CDK12通过抑制内含子多聚腺苷酸化调节DNA修复基因gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，原理图gydF4y2BaCdk12gydF4y2BaΔ细胞系生成、LoxP位点(红色三角形)、sgRNA切割位点(*)、内源性启动子(黑色箭头)和强力霉素诱导启动子(橙色箭头)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， PCR产物横跨gydF4y2BaCdk12gydF4y2Ba基因位点侧面外显子4(引物显示为橙色箭头)的野生型mES细胞和gydF4y2BaCdk12gydF4y2Ba∆克隆。在本研究中使用的克隆28和36用红色表示。gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba，表型数据来自两个独立推导的第二个gydF4y2BaCdk12gydF4y2Ba如图所示结果所示的Δ克隆。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba为了另一个克隆体。gydF4y2BacgydF4y2Ba，停用强力霉素(Dox)后CDK12转基因(HA表位)表达的代表性免疫印迹。gydF4y2BadgydF4y2Ba，流式细胞仪测定活细胞24小时内的折叠变化;柱状表示平均折叠变化(±s.e.m.)gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物重复。细胞在Dox中持续生长(蓝色条)，在时间0时从Dox中提取并保持在Dox外(红色条)，或在时间0时从Dox中提取，在48小时(橙色条)或72小时(黄色条)后重新引入Dox，直到剩余时间。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在相同的条件下，一个具有代表性的复制的基于facs的细胞周期分析gydF4y2BadgydF4y2Ba(上)和量化(下)。gydF4y2BafgydF4y2Ba，基于流式细胞术的caspase 3阳性(凋亡)细胞定量分析。一个有代表性的生物复制。gydF4y2BaggydF4y2Ba中性彗星法量化未修复DNA双链断裂程度gydF4y2BaCdk12gydF4y2Ba停用强力霉素48小时后，Δ细胞。箱线图:第25和第75个四分位数的中值;胡须显示最小值到最大值。gydF4y2BaPgydF4y2Ba基于单边曼-惠特尼的价值gydF4y2BaUgydF4y2Ba测试。gydF4y2BahgydF4y2Ba，免疫印迹检测CDK12缺失时总Ser15 (P-Ser15) p53和磷酸化的p53。HSP90作为负载控制。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，停药24小时(左)或48小时(右)后总基因水平显著基因表达事件的火山图。gydF4y2BaygydF4y2Ba设在:FDR-adjustedgydF4y2BaPgydF4y2Ba由R中的DESeq包确定的值;彩色点:PPDE > 0.95(由EBSeq包在R中确定)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，饼图显示了停药24或48 h后总基因表达量下降(左)或增加(右)的基因。可能的次要影响表明:p53抑制基因(红色)，p53增强基因(蓝色)，二价启动子基因(黄色)，p53抑制和二价启动子基因(橙色)，p53增强和二价启动子基因(绿色)。不属于上述任何一类的基因用灰色表示。gydF4y2BacgydF4y2Ba，总结了24和48小时后观察到的重要的替代剪接事件gydF4y2BaCdk12gydF4y2BaΔ细胞。gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba，亚型特异性RT-qPCR证实了RNA测序数据中观察到的差异亚型使用。蓝柱(+Dox)和红柱(-Dox 48 h)代表平均值(±s.e.m.)，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个生物重复。来自五个基因的七个IPA异构体在两个独立的实验中得到验证gydF4y2BaCdk12gydF4y2BaΔ克隆在gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba并在这五个基因中验证了相应的远端多聚腺苷酸异构体gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba表示两个独立推导出的相应数据gydF4y2BaCdk12gydF4y2Ba在整个研究过程中使用了Δ克隆。gydF4y2BahgydF4y2Ba，左，IPA站点显示有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba}< 0.05, FDR调整gydF4y2BaPgydF4y2BaR中DEXSeq包测定的值在Dox消耗24或48 h后，在表达基因中改变(橙色)或不改变(蓝色)。右，表达的末端多聚腺苷酸位点显著改变(橙色)或与其余转录本归一化后无统计学意义(蓝色)的基因。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，散点图显示日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba远端外显子CDK12缺失后的折叠变化(gydF4y2BaygydF4y2Ba-轴)与IPA位点(gydF4y2BaxgydF4y2Ba-轴)的基因具有统计学意义上显著的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba}< 0.05) IPA位点及远端多聚腺苷酸改变有统计学意义;gydF4y2BangydF4y2Ba=每个条件4个生物重复。gydF4y2Ba

用单个抗体分解的元基因谱。蓝线:中特定ChIP抗体的归一化读密度gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物重复。橙色线:阴性对照(结合全细胞提取物和所有抗体阴性对照，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个生物重复)。黑色虚线:折叠富集(特定ChIP/阴性对照)。阴影区域:−loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(bin-wisegydF4y2BaPgydF4y2Ba值，Kolmogorov-Smirnov单侧检验)的读深差异，蓝色阴影表示正CDK12信号明显更大。−日志gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值显示在右边的轴上，水平虚线为gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05。TSS，转录起始位点。远端聚a，远端聚腺苷酸位点。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、生物复制和抗体复制实验设计示意图。