方法进行了净化,ABP的保留,也排除在外。e1产生了一个强烈的信号,因为他们接受transthiolation和由我们的abp高纯度。光谱项的数量对于大多数HECT / RBR e3降低了> 50%时,相对于他们的父母同行binding-defective控制探针ABP3和ABP4(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。总数量的恢复HECT / RBR e3转化和ABP2 33 (22 HECT 11 RBR),代表目前大约80%的注释HECT / RBR e3(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。e3保持宽容的一个子集来控制探针ABP3 ABP4;我们不能确定这是因为各自的e3 activity-independent地贴上标签或是否宽容F62A或F63A突变。此外,ABP-dependent光谱计数信号不规范化对蛋白质的丰度。因此,我们不能从E3 deconvolute E3激活化学计量的影响,丰富(即高度丰富的E3 low-activation状态能产生不成比例的高信号在我们的数据)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,光谱项的数量恢复E1和E3蛋白质策划对蛋白质ID UBE2D2转化及其各自控制探针UBE2D2 ABP3 (F62A)。MYCBP2收益率高信号与转化,与ABP3减少超过50%。许多环e3绑定ABP也贴上标签,和大多数情况下这是假定从力学上看是不相干的标签是加剧了大规模spectrometry-based检测灵敏度高。另一个可能性是,迄今未发现的RING-linked e3被贴上标签。gydF4y2BabgydF4y2Ba,光谱项的数量恢复E1和E3蛋白质策划对蛋白质ID UBE2L3 ABP2与各自的控制探针UBE2L3 ABP4 (F63A)。MYCBP2没有检测到UBE2L3 ABP2 ABP4。gydF4y2BacgydF4y2Ba,光谱项的数量为E1和E3蛋白质与转化获得治疗和寡霉素和抗霉素经处理的细胞。gydF4y2BadgydF4y2Ba,光谱项的数量与ABP2 E1和E3蛋白质获得治疗和寡霉素和抗霉素经处理的细胞。帕金肽只是恢复细胞接受寡霉素和抗霉素A,与活动依赖性帕金标签一致。因此,至少发现E3的子集,光谱计数与E3活动。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,重组MYCBP2 (cat)是异形His-tagged abp基于e2 UBE2D2 (ABP5)和UBE2D3 (ABP6)。实验重复了两次类似的结果。gydF4y2BabgydF4y2Ba,假定的活性部位半胱氨酸MYCBP2 ABP测定分析cysteine-to-serine面板的突变体。MYCBP2 (cat)突变体(3μM)与ABP6孵化(12μM) 30°C 4 h。ABP-treated样本解决通过sds - page和可视化Coomassie染色和免疫印迹hexahistidine记者ABP标签。三个半胱氨酸残基突变(C4506, C4520和C4537)废除ABP标签。星号对应于无意的乳沟hexahistidine标签的ABP由于跟踪蛋白酶E3制剂的污染。实验重复了两次类似的结果。gydF4y2BacgydF4y2Ba使用叮铃声软件,38个光谱匹配相应的野生型MYCBP2 cysteine-labelling网站gydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba被确定。36这些C4520。剩余的两个匹配与C4440,预测Zn-coordinating残留在环域。其他剩余的比赛与C4600,没有明显影响突变时ABP标签。下表列出了一些代表性的预测和发现碎片离子谱图中描述。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba。频谱是5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba前体离子(预计gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba= 614.5094;观察到的gydF4y2Ba米gydF4y2Ba/gydF4y2BazgydF4y2Ba= 614.5088)。质量公差20 p.p.m.申请碎片离子的分配。实验进行了一次。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba凝结,质谱产品泛素与甘油,和泛素和三。预期质量与甘油= 8639 Da泛素缩合;发现质量= 8637哒。预期质量与三羟甲基氨基甲烷= 8668 Da液泛素缩合;发现质量= 8666哒。这个实验被重复两次类似的结果。gydF4y2BabgydF4y2Ba,三羟甲基氨基甲烷和丙三醇液的化学结构。gydF4y2BacgydF4y2Ba对三羟甲基氨基甲烷和丙三醇液,放电活动的所有测试MYCBP2 (cat) cysteine-to-serine突变体(选择突变体图所示。