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全合成的大肠杆菌记录的基因组

自然体积569年,页面514 - 518 (2019年)引用这篇文章

主题

文摘

自然使用64密码子编码的蛋白质的合成基因组,并选择1感觉codon-out高达6同义词每个氨基酸编码。同义密码子的选择有不同的重要角色,许多同义替换是有害的。我们表明,密码子的数量用于编码规范化氨基酸可以减少,通过全基因组密码子替换目标定义的同义词。我们创建的一个变体大肠杆菌通过高保真收敛与four-megabase合成基因组合成。我们合成基因组实现定义的重新编码和重构计划简单修正仅七头寸,以取代所有已知的两个密码子和终止密码子的基因组。因此,我们重新编码18214密码子来创建一个有机体61 -基因组密码子;这个生物使用59密码子编码的20种氨基酸,并使之前的删除基本转移核糖核酸。

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图1:合成基因组的设计,实现定义的重新编码方案同义密码子压缩。
图2:Retrosynthesis合成基因组。
图3:创建Syn61记录基因组的组装部分。
图4:功能Syn61同义密码子压缩的结果。

数据可用性

本研究中使用的基因组序列和设计细节是可用的补充数据。补充数据1提供文件的基因库大肠杆菌MDS42基因组(NCBI加入号码AP012306.1);补充数据2提供了设计合成的基因银行文件大肠杆菌基因组密码子替换和重构;补充数据3提供了目标密码子表;补充数据4提供重叠的表和重构;补充数据5提供10 kb的表延伸;补充数据6提供了BAC的基因库文件sacB-cat-rpsL;补充数据7提供文件BAC -基因库rpsL-kanR-sacB;补充数据8提供了BAC的基因库文件rpsL-kanR-pheS∗-HygR;补充数据9提供了表BAC建设;补充数据10提供的表格BAC组装;补充数据11提供了表的雷克斯实验;补充数据12提供的基因库文件间隔质粒反式激活CRISPR RNA (tracrRNA)线性逆电流器和注释;补充数据13为间隔质粒的基因库文件提供tracrRNA线性逆电流器和注释;补充数据14提供了重新编码的表使用的寡核苷酸固定实验;补充数据15提供文件gentamycin-resistance的基因库oriT盒式磁带;补充数据16提供了用于结合的寡核苷酸引物;补充数据17提供了基因库文件pJF146 F′的质粒不self-transfer;补充数据18提供了充分的基因库文件记录Syn61基因组,通过下一代测序验证;补充数据19提供的表格设计优化和非程序突变;补充数据20.提供了一个列表的蛋白质被串联质谱;和补充数据21提供了一个列表的引物用于删除实验。所有其他数据集的生成和/或分析本研究可从相应的作者在合理的请求。所有材料(补充数据9,12,13,17,18)从本研究可从相应的作者在合理的请求。

代码的可用性

代码用于基因组设计是可用的https://github.com/TiongSun/genome_recoding;对测序https://github.com/TiongSun/iSeq;和生成重新编码的风景https://github.com/TiongSun/recoding_landscape。

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确认

这项工作是由英国医学研究理事会(MRC),英国(MC_U105181009和MC_UP_A024_1008)医学研究基金会(mrf - 109 - 0003 - rg -下巴/ C0741)和一个伦理委员会先进格兰特SGCR J.W.C.,Lundbeck公司基础它是一家(r232 - 2016 - 3474)参考J.W.C.感谢h·佩勒姆支持这个项目。我们感谢m . Skehel和lmb实验室label-free-quantification-based蛋白质组学质谱分析服务;n . Barry显微镜;答:脆与Python脚本帮助;和c j . k . Wan l . Dunsmore n, s·h·金Huguenin-Dezot和s . d .油炸实验工作的支持。

