摘要
遗传不稳定性，即基因突变率的可遗传增加，加速了进化适应1在癌症中广泛存在2，3.．在哺乳动物中，不稳定性可能来自参与DNA代谢和细胞周期调节的基因副本的损坏4或者由一个基因的一个副本失活，其产物数量有限(单倍缺陷)5）;然而，事实证明很难确定这两种机制的相对重要性。在大肠杆菌6，重复的强选择的应用丰富了遗传不稳定性。在这里，我们使用这种方法来进化出芽酵母二倍体细胞的遗传不稳定性酿酒酵母，并且分离的克隆点突变、有丝分裂重组和染色体丢失率增加。我们鉴定了候选的、杂合的、导致不稳定的突变;工程这些突变，作为杂合子，到祖先二倍体菌株导致遗传不稳定。使单倍不足基因的一个拷贝失活的突变比那些主要改变突变基因副本功能的突变更常见。这些突变基因富集了在运输、蛋白质质量控制和DNA代谢中起作用的基因，并揭示了基因不稳定性的新靶点7，8，9，10，11，包括必需基因。尽管我们鉴定的靶点中只有少数(57个基因中有10个同源或密切同源)具有与癌症有关的同源人类基因2，其余的可能是导致人类基因不稳定的原因。为了验证这一假设，我们灭活了近单倍体人类细胞系中的六个样本;其中5个突变增加了不稳定性。我们得出结论，单个遗传事件导致二倍体酵母细胞的遗传不稳定，并提出类似的，杂合突变哺乳动物同源物引发癌症的遗传不稳定。
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数据可用性
作者声明，支持本研究结果的数据可在论文及其补充信息文件中获得。所有图表的源数据均随论文提供(在线)。基因组序列数据(短读格式)已存入NCBI生物项目数据库，登录号为登录号PRJNA509936．
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确认
我们感谢F. Beça, D. Cabrera, B. Neugeboren和C. Pogliano开发试剂并进行初步实验;J. Piper和哈佛大学的BauerCore设施提供技术帮助;G. Wildenberg, J. Koschwanez, N. Wespe和M. Fumasoni寻求技术帮助和讨论;以及j·马托斯的礼物MUS81删除图3c和扩展数据图8中使用的CRISPR细胞系。V. Denic、B. Shraiman、M. Desai、M. Fumasoni和L. Bagamery对手稿发表了评论。M.C.C.获得人类前沿科学计划(HFSP, LT 000694/2014-L)的长期奖学金。R.M.P.是美国亨廷顿舞蹈病协会Berman/Topper家庭HD职业发展奖学金的获得者。这项工作得到了美国国立卫生研究院/NIGMS奖(R01/GM043987)对A.W.M.的支持
审核人信息
自然感谢J. DeGregori, s . Nijman和其他匿名审稿人对本工作的同行评审所作的贡献。
作者信息
作者及隶属关系
贡献
M.C.C.、R.M.P.和A.W.M.设计实验，M.C.C.和R.M.P.执行实验，M.C.C.、R.M.P.和A.W.M.进行数据分析并撰写手稿。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有利益竞争。
额外的信息
出版商的注意:施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。
扩展的数据图形和表格
扩展数据图1遗传不稳定性报告者对引起点突变、重组/截断事件和染色体丢失的扰动作出反应。