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)。C4506S突变消除了放电活动,但是因为C4506S驻留在一个Cys-X-X-Cys Zn-binding主题,这被认为是一个结构性缺陷而非催化缺陷。C4561S突变发生异常的硫酯加合物的形成;这可能是因为C4561S突变(也在结构上重要Cys-X-X-Cys Zn-binding主题)展开的蛋白质和解放半胱氨酸残基,否则会被占据锌配体。这些实验重复两次类似的结果。gydF4y2BadgydF4y2Ba与GST-MYCBP2, Coomassie污点thioester-ester诱捕试验(cat)。后凝固态荧光扫描,如无花果所示。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba凝胶是Coomassie染色。实验至少重复三次得到了类似的结果。gydF4y2BaegydF4y2Ba,RCR E3连接酶活动是依赖C4520和C4572。的组合不活跃C4520S突变的C4572A突变没有恢复活动;因此在这两个之间似乎cis-cooperation残留物(* E3突变体浓度升高)。这个实验被重复两次类似的结果。gydF4y2BafgydF4y2Ba,此外,与cis-cooperation一致,无标记MYCBP2 SEC-MALS数据(cat)符合一种单分散计算分子量为30.06±6.00 kDa(理论分子量MYCBP2 (cat)单体= 30.08 kDa)。实验重复了两次类似的结果。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、液相色谱放电反应的野生型MYCBP2 (cat)到苏氨酸(50毫米)。注意,酯化苏氨酸与自由氨基酸可以接受设计酰基转移,形成peptide-linked物种。gydF4y2BabgydF4y2Ba、集成single-quadrupole电喷雾质谱的整个峰值突出显示在上面的色谱图。插图显示了deconvoluted质谱(如无花果所示。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。预期的质量Thr-Ub = 8666 Da;发现质量= 8664哒。gydF4y2BacgydF4y2Ba、液相色谱的MYCBP2 (cat) (C4520S)放电反应在苏氨酸的存在(50毫米)。gydF4y2BadgydF4y2Ba、集成single-quadrupole电喷雾质谱的整个峰值突出显示在上面的色谱图。插图显示了deconvoluted质谱(如无花果所示。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。期望修改的泛素的质量= 8565 Da;发现质量= 8563哒。上述所有实验重复三次得到了类似的结果。gydF4y2BaegydF4y2Ba物种,Deconvoluted质谱对泛素的氨基酸(50毫米)。泛素反应物和产品的强度是反映它们的相对丰度。观察到的分子量ubiquitinated丝氨酸(Ub-Ser) = 8650 Da;理论分子量= 8652哒。观察到的质量在8591 Da只对应一个产品是扩展孵化后观察。Ubiquitinated赖氨酸(Ub-Lys)观察分子量= 8691 Da;理论分子量= 8693哒。假设指数泛素消费,gydF4y2BatgydF4y2Ba_1/2gydF4y2Ba苏氨酸大约是5分钟吗gydF4y2Ba_。gydF4y2Ba丝氨酸、gydF4y2BatgydF4y2Ba_1/2gydF4y2Ba慢十倍。赖氨酸泛素化是E3-independent相似程度的修改是在E3的缺失。实验重复了两次类似的结果。gydF4y2BafgydF4y2Ba,Coomassie污点的苏氨酸凝胶在无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba。也显示是deconvoluted质谱的代表所有泛素物种在60分钟的时间点。观察Cy3B-Ub修改苏氨酸肽的质量= 10033 Da;理论质量= 10036哒。gydF4y2BaggydF4y2BaCoomassie污点的丝氨酸凝胶在无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba。也显示是deconvoluted质谱的代表所有泛素物种在点的时间点。观察Cy3B-Ub = 9534 Da的质量;理论质量= 9537哒。观察Cy3B-Ub修改丝氨酸肽的质量= 10019 Da;理论质量= 10022哒。gydF4y2BahgydF4y2BaCoomassie污点赖氨酸凝胶,在缺乏E3,无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba。低效的赖氨酸肽的修改是观察,适度提高在E3的缺失。实验中所示gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba重复三次以上。