每个芯片组(RNAPII和Ser2p，在CDK12gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或CDK12gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba细胞)由两个生物重复组成，每个芯片上都有两种识别相同蛋白质的不同抗体。然后将这4个重复组合用于ChIP宏基因分析。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba，用于确定ChIP测定的平均读密度的步骤示意图，以及用于确定依赖于CDK12表达的读密度的显著差异的统计检验。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、出现显著变化的基因长度和表达量四分位数(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba}< 0.05, FDR调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba在IPA或远端异构体中由DEXSeq包在R中确定的值)。箱线图:中位数，第25和第75四分位数;胡须显示1.5 ×四分位范围。gydF4y2BangydF4y2Ba=每个条件4个生物重复。顶部面板:大小分布(对数gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba每个长度四分位数(左)和基因表达分布(loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba每个表达四分位数(右)与所有表达基因的各自分布进行比较。底部面板:每个长度四分位数的表达式分布(左)和每个表达式四分位数的长度分布(右)。请注意，基因长度通常与表达水平呈负相关，但显著变化的IPA/远端亚型的所有四分位的中位表达均高于所有表达基因的中位表达。此外，显著变化的IPA/远端异构体的所有表达四分位数的中位数长度都长于所有表达基因的中位数。因此，组成显著变化的IPA/远端亚型集的基因比更广泛的基因群的长度更长，表达水平更高。gydF4y2BabgydF4y2Ba，在具有统计学意义的cdk12敏感IPA或末端位点的基因中，RNAPII密度的宏基因谱分为基于长度的四分位数。在最短的四分位数中，CDK12缺失的细胞在3 '端呈密度增加的趋势，但在聚合酶达到比CDK12活性细胞更高的密度之前，最短的基因终止。相反，最长的基因表达在较低的水平(见gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，导致RNAPII ChIP讯号降低。由于这些原因，最短和最长的四分位数被排除在图中。gydF4y2Ba3 b、dgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，在具有统计学意义的cdk12敏感IPA或末端位点的基因中，RNAPII密度的宏基因谱分为基于表达的四分位数。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，实线表示归一化读密度(蓝色，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个独立芯片)或没有(红色，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个独立芯片)CDK12;阴影区域表示−loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(bin-wisegydF4y2BaPgydF4y2Ba值，Kolmogorov-Smirnov单侧检验)的读密度差异(蓝色表示CDK12 .gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba信号较大，粉红色表示CDK12gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba信号更大)。水平虚线:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05。DPA，远端多聚腺苷酸位点。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，一组对照基因中RNAPII密度的Metagene谱与IPA或远端异构体显著变化的基因组长度匹配。顶部，所有控制基因。底部，去掉最短和最长的四分位数(如图所示)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．gydF4y2BabgydF4y2Ba，一组对照基因中RNAPII密度的Metagene谱与IPA或远端异构体显著变化的基因组长度匹配，分为长度四分位数。gydF4y2BacgydF4y2Ba，一组对照基因表达中RNAPII密度的Metagene谱，与IPA或远端异构体显著变化的基因组相匹配。gydF4y2BadgydF4y2Ba，一组对照基因表达RNAPII密度的Metagene谱，与IPA或远端异构体显著变化的基因组相匹配，分为表达四分位数。gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba，实线表示归一化读密度(蓝色，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个独立芯片)或没有(红色，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个独立芯片)CDK12;阴影区域表示−loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(bin-wisegydF4y2BaPgydF4y2Ba值，Kolmogorov-Smirnov单侧检验)的读密度差异(蓝色表示CDK12 .gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba信号较大，粉红色表示CDK12gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba信号更大)。水平虚线:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05。gydF4y2Ba

对于IPA或远端亚型发生显著变化的基因，第一个稳定核小体上游和下游1 kb的RNAPII总宏基因密度，分为基因表达四分位。如Fig。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba，实线表示有(蓝色)或没有(红色)CDK12的标准化读深度，阴影区域表示−loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(bin-wisegydF4y2BaPgydF4y2Ba(Kolmogorov-Smirnov单侧检验)，蓝色阴影表示正CDK12信号明显更大，粉色阴影表示负CDK12信号明显更大。水平虚线为gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05。垂直虚线表示第一个稳定核小体二分体的位置。gydF4y2BangydF4y2Ba=每个条件4个生物重复。gydF4y2Ba