一个用三种药剂处理细胞:甲磺酸乙酯(EMS)，一种主要诱导点突变的化学诱变剂;紫外线辐射(UV)，它会引起事件的混合物，和苯甲酰;一种微管解聚药物，主要引起染色体丢失。该图显示了频率URA3从我们祖先的二倍体菌株中失活或丢失。我们显示的全球损失或失活率URA3以及点突变率、有丝分裂重组/染色体截断率和染色体丢失率。b，遗传扰动应用于携带报告结构的二倍体菌株:聚合酶delta (POL3-L523D / POL3)主要诱导点突变，去除RAD27，编码5 '皮瓣内切酶，主要提高有丝分裂重组(rad27∆/rad27∆);和删除MAD2，它编码纺锤体检查点的一个组成部分，导致染色体丢失(mad2∆/mad2∆)。作为对照，失活的单个副本LYS2，使用卡那霉素耐药盒(KanR)不会导致不稳定性增加(lys2∆/LYS2)．该图显示了频率URA3从每一种基因工程菌株中失活或消失。我们显示的全球损失或失活率URA3以及点突变、有丝分裂重组/染色体截断和染色体丢失的比率(n表示每种条件下的生物独立实验，柱状表示均值，误差柱状表示s.e.m.)。箱形图显示中心线(中位数)，上限和下限(四分位数)，胡须为1.5×四分位数间距。数据点= 0没有绘制，但用于确定平均值和s.e.m。
三重选择比单一选择进化出更高水平的遗传不稳定性，许多进化的品系显示出重组和染色体丢失频率的相关增加。
一个，URA3进化无性系抗5-FAA单步选择后的突变频率(n= 18个生物独立样本)，α-AA (n= 29个生物独立样本)，或canavine (CAN，n= 18个生物独立实验)，经过三次连续选择(n= 93个生物独立实验)，通过测试克隆产生对祖先标准化的5FOA抗性的频率(平均值±s.e.m.)进行分析。单个选择步骤不会像三重选择那样产生不稳定性(P值为单方面的学生t-test比较每个单选择对和三个选择对:P5联邦航空局= 0.004,Pαaa= 0.009,P可以= 0.002)。b，重组/截断(RT)与染色体丢失(CL)突变频率的相关性n= 77个突变体，在一类突变事件中没有表现出特定的升高(线性二次回归)。c，三类突变事件发生率与全球突变率的相关性(n点= 51,nRT= 54,nCL= 80个生物独立样本，线性二次回归)。R值，Pearson相关系数。
图3最大遗传不稳定性的减数分裂分离分析。
一个，遗传不稳定性进化的可能场景。在二倍体中，只有当基因的两个等位基因都失活时，隐性突变才会导致遗传不稳定(双命中二倍体)，而显性突变只需要在基因的一个副本中发生(单命中二倍体)，一些突变体需要在两个或多个基因中发生杂合突变(多命中二倍体)。致病突变的数量和性质将反映在减数分裂分离模式，假设突变也导致单倍体的不稳定性。b，在来自不同进化的二倍体无性系的单倍体孢子中，最大程度的遗传不稳定性(以对5FOA抗性的突变频率来衡量)的减数分裂分离。基因不稳定的孢子用洋红色表示。
图4频繁突变基因的杂合缺失影响个体遗传不稳定性类型。
杂合缺失(n= 25)被设计在携带我们的报告结构的祖先菌株(Δ/WT)中，并用于测量不稳定性。一个- - - - - -c，点突变率(一个)、重组/截断(b)和染色体缺失(c)在杂合缺失突变体中。d，杂合缺失菌株的整体和个体不稳定性类型的突变率(∆/+)的基因，其候选遗传不稳定性突变是无义突变，导致截断蛋白的产生，这可能是无功能的。填充圈，其不稳定性超过祖先2 s.d的菌株(n= 3个生物独立实验)。
扩展数据图5单倍体分离体池中突变等位基因频率。
一个， 795个位点同义突变的频率分布，在多个分离子序列池中求和(n= 48个生物独立样本)。95%的同义突变的读取频率小于0.67，允许我们将其定义为假定的致病突变的截止点。只有那些有20个或更多reads的基因座被纳入分析。b，谱系特异性的突变读取频率，遗传不稳定性的假定致病突变(洋红色)。虚线表示截止频率(0.67)，洋红色线表示所识别的74个突变等位基因的平均频率(洋红色框表示±2s.d)。三个基因(RAD1，TCB2,CIN1)的值略低于临界值，也进行了测试，在所有三种情况下，重建表明这些基因的突变增加了遗传不稳定性。
图6祖先二倍体工程致突变对点突变、重组/截断和染色体丢失频率的影响。