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba前,观察速率常数(0.024分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})MYCBP2 (cat) -threonine-mediated single-turnover E2-Ub放电,由凝固态的荧光Cy3B-labelled泛素。E2 UBE2D3和基质是苏氨酸(50毫米)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。底,代表复制凝胶用于量化。gydF4y2BajgydF4y2Ba前,观察速率常数UBE3C-lysine介导single-turnover E2-Ub测量放电太缓慢。E2是UBE2L3和衬底赖氨酸(50毫米)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)。底,代表复制凝胶用于量化。gydF4y2BakgydF4y2Ba前,观察速率常数(0.52分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})HHARI-lysine介导single-turnover E2-Ub放电。E2是UBE2L3和衬底赖氨酸(50毫米)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)。这种速度的主要因素是由于autoubiquitination HHARI内赖氨酸残基的因为当赖氨酸扣留,gydF4y2BakgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}HHARI-mediated E2-Ub放电是0.39分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}而这只是部分添加赖氨酸(淘汰出局gydF4y2BangydF4y2Ba对应于生物独立实验)的数量。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,建立熔E3连接酶活动是否发生完全通过提出E3-Ub硫酯中间体,或者,直接提供中介的泛素转移E2-Ub(环E3的特征),我们测试了RCR E3活动与一些UBE2D3突变体(N77S、D87A I88A, L97A, L104A, S108A和D117A),可以诊断为这两个场景gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。Single-turnover E2-Ub放电化验使用Cy3B-labelled泛素证明MYCBP2 E2需求,符合HECT / RBR和环机制。N77和D117突变改变E2氨基酸参与pgydF4y2BaKgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}抑制受体的亲核试剂,环所需的活动gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}。此外,环活动的特点是采用一个“封闭”涉及E2残留D87 E2-Ub构象,I88, L97, L104 S108。与环需求、UBE2D3 S108 D117是可有可无的,E2-E3 transthiolation活动。I88A突变降低了活动,N77S变异强烈活动受损,而D87A, L97A L104A突变体的活动是可以忽略的。此外,RBR E3 L104A突变体活动是宽容的gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。因此,根据我们目前了解的E2要求这些E3类,MYCBP2 E2需求,符合HECT / RBR-like机制和环状的机制。然而,我们不能正式排除MYCBP2的可能性gydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba引发一个封闭E2-Ub构象,环e3的特征,因为它不包含禁止RING-domain循环插入gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba。gydF4y2BabgydF4y2Ba、量化不同的E2基因突变的活动。的百分比E2-Ub放电。gydF4y2BangydF4y2Ba= 2生理上独立的实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba,17 e2了苏氨酸检测放电活动GST-MYCBP2(猫)。UBE2D1 UBE2D3和UBE2E1唯一e2,证明检测活动。,修改的E2的位置;* ubiquitin-charged E2。出乎意料地,HECT / RBR-specific E2 UBE2L3显示与MYCBP2微不足道的活动。某些e2进行E3-independent polyubiquitin链形成和/或autoubiquitination。在UBE2Q2面前,GST-MYCBP2经历轻微退化导致两个lower-molecular-weight物种的出现。因此,我们也进行了测定与未加标签的MYCBP2不发生降解;这产生了类似的结果,表明UBE2Q2不支持MYCBP2活动。实验重复了两次类似的结果。