审核人信息

自然由于阿布Chatterjee,汤姆·埃利斯和其他匿名审稿人(s)为他们的贡献的同行评审工作。

作者信息

作者指出

  1. 这些作者的贡献同样:Julius Fredens Kaihang Wang丹尼尔de la Torre,路易丝·f·h·凡克,韦斯利·e·罗伯逊

作者和联系

  1. 剑桥大学医学研究委员会分子生物学实验室,,英国

    朱利叶斯Fredens Kaihang王,丹尼尔de la Torre,路易丝·f·h·凡克,韦斯利·e·罗伯逊Yonka Christova, Tiongsun贾,沃尔夫冈•h•Schmied Daniel l . Dunkelmann瓦茨拉夫•贝拉尼克Chayasith Uttamapinant, Andres冈萨雷斯利亚马萨雷斯,托马斯·s·艾略特和杰森·w·下巴

  2. 生物学和生物工程,美国CA,帕萨迪纳市加州理工学院

    Kaihang王

  3. Vidyasirimedhi生物分子科学与工程学院科学与技术研究院(VISTEC)罗永府,泰国

    Chayasith Uttamapinant

作者
  1. 朱利叶斯Fredens
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  2. Kaihang王
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  3. 丹尼尔de la Torre
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  4. 露易丝·f·h·凡克
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  5. 韦斯利·e·罗伯逊
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  6. Yonka Christova
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  7. Tiongsun贾
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  8. 沃尔夫冈·h·Schmied
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  9. Daniel l . Dunkelmann
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  10. 瓦茨拉夫·贝拉尼克
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  11. Chayasith Uttamapinant
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  12. Andres冈萨雷斯利亚马萨雷斯
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  13. 托马斯·s·艾略特
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  14. 杰森·w .下巴
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贡献

K.W.与设计目标基因组序列。教学楼。生成的脚本进行数据分析。所有作者,除了T.S.E.,contributed to assembly of sections. J.F., L.F.H.F., K.W. and A.G.L. led the fixing of deleterious synthetic sequences. J.F., D.d.l.T., L.F.H.F., W.E.R. and Y.C. led the assembly of sections into Syn61 and characterized the strain with the assistance of T.S.E. J.W.C. supervised the project and wrote the paper with the other authors.

相应的作者

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道德声明

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

额外的信息

出版商的注意:施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。

扩展数据数据和表

扩展数据图1使用100 kb的碎片合成基因组DNA替换相应的地区通过雷克斯,并使用《创世纪》逐步替换基因组DNA的合成DNA来生成记录部分。

一个,雷克斯使用CRISPR-Cas9 lambda-red-mediated重组基因组DNA替换为合成DNA提供了从一个游离基因(BAC)。这使得大量的基因组区域(> 100 kb),取而代之的是合成DNA17。黑色的三角形的位置表示CRISPR protospacers,由Cas9解放合成DNA裂解(粉红色)磁带的BAC两侧同源性区域。同源区域1和2项目重组到的位置大肠杆菌基因组。double-selection磁带(−1,+ 1)确保合成DNA的集成,和double-selection磁带(−2 + 2)基因组确保移除相应的野生型的DNA。图中所示的示例中,+ 1kanR−1rpsL,+ 2猫和−2sacB。b雷克斯的迭代周期,交替选择积极的和消极的选择磁带,使《创世纪》17。这使得大部分的合成基因组组装通过迭代的片段,而替换相应的基因组序列,以顺时针方式。的第一个雷克斯100 - kb合成DNA片段留下−1 + 1 double-selection盒式基因组,充当着陆地点下游一体化的第二个片段的合成DNA包含−2 + 2 double-selection录音带。所示的示例中,+ 1kanR−1rpsL,+ 2猫和−2sacB,但可以使用相同的逻辑不同排列的积极的和消极的选择标记基因和BAC。

扩展数据图2重新编码ftsI-murE和地图片段1。

一个1、重新编码景观的片段。雷克斯后我们六个克隆测序。每个点代表的频率重新编码在测序克隆(y轴)目标基因组密码子在指定的位置(x轴)。黑点表示位置,我们没有观察到重新编码。四个基码和重构ftsI-murE,一个密码子地图,被拒绝。b重构的14-bp重叠ftsI和禁闭。密码子和重叠的黄衫军的post-REXER克隆测序的更换频率。使用我们最初的重构方案(1)重构(重叠+ 20基点的上游序列重复),我们没有观察到替代合成DNA的重叠(雷克斯后的六个克隆测序)。重构方案2(2)重构(重复重叠加182个基点的上游序列)导致完整的16本地区的重新编码在12 post-REXER克隆测序。c,测试在Ser4替代密码子地图。double-selection磁带,ph值∗-HygR,介绍了本构EM7启动子上游的地图,紧随其后的是一个ribosome-binding网站。我们取代了磁带使用线性双链DNA介绍替代密码子(紫色bar)在四个位置,通过lambda-red重组损失和消极的选择ph值∗。DNA与AGC和AGT不整合克隆(0/16);我们恢复一个克隆AGC但是测序显示,它包含一个突变AAC (Asn)密码子。TCT(6/8),移行细胞癌(6/16),ACA(6/8)和TTA(4/8)是允许的。d、重新编码景观(紫色)的基因组区域所示一个之后,雷克斯的BAC包含重构方案2ftsI-murE位置重叠和TCT - 4地图。总的来说,2/7 post-REXER克隆完全重构和记录,每个目标密码子取代至少5/7的克隆。的数据一个红色所示进行比较。

扩展数据图3重新编码东和yceQ片段9。

一个9、重新编码景观的片段。我们设计合成的序列片段9被雷克斯整合到基因组,和19个完全被下一代测序克隆测序。重新编码景观图显示每个目标密码子的频率被记录在19克隆。尽管大多数密码子替换被接受,重新编码26-kb地区一直拒绝;密码子的位置重新编码频率为零的测序克隆被黑点表示。查明问题序列,10 kb的基因组(标签G2 G7)被删除的合成片段的游离副本9。合成序列足以支持删除所有延伸除了G4(深灰色盒),这意味着一个潜在的问题是在这。没有19克隆完全记录。b,重新编码伸展G4的景观。雷克斯在10 kb G4拉伸后,10个克隆测序,生成所示的重新编码景观。这显示一个明确的重新编码最低yceQ -预测的基因编码一个蛋白质,几乎没有证据表明转录,蛋白质合成或同系物37。所有目标密码子yceQ在个人至少记录一次克隆,但从来没有同时;因此,重新编码的最小景观不会达到零,和0/10克隆完全记录。这是符合目标位置之间的上位。下面的地图重新编码景观,序列标注为基本深灰色和目标基码所示所示红色。序列位置(x轴)是参照一个。c周围的地区,改变设计东片段9。,最初的设计yceQ重新编码和东(编码核糖核酸酶E)监管序列。目标基码所示红色。P1rne, P2rne P3rne的推动者(蓝色箭头)是至关重要的基因东;这些发现是在假想的基因yceQ。10−序列的主要发起人P1rne突变是我们最初的设计。序列包含了发夹1 (hp1)和发夹2 (hp2),这与核糖核酸酶结合E调解记录退化,显示为蓝色酒吧;这些序列包含其余目标密码子和也变异了我们最初的设计。底,第二个密码子yceQ取而代之的是一个终止密码子(紫色),其余目标密码子保留原来的序列。序列位置(x轴)是参照一个。d,修改后的片段(从9c)整合在基因组,这导致在4/5完成重新编码克隆测序。图的轴是一样的一个。修改的重新编码风景片段9,来自五克隆测序,紫色所示。的数据一个是比较的复制。

扩展数据图4重新编码yaaY在片段37。

一个,重新编码片段37的景观。我们设计合成的序列片段37被雷克斯整合到基因组,和六个完全被下一代测序克隆测序。尽管大多数密码子替换被接受,重新编码6.5 kb的地区一直拒绝。Target-codon立场从未记录的6个克隆测序由黑点表示。b,密码子识别问题的目标。在确定6.5 kb有问题的地区,我们首先关注重要基因的密码子(深灰色箭头)而不是不必要的基因(浅灰色箭头)。桑格24克隆测序(黑条)显示,2克隆被记录在所有6目标必需基因的密码子在一个小节。进一步Sanger测序的目标在这两个克隆重要基因的密码子透露,1克隆记录在所有17个密码子目标。这完全克隆测序下一代测序和用于生成一个重新编码景观,在每个目标密码子是记录(红色)记录(黑色)。结合景观的重新编码一个,这使我们能够确定一个问题的上游地区1.8 kbribF。在这里,我们专注于四个目标基因的密码子rpsT和yaaY最近的密码子的必不可少的ribF基因。桑格的33个克隆测序序列只有1密码子透露,从来没有假设Ser70 recoded-the密码子的基因yaaY(测序结果显示为彩色编码的基因图谱基于和yaaY)。因此,我们研究了替代密码子替换yaaY。c,替代假设基因密码子替换yaaY。在这个基因的位置Ser70,更换柠檬酸与AGT并不成功。探讨替代密码子替换方案,double-selection标记(ph值∗-HygR)本构EM7启动子,紧随其后的是一个ribosome-binding网站,被引入yaaY12英国石油公司上游Ser70密码子的。消极的选择标记被用来选择克隆已经取代了磁带使用线性双链DNA介绍替代密码子(紫色bar)在70年的位置,通过lambda-red重组。虽然线性双链DNA与AGT没有整合克隆(0/16),集成的双链DNA移行细胞癌(2/16),公布(2/16),TCT(6/16)和AGC(9/16)被证明是可行的。d后,重新编码景观雷克斯的BAC包含片段37的修正版本,轴承AGC在位置Ser70假想的基因yaaY(紫色)。当集成到雷克斯,我们确认1/7完全记录克隆。在位置Ser70 AGCyaaY介绍了4/7的克隆。

扩展数据图5假设基因替换yceQ与监管元素重叠东。

一个,在我们的原始设计,柠檬酸(蓝色)的程序替换AGT(红色)的假想的基因yceQ导致突变的10−P1rne启动子区域(盒装)。启动子的转录起始站点(tss)东转录是由箭头表示;这是主要发起人东转录。b,Target-codon替换重叠,可能扰乱关键监管发夹(hp2和hp3)的5′端非翻译区东成绩单。hp2 hp3协调监管反馈回路,核糖核酸酶E的招募的信使rna,促进退化自己的成绩单。野生型的二级结构的示意图东显示5′端非翻译区40。同义替换的目标密码子是用蓝色突出显示。

完成部分扩展数据图6 A, B和H。

一个,《创世纪》发起的片段4进展顺利,直到片段9,我们无法重新编码yceQ。识别和修复的问题我们最初设计的片段进行了9所述扩展数据图。3,通过引入一个终止密码子(黄线)的预测yceQ羊痘疮。在交换的sacB-cat(sC) double-selection盒式片段9月底ph值∗-HygR(pH)双重选择磁带,这一毒株准备作为结合组装的接收者的应变碎片42 (a + B)部分节完全记录。同时,我们继续重新编码的应变包含不完整的片段的记录片段4 9《创世纪》;这个生成的第二个应变组装碎片4 - 8和10 - 13被完全记录,和片段9部分记录。然后我们集成oriT(白色三角形)3 kb上游的片段开始10第二应变为结合生成一个捐赠者,组装一个应变碎片42 (a + B)部分节完全记录。接合的供体和受体菌株导致的应变部分a和B是完全记录。rK,rpsL-kanRdouble-selection录音带。b、个人雷克斯的碎片37和1导致不完整的重新编码。我们进行故障诊断的独立片段(扩展数据无花果。2,4)。黄色和紫色线的维修表示片段37和片段1,分别。然后每个应变作为起点两组独立的起源;生成一个37 a-37b(左边)和结束rpsL-kanRdouble-selection盒,一个生成1 - 3(右边)和结束sacB-catdouble-selection录音带。我们集成一个oriT(白色三角形)3 kb上游的片段1,这株作为捐赠者直接接合的37 a-37b 1 - 3。获得正确的产品被选中的猫的损失rpsL。这导致部分的完成H在单一菌株。