通过替换其中一个野生型等位基因(mut/+)，将通过体分离分析鉴定的基因中的假定的致病突变工程到祖先二倍体菌株中作为杂合子，我们的报告结构用于测量与进化克隆相比的不稳定性，以及含有假定致病突变的基因的杂合子缺失(∆/ +)．我们还测试了一个假定的致病突变PAC10这种基因经常发生突变。一个- - - - - -c，点突变率(一个)、重组/截断(b)和染色体缺失(c)．d，将致病杂合等位基因(黑圈)替换为野生型等位基因(绿圈，抢救)的菌株的全球突变率。填充圈，其不稳定性超过祖先2 s.d的菌株(n= 3个生物独立实验)。
扩展数据图7蛋白质质量控制和转运基因作为不稳定性杂合驱动因素的富集。
一个，基因中功能类的频率，我们确定了导致遗传不稳定的突变。概率由二项分布计算，∗∗PBonferroni校正< 0.05,10个假设被检验，∗使用Benjamini-Hochberg程序的错误发现率为2.5%(左，酵母基因组中的频率;没错，我们发现基因突变会导致基因不稳定，n= 92个独立基因)。蓝色代表必需基因的比例，洋红色代表非必需基因的比例。b，我们选择的产生遗传不稳定性的突变的基因之间的重叠(绿色)，与人类癌症基因同源的酵母基因(洋红色)，酵母基因的随机子集(酵母，黑色)，以及先前在酵母筛选中确定的遗传不稳定性的随机选择的基因子集(CIN，灰色)。c- - - - - -f，全球量化(c)，点突变(d)、重组/截断(e)和染色体损失率(f)在具有癌症驱动同源物的酵母遗传不稳定性基因的杂合点突变体或杂合缺失突变体中。四种菌株mut/+重构菌株的数据(MSH2，PAC10，RAD1而且TEL1)．其中五个基因的数据(MSH2，PAC10，SCC2，SNF2而且TOR1)也显示在扩展数据图中。4．填充圆圈c- - - - - -f对应于不稳定性超过祖先2 s.d的菌株(n= 3个生物独立实验)。
扩展数据图8HPRT1HAP1人类细胞携带在酵母进化过程中突变的基因失活同源物，从而引发遗传不稳定性。
一个从酵母进化实验中选择的靶点在人类HAP1细胞中进行了测试，通过使用crispr介导的相应同源物的基因失活。HAP1敲除细胞系用6-TG孵育(HAT培养基处理后消除累积)，定量化菌落形成，并与野生型进行比较。b的失活频率HPRT1，对于不同的同源删除，归一化为野生类型。HAP1 #1和HAP1 #2是亲本野生型;未编辑对应的细胞系经过了转换协议ATG2B编辑中，但未获得突变ATG2B；ATG2B# 1,ATG2B#2没有显示出增加的不稳定性。SMARCA4会增加HPRT1失活频率和被用作我们化验的阳性对照。数值由平均值归一化HPRT1野生型HAP1细胞失活率;填充的圆圈对应于其不稳定性超过祖先2 s.d的菌株。n= 3个生物独立实验)。c，每个测试的细胞系在crispr介导的基因失活后，引导RNA靶序列和基因突变区域的序列(fs，移码;德尔。，deletion; ins., insertion; red, deleted sequence; green, inserted sequence). Corresponding DNA sequences were cloned into p458x-GFP.
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Coelho, m.c.， Pinto, R.M.和Murray, A.W.杂合突变导致癌症进化酵母模型的遗传不稳定性。自然566， 275-278(2019)。https://doi.org/10.1038/s41586-019-0887-y
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一种高通量微流控二倍体酵母长期培养(DYLC)芯片，能够重新定位芽和协调子分离，以确定复制寿命
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