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba,广角视图。区域的颜色是有区别的贴表示:环域(蓝色),链接器螺旋(紫色),helix-turn-helix主题(绿色)和tandem-cysteine域(橙色)。网代表实验2 |gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}|−|gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}|电子密度地图轮廓线为1.5gydF4y2BaσgydF4y2Ba。C4572是下游催化酯化的半胱氨酸残基的网站。中介循环区域之间形成A4518 G4527和无序的结构。gydF4y2BabgydF4y2Ba,关闭中介循环的区域。gydF4y2BacgydF4y2Ba,关闭了酯化的网站。从symmetry-related分子T4380主题(T4380(对称))显示和代表灰色球棍。gydF4y2BadgydF4y2Ba,MYCBP2叠加环域正则环的环域E3连接酶RNF4gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba,从RBR E3连接酶HOIPgydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。gydF4y2BaegydF4y2Ba链接器螺旋和helix-turn-helix主题串联连接环域的半胱氨酸域。gydF4y2BafgydF4y2Ba、图描绘了锌协调网络串联半胱氨酸的域。催化残基(编号)的形式分布于整个串联半胱氨酸多肽。gydF4y2BaggydF4y2Ba串联半胱氨酸领域,赋予苏氨酸特异性存在于所有MYCBP2 orthologues。所有残留显示所需的苏氨酸酯化活动是守恒的。星号对应Zn-binding残留、灰色箭头对应β-strands,黄金矩形对应3gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba螺旋线,红色缸对应于一个α-helix。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、泛素加合物形成的催化突变体GST-tagged MYCBP2(猫)。H4583N突变经历near-quantitative ubiquitin-adduct形成。加合物主要硫醇治疗后,表明通过硫代酸酯与E3泛素。上带的扩散性质可能是因为存在困thioester-linked C4520泛素,和C4572 H4583N突变阻碍底物去质子化。C4572S / H4583N双突变形式只有一个泛素thioester-linked加合物,想必C4520残渣。这表明工程ester-linked加合物的形成突变S4572残渣依赖一般的存在基础。C4520似乎没有一个基本接近,因此活动可能是由于其内在的pgydF4y2BaKgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}这导致它在生理pH值没有被亲核的基础。这可以解释为什么我们未能产生一个工程酯加合物突变S4520残留,为丝氨酸完全质子化了的生理博士实验重复了两次类似的结果。gydF4y2BabgydF4y2Ba环域的叠加,RBR E3连接酶HOIP与E2在复杂(PDB ID: 5产品类别;泛素与E2,省略了由于直接与串联半胱氨酸冲突域gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba)允许E2的造型结构(灰色卡通表示)。催化C85残留在E2(突变在硅片赖氨酸半胱氨酸gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba)是近端C4520,经历transthiolation E2-Ub。没错,自顶向下关闭中介循环的地区。八个失踪的残留物形成中介循环布朗示意图中文字。gydF4y2BacgydF4y2Ba的模型,提出了泛素继电器中间图所示。gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba但从另一个角度来看。在实验结构,tandem-cysteine-domain残留物所示橙色和mediator-loop残留在深棕色。在模型中,tandem-cysteine-domain残留在光橙色和mediator-loop残留在淡紫色。模仿E2,基于叠加gydF4y2BadgydF4y2Ba在灰色的卡通。基本半胱氨酸C4520和C4572黄色和彩色的原子类型。泛素残留G75-G76蓝色球棍表示,是由原子的类型。g残留在中介循环可能是重要的for循环流动显示在淡紫色的球棍和彩色的原子类型。N4570和H4583侧链由指定的旋转角度,以减轻空间冲突。gydF4y2BadgydF4y2Ba,如gydF4y2BacgydF4y2Ba,但氨基酸侧链被翻来缓解空间与模仿中介循环用蓝色标记。gydF4y2BaegydF4y2Ba模型结构,所有φ和ψ角属于接受值由拉玛钱德朗分析横冲直撞的服务器gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。gydF4y2Ba