扩展数据图7的有机体通过接合与全合成基因组的记录基因组部分。

一个示意图组装部分合成的供体和受体基因组合成基因组,通过接合。在受体细胞中,记录基因组部分(粉红色)扩展记录DNA(深粉红色)一般3 - 4 kb-by lambda-red-mediated重组和积极的和消极的选择;这一步利用基因标记的最后记录序列所推出的《创世纪》,并提供一个相同地区的记录片段供体菌株。供体菌株由集成的oriT结束时记录的DNA。表示积极的和消极的选择保证了接受者的生存压力,并选择的收件人已经成功地集成的合成DNA供体。F′质粒中包含一个突变oriT序列,使得同一个厂家被用来促进供体基因组的受体的结合。+ 2,猫;−2,sacB;+ 3,HygR;−3,ph值∗;+ 4,aacC1(一个基因赋予耐庆大霉素);+ 5,tetA(授予四环素抗性基因)。同源区域所示的捐赠者和接受者都是暗粉色。b(粉色)、合成基因组部分从多个个人部分记录基因组组装成一个完全使用共轭组装基因组记录。供体(d)和接受者(r)菌株基因组部分包含独特的记录标签在粉色;记录重叠的同源区域(3 kb到400 kb大小)是用于无缝地重组菌株,并深粉红色所示。小同源区域从3到5 kb大小的标有星号。结合我们使用大于5 kb同源性(人力资源)表示。装配,记录从供体基因组内容是共轭以顺时针方式来代替相应的野生型基因部分(灰色)收件人。应变的起源AB和应变H是详细描述扩展数据图。6;所有其他个人合成基因组是由创世纪(扩展数据图。1)。结合之后,重组开始,直到最后的完全记录a -应变被下一代测序组装和sequence-verified。

扩展数据图8描述完全合成基因组的有机体。

一个,Syn61和MDS42翻倍。我们完全合成记录大肠杆菌Syn61倍增时间是1.6×MDS42超过32,当生长在标准介质条件(90.1分钟和57.6分钟在溶原性肉汤(磅)+ 2%葡萄糖)。增长率之间的比率Syn61和MDS42磅(减少碳降解物阻遏)37°C是1.7,在M9基本培养基是1.7,在丰富的媒介(2 xty)是1.4,在25°C是2.5磅,在42磅1.3°C。不同介质条件下的翻倍:磅在37°C, 58.3分钟,100.6分;磅+ 2%葡萄糖,57.6分钟,90.1分;M9基本培养基,130.5分钟,221.1分;2 xty, 68.2分钟,92.6分;磅25°C, 86.3分钟,218.4分;磅在42°C, 77.4分钟,99.7分,分别为MDS42和Syn61。Syn61含有质粒没有(−)或(+)服务公司表现出比增长率为0.99(138.3分钟和136.2分钟)。翻倍代表十个独立的平均生长的生物复制每个应变,和显示为意味着南达科他州±。(见补充方法)。个人实验是由点的数据。b,代表的显微镜图像大肠杆菌应变MDS42 Syn61。样本成像一个直立的蔡司Axiophot相差显微镜使用63×1.25 NA计划Neofluar阶段目标(见补充方法)。实验进行了两次类似的结果。c从显微镜的图像,细胞长度的直方图量化菌株MDS42 Syn61。平均细胞长度MDS42南达科他州(±)为1.97±0.57μm和Syn61μm为2.3±0.74。的图片n= 500个细胞被病毒株在指数增长阶段。Cell-length测量软件使用尼康NIS元素(见补充方法)。低1-μm大小限制了去除背景微粒从量化和灰尘;这也排除了量化的细胞外囊泡。d,Label-free量化MDS42 Syn61蛋白质组。每一株生长在三个生物复制。每个生物复制被串联质谱分析技术复制。技术复制生物复制合并。共有1084个蛋白质是量化样本。没有蛋白质量化MDS42和Syn61不同label-free abundance-as判断的量化值,超过1.16倍。