左为Ser2p RNAPII基因密度的宏基因谱，具有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba}< 0.05, FDR调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba由DEXSeq包在R中确定的值)cdk12敏感IPA或末端位点分为基于长度的四分位数。如Fig。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba，蓝色实线表示CDK12的平均归一化读密度gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba红色实线为cdk12缺失样本的平均归一化读密度。浅蓝色阴影表示正CDK12信号明显更大。gydF4y2BangydF4y2Ba=每个条件4个生物重复。右，在具有统计学意义的cdk12敏感IPA或末端位点的基因中，Ser2p RNAPII密度的宏基因谱被划分为基于表达的四分位数。gydF4y2BangydF4y2Ba=每个条件4个生物重复。gydF4y2Ba

顶部，由于RNAPII通过包含IPA位点(红色八边形)的基因区域转录(蓝色为外显子区域，5 '和3 '剪接位点(SS)，灰色为内含子)，cdk12依赖的RNAPII- ctd Ser2磷酸化抑制IPA位点的使用。底部，在CDK12缺失的情况下，RNAPII-CTD Ser2磷酸化降低。IPA位点使用增加，导致截断亚型增加，远端亚型减少。通过下游外显子转录的RNAPII向基因的3 '端聚集，密度不断增加。IPA的使用与其内含子的剪接存在竞争。降低剪接效率或提高裂解和聚腺苷酸活性均可增加IPA的使用量。另外，转录延伸效率的降低可能会改变动力学平衡，有利于IPA的使用。事实上，先前的研究表明，由于聚合酶突变或转录延伸因子的改变，RNAPII较慢的延伸率增加了IPA的使用gydF4y2Ba^{48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba}．所有这三种可能性都与RNAPII Ser2p有关，但尚不清楚cdk12依赖的Ser2p磷酸化如何与这些非互斥的可能性相关。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在cdk12敏感的IPA位点有突变状态的人前列腺癌或卵巢囊腺癌患者的TCGA肿瘤的RNA-seq读取密度gydF4y2Ba自动取款机gydF4y2Ba轨迹(gydF4y2Ba自动取款机gydF4y2Ba异丙醇# 2)。蓝色显示的肿瘤是野生型gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba和二倍体，除非标记为扩增(A)。红色所示的肿瘤携带错误意义的假定驱动突变，截断突变，或浅(SD)或深(DD)基因缺失gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba轨迹。值得注意的是，所有卵巢囊腺癌所携带的肿瘤gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba点突变也有一个浅的缺失gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba除了肿瘤gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba(R882L)错义突变，在基因座上为二倍体。橙色的23个肿瘤包含其他BRCAness基因的假定驱动突变(gydF4y2Ba自动取款机gydF4y2Ba，gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba，gydF4y2BaFANCAgydF4y2Ba,或gydF4y2BaCHEK2gydF4y2Ba)。gydF4y2BabgydF4y2Ba两种不同IPA位点在人体内使用的定量研究gydF4y2Ba自动取款机gydF4y2Ba在IPA网站gydF4y2BaFANCD2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaWRNgydF4y2Ba在人类前列腺和卵巢肿瘤中使用TCGA数据(在本分析中结合)。野生型或放大型肿瘤gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba为蓝色(WT)，其中gydF4y2BaCDK12gydF4y2Ba红色(Mut)基因缺失、错义突变或截断突变，以及5个BRCAness基因中假定的驱动突变(gydF4y2Ba自动取款机gydF4y2Ba，gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBRCA2gydF4y2Ba，gydF4y2BaFANCAgydF4y2Ba,gydF4y2BaCHEK2gydF4y2Ba)。中位数由水平黑条表示，样本量如下所示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值由单边曼-惠特尼法确定gydF4y2BaUgydF4y2Ba测试。gydF4y2BacgydF4y2Ba免疫印迹显示，THZ531治疗4小时对两种前列腺癌细胞系(22RV1和PC-3)和一种高级别浆液性卵巢癌细胞系(OVCAR4)中RNAPII pSer2 (3E10抗体)的影响。总RNAPII (8WG16抗体)，HSP90和Vinculin显示为加载对照。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba， isoforms -specific RT-qPCR用于检测两种前列腺癌细胞株(22RV1和PC-3)和一种高级别浆液性卵巢癌细胞株(OVCAR4)经400 nM THZ531处理4小时后IPA和远端多聚腺苷酸异构体的表达。蓝色柱状(DMSO)和红色柱状(THZ531)代表的平均值(±s.e.m.)gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物重复。gydF4y2BadgydF4y2Ba，测定了4个IPA位点。在人类卵巢和前列腺肿瘤的TCGA数据中发现了三个IPA位点(gydF4y2Ba自动取款机gydF4y2Ba异丙醇# 1,gydF4y2BaFANCD2gydF4y2Ba异丙醇,gydF4y2BaWRNgydF4y2Ba异丙醇;无花果。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 a, bgydF4y2Ba)．在我们的mES细胞中，一个IPA位点对应着一个显著变化的IPA位点gydF4y2BaCdk12gydF4y2BaΔ克隆(APAF1)。gydF4y2BaegydF4y2Ba中基因远端多聚腺苷酸异构体gydF4y2BadgydF4y2Ba．gydF4y2Ba