利用DNA折纸转子进行基因组加工酶的旋转跟踪gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，两条160nm臂组成的折纸转子走线图(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.完整的臂(六螺旋束)穿过正交臂(两个半长六螺旋束)的断裂。附加的螺旋稳定结。其中两个螺旋包含从转子中心延伸的短纤维(黑色)(延伸未显示;看到gydF4y2BacgydF4y2Ba）.在完整臂末端14 nm内的6个订针(浅绿色)在其3 '端标记Cy3。gydF4y2BabgydF4y2Ba、转子设计的三维效果图。gydF4y2BacgydF4y2Ba放大图显示两条短链(红色)从转子中心延伸，形成一个14bp的dsDNA片段和一个12nt的ssDNA悬垂用于结扎。gydF4y2BadgydF4y2Ba突出部分连接到较长的dsDNA片段，后者作为dna相互作用酶的底物。gydF4y2BaegydF4y2Ba原子力显微镜图像与大视野的折纸转子。代表了十多个独立的生物重复。标尺:1 μm。gydF4y2BafgydF4y2Ba，由三个20nm翅膀组成的折纸锚的路线图，每个翅膀由一个短的6螺旋束基序组成(补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.一些短纤维链被延长了与生物素标记的次级低聚物的结合位点，用于表面附着。从结构的中心，三股(黑色)被用来制作适配器，以便连接额外的DNA。在最后的链交叉之后，接头由26 bp的双链dna和一个12 nt的双链dna悬垂组成。gydF4y2BaggydF4y2Ba，折纸锚的三维效果图。gydF4y2BahgydF4y2Ba，用于表征布朗动力学的折纸结构。将折纸转子、锚和dsDNA片段(根据需要)连接在一起。折纸锚通过多个生物素标签附着在显微镜表面。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，折纸锚的代表性透射电镜图像。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，功率谱显示了52bp dsDNA附着在锚点上的转子角位置的布朗波动。3个独立生物重复的代表性。红线表示修改后的洛伦兹拟合，如gydF4y2Ba补充讨论gydF4y2Ba，补充式(1)。这种拟合得到的扭转刚度为gydF4y2BaκgydF4y2Ba)和水动力阻力(gydF4y2BaγgydF4y2Ba）.gydF4y2BabgydF4y2Ba的逆的依赖关系gydF4y2BaκgydF4y2Ba在转子和折纸之间的dsDNA片段的长度。线性拟合的斜率在没有施加力的情况下产生dsDNA单位长度的扭转刚度(补充讨论，补充方程(3))。gydF4y2BaCgydF4y2Ba= 200±10 pN nmgydF4y2Ba^2gydF4y2BaradgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，这与之前在零力下的测量结果一致gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。的倒数gydF4y2BaygydF4y2Ba-从这个匹配中抵消，gydF4y2BaκgydF4y2Ba_{其他gydF4y2Ba}= 30±8 pN nm radgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(补充讨论，补充方程(3))，表示结构剩余部分的扭转刚度，相当于约20bp的dsDNA。gydF4y2BacgydF4y2Ba，弛豫时间的依赖性，gydF4y2BaτgydF4y2Ba=gydF4y2BaγgydF4y2Ba/gydF4y2BaκgydF4y2Ba，对转子和锚之间的dsDNA段的长度进行计算gydF4y2BaκgydF4y2Ba和gydF4y2BaγgydF4y2Ba由功率谱拟合(gydF4y2Ba补充讨论，补充方程(1)gydF4y2Ba）.数据gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba平均值±S.E.M. (gydF4y2BangydF4y2Ba= 203, 195和133(从左至右)，来自3个独立的生物重复。gydF4y2BadgydF4y2Ba的依赖性gydF4y2BaγgydF4y2Ba折纸转子对缓冲液粘度的影响。折纸转子通过一个92-bp的dsDNA片段连接到锚点。使用0%、10%和25%的甘油可获得不同的粘度。数据为平均值±s.e.m。(gydF4y2BangydF4y2Ba= 195, 210和150(从左到右)，来自3个独立的生物重复。gydF4y2BaegydF4y2Ba，转子角位置的标准差作为积分时间的函数。黑线显示了在降采样到指定的积分时间后，从连接到锚的单个转子测量到的sd，该转子具有以3 kHz跟踪的52 bp dsDNA片段。3个独立生物重复的代表性。红色和蓝色曲线分别表示考虑了定位不确定性(gydF4y2Ba补充讨论，补充方程(2)gydF4y2Ba）.gydF4y2BaκgydF4y2Ba= 7.8 pN nm radgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，gydF4y2BaγgydF4y2Ba= 5.0 fN nm s，每帧定位不确定度gydF4y2Ba\({\σ}_ {L} ^ {2} \)gydF4y2Ba= 0.038 radgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。gydF4y2BaκgydF4y2Ba和gydF4y2BaγgydF4y2Ba是由多个(gydF4y2BangydF4y2Ba= 203)转子，52-bp dsDNA片段将转子连接到锚点。