扩展数据图9 Syn61同义密码子压缩的结果。

一个,同义密码子的压缩和删除prfA,塞鲁船长和泽特在大肠杆菌。灰色框显示了大肠杆菌丝氨酸密码子,停止密码子,一起转运rna和释放的因素在野生型解码它们大肠杆菌(WT基因组)。tRNA反密码子和释放的因素是连接到基码,他们预计通过黑色线条。tRNA和释放因子基因黑匣子所示。同义密码子压缩(syn.密码子。comp)导致Syn61细胞记录基因组(粉红色框),在TCG和柠檬酸基码删除。丰富的每一个密码子中列出它的盒子。b,如无花果。4 b,但m . mazeiPylRS / tRNA所有供试佐治亚大学对(反密码子佐治亚大学)。有更少的同源基码反密码子在Syn61 MDS42;CYPK还可能因此会更少有毒Syn61,观察。c,如无花果。4 b,但m . mazeiPylRS / tRNA所有供试GCU部件对(反密码子GCU部件)。有更多的同源基码反密码子在Syn61 MDS42;CYPK还可能因此将更多的有毒Syn61,观察。d,泽特(深灰色)被插入删除ph值∗-HygR通过lambda-red-mediated复合double-selection盒(黑)。复合收益率新连接1和2所示绿色和蓝色酒吧。对于每个复合,路口都sequence-verified Sanger测序。以上桑格色谱图,箭头表示结的精确位置,蓝色栏表明序列对应于选择磁带和绿色栏对应的基因组序列侧翼选择磁带。引物用于生成选择磁带与合适的同源性塞鲁船长,泽特和prfA重组提供了补充数据21。实验被执行一次。e,prfA(深灰色)的插入删除rpsL-kanRdouble-selection盒(黑)通过lambda-red-mediated同源重组。琼脂糖凝胶的注解为图中描述。4摄氏度和其余的数据作为描述的注释d。实验被执行一次。f,塞鲁船长(深灰色)被插入删除ph值∗-HygR通过lambda-red-mediated复合double-selection磁带(黑色)。琼脂糖凝胶的注解为图中描述。4摄氏度和其余的数据作为描述的注释d。实验被执行一次。完整的凝胶可在补充图。1。

扩展数据图10基因组合成的规模,和重新编码的规模和忠诚。

一个基因和染色体的合成。合成基因组的大小(Mb),已经产生了尿道支原体和m . mycoides22,23和一些酿酒酵母染色体24,25,26,27,28,29日,30.,31日(浅灰色)。合成的大小大肠杆菌这里介绍基因组深灰色所示。b,基因组重新编码工作。尝试重新编码目标密码子TTA和TTG在沙门氏菌血清型沙门氏菌感染LT218;AGC、AGT TTG TTA, AGA, gg和标记大肠杆菌19;AGA和gg大肠杆菌16,以及所有标签的重新编码大肠杆菌14(浅灰色),删除所有的柠檬酸,相比TCG和标签大肠杆菌这里介绍(深灰色)。密码子的总数记录显示在单个应变图,和最大比例的目标基码记录在每个努力表示在一个单一的应变。c的报道,非程序突变和indels作为目标的数量的函数基码所示的实验记录b。

补充信息

补充信息

这个文件包含补充方法,补充引用和补充图1。补充图1显示了完整的凝胶与相应的图面板。分子尺寸标准注释和面积相关图所示所示白色的轮廓。

报告总结

补充数据

这个压缩文件包含补充数据集21和补充数据指南。

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Fredens, J。王,K。,dela Torre, D.et al。全合成的大肠杆菌记录的基因组。自然569年,514 - 518 (2019)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 019 - 1192 - 5

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