gydF4y2Ba\({\σ}_ {L} ^ {2} \)gydF4y2Ba利用径向位置的测量不确定度进行估计，并利用圆形轨迹的半径转换为角度值。顶部和底部虚线与sd与积分时间曲线的交叉点分别给出了检测单碱基对旋转(34.6°)所需的积分时间，信噪比分别为1和3。gydF4y2BafgydF4y2Ba径向定位不确定性(s.d)与单个转子平均荧光信号强度(平均值)的函数关系。3个独立生物重复的代表性。我们采用16 nm(0.1像素)的定位不确定性阈值，如图所示为红色，以选择具有相对较高定位精度的轨迹。所有的测量都用0%甘油进行，除了gydF4y2BadgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，不同ATP浓度(溶液pH 8)下单个分子平均解绕速率直方图:15 μM ATP (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)， 25 μm atp (gydF4y2BabgydF4y2Ba)， 50 μm atp (gydF4y2BacgydF4y2Ba)， 75 μm atp (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， 150 μm atp (gydF4y2BaegydF4y2Ba)和300 μM ATP (gydF4y2BafgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba平均解绕速率作为ATP浓度的函数符合Michaelis-Menten依赖性gydF4y2BavgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}= 290±10 bp sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= 130±10 μm。数据为平均值±s.e.m。(gydF4y2BangydF4y2Ba= 47、94、80、37和110(从左到右)，每种条件下至少有3个独立的生物复制轨迹)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， ATP浓度对暂停频率的依赖性。暂停频率确定为每个单分子轨迹每秒暂停的平均次数。数据为平均值±s.e.m。(gydF4y2BangydF4y2Ba= 47、94、80、37和110(从左到右)轨迹，每种条件下至少有3个独立的生物重复)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，在不同浓度的ATP下，正向解绕过程中停顿的中位数持续时间。误差条为重采样(gydF4y2BangydF4y2Ba= 76, 62, 27和18(从左到右)事件，每种条件下至少有3个独立的生物重复)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，不同ATP浓度下的平均回溯距离。数据为平均值±s.e.m。(gydF4y2BangydF4y2Ba= 20、22、16和10(从左到右)事件，每种条件下至少有3个独立的生物重复)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在不同浓度的ATP下，回溯事件后的中位数恢复暂停时间。误差条是重采样得到的中位数的标准差。的gydF4y2BaPgydF4y2Ba25 μ m - atp数据点与50、75和300 μ m - atp数据点的差值分别为0.05、0.004和0.09，由暂停持续时间分布的双侧Kolmogorov-Smirnov检验得出(gydF4y2BangydF4y2Ba= 20、22、16和10，分别对应25、50、75和300 μM数据点)。注意，并非所有轨迹都包含回溯事件。数据在10%甘油，溶液pH值6500 Hz下获得。gydF4y2BafgydF4y2BaRecBCD诱导DNA解绕动力学模型示意图。在DNA解绕过程中，暂停频繁发生，一些暂停导致酶回溯;酶可以退出回溯状态，并通过恢复暂停中间体恢复DNA解绕，这与初始暂停状态不同。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，停流实验DNA底物的设计gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。A链上的Cy3最初被b链上的Cy5猝灭，RecBCD活性导致A链解离，导致荧光增加。左侧的发夹(链C)确保活动只能从右侧开始。gydF4y2BabgydF4y2Ba、双混停流实验设计。在与ATP和肝素混合之前，将RecBCD和DNA在延迟环路中混合200 ms，以防止单次翻转后RecBCD - DNA的额外结合。gydF4y2BacgydF4y2Ba在ATP为50 μM，溶液pH为8,10%甘油条件下，A链为26 bp(黑色)或52 bp(绿色)的钝端底物上的停流荧光测量。具有至少3个独立生物重复的代表性。两个样品的A链长度之差与测量到的两个样品的半上升时间之差之比可以估计出解绕速率约为100 bp sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}假设这两种底物的起始动力学没有不同(因为它们在双链断裂处具有相同的几何形状和序列)。这个解绕速率相当于85 bp / sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}我们的单分子ORBIT测量在相同浓度的ATP下确定的值。gydF4y2Ba

图的复制gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba，但将起始期持续时间的单个数据点叠加为点图。柱状图统计如图所示。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba。注意，由于动力学转变的随机性，起爆期持续时间的分布预期为长尾指数型分布。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba例如，钝端DNA底物和6-nt 3 '或10-nt 5 '悬垂DNA底物的起始轨迹。具有至少3个独立生物重复的代表性。绿色和品红的颜色编码如图所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2BabgydF4y2Ba，钝端底物和6-nt 3 '或10-nt 5 '悬垂底物起始阶段的平均持续时间(从底物结合到过程解绕的总时间)。绿色和品红部分分别表示绿色和品红状态下的平均累积停留时间。误差条为s.e.m。(gydF4y2BangydF4y2Ba= 80, 44和85(从左到右)至少3个独立生物复制的轨迹)。起始期持续时间的单个数据点被叠加为点图。在300 μM ATP，溶液pH 8, 10%甘油，500 Hz条件下采集数据。gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaDNA底物的设计为停止流动实验，如扩展数据图所示。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba，除了添加3 '或5 ' ssDNA悬垂(虚线)，以制备具有悬垂的相应底物。gydF4y2BabgydF4y2Ba对钝端底物和6-nt 3 '或10-nt 5 '悬垂底物的停流荧光测量显示，具有5 '悬垂的底物动力学较慢。gydF4y2BacgydF4y2Ba对10-nt 5′悬垂底物或10-nt 5′悬垂底物的停流荧光测量，初始5个碱基对中G-C对转化为A-T。gydF4y2BadgydF4y2Ba基于单分子数据(在溶液pH值为8时收集)得出的起始和解卷速率预测的集合时间过程(红线)与在几种pH值下钝端底物上测量的停止流动时间过程(彩色符号)的比较。为了模拟没有拟合参数的集合时间过程，我们使用我们从单分子数据中测量的起始速率将起始过程建模为单个指数过程，并将unwind建模为一系列1 bp的unwind步骤，其中模拟中的每个分子的unwind速率来自我们从单分子数据中实验测量的unwind速率分布。正如预期的那样，由于二氧化硅复盖表面带电(导致局部pH值漂移约2个单位;看到gydF4y2Ba补充讨论gydF4y2Ba)，在溶液pH为8(表面pH为6)时，单分子实验测量的起始和解绕速率预测曲线与pH为6时测量的停止流动数据相匹配。gydF4y2BaegydF4y2BapH值为6时钝端底物的停止流动数据(红色符号)与从溶液pH值为8(表面pH值为6)的单分子数据中获得的起始和解绕速率(红色)或仅从解绕速率(黑线)预测的时间过程的比较。因此，需要在模拟中包含起始相以匹配实验结果。gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2BapH值为6时的停流数据(彩色符号)的比较见gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba利用从溶液pH为8(表面pH为6)的单分子数据得出的起始和解绕速率来预测集合时间过程(颜色匹配的线)，如下所述gydF4y2BadgydF4y2Ba。所有停流实验均在50 μM ATP、10%甘油、pH 6条件下进行gydF4y2BadgydF4y2Ba，其中pH值在图例中表示)，并且每种条件下至少代表3个单独的实验。相同颜色的图是相同数据集的副本，放置在不同的面板中，用于比较。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在50 μM ATP，溶液pH 6, 10%甘油，500 Hz下记录的单分子轨迹显示RecBCD在钝端底物上引发。任意垂直偏移应用于不同的轨迹显示目的。虚线框中的区域放大如下，其中缠绕和未缠绕的角度状态分别用品红和绿色标记。gydF4y2BabgydF4y2Ba在相同条件下，单分子底物在6-nt 3 '或10-nt 5 '悬垂的底物上显示RecBCD起始。虚线框划定的区域在插图中被放大。数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba至少代表3个独立的生物重复。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，溶液pH为6时，钝端底物和3′或5′悬垂底物的起始期平均持续时间(从底物结合到过程解绕的总时间)(gydF4y2BacgydF4y2Ba)及溶液pH值7 (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， 50 μM ATP, 10%甘油。绿色和品红部分分别表示在绿色和品红状态下的累积停留时间。误差条为s.e.m。(gydF4y2BangydF4y2Ba= 40, 27和44(从左到右)的轨迹gydF4y2BacgydF4y2Ba；gydF4y2BangydF4y2Ba= 149, 154和108(从左到右)的轨迹gydF4y2BadgydF4y2Ba(每种条件下至少3个独立的生物重复)。起始期持续时间的单个数据点被叠加为点图。gydF4y2Ba

从rnap诱导DNA旋转的单分子轨迹的隐马尔可夫模型分析得到前向步长(>5°)的全概率分布。在这里，使用单个单分子轨迹中检测到的所有步长概率来构建直方图(而不是使用每个轨迹的最可能步长，如图所示)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba