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诱导和利用肝癌治疗的薄弱环节gydF4y2Ba

自然gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba574gydF4y2Ba，gydF4y2Ba页面gydF4y2Ba268 - 272 (gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用本文gydF4y2Ba

主题gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

肝癌仍然难以治疗，因为缺乏针对关键依赖的药物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；广谱激酶抑制剂如索拉非尼对肝细胞癌患者的疗效有限gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．诱导衰老可能代表了一种治疗癌症的策略，特别是当与选择性消除衰老癌细胞的第二种药物(senolysis)联合使用时。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．在这里，我们使用以kinome为焦点的遗传筛选，表明对dna复制激酶CDC7的药理学抑制可选择性地诱导具有突变的肝癌细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba．后续的化学筛查发现抗抑郁药舍曲林是一种可以杀死因CDC7抑制而衰老的肝细胞癌细胞的药物。舍曲林抑制了mTOR信号通路，靶向该通路的选择性药物对用CDC7抑制剂治疗的肝细胞癌细胞的凋亡死亡非常有效。mTOR信号抑制后的反馈再激活gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在用CDC7抑制剂处理过的细胞中被阻断，这导致mTOR的持续抑制和细胞死亡。通过使用多个肝癌小鼠体内模型，我们发现联合抑制CDC7和mTOR的治疗可显著降低肿瘤生长。我们的数据表明，利用诱导的脆弱性可能是肝癌的有效治疗方法。gydF4y2Ba

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图1:两步筛选确定CDC7为肝癌衰老诱导策略的靶点。gydF4y2Ba
图2:抑制CDC7选择性诱导肝癌细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba
图3:AZD8055选择性触发xl413诱导的衰老细胞凋亡。gydF4y2Ba
图4:在多个肝癌模型中，CDC7抑制诱导体内衰老，并与mTOR抑制联合抑制肿瘤生长。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

来自样本的下一代RNA测序的原始和处理数据已保存在NCBI基因表达Omnibus (GEO)中，注册号为登录号gydF4y2BaGSE121276gydF4y2Ba和gydF4y2BaGSE121277gydF4y2Ba．所有其他数据可在源数据、补充信息中找到，或根据合理要求可从相应作者处获得。gydF4y2Ba

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    文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

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下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢L. Zender, R. Smits, X. Qiao和L. Li的细胞株礼物。这项工作由欧洲研究委员会(ERC 787925授予R.B.)，荷兰癌症协会(KWF 12049/2018-2授予洛杉矶，6702/2014授予B.B.和H.t.R)通过Oncode研究所和癌症基因组学中心(CGC:gydF4y2Bahttp://cancergenomics.nlgydF4y2Ba)、国家基础研究发展计划(973计划:2015CB553905)、国家传染病重点科技专项(2018ZX10732202-002-003)、国家自然科学基金(81920108025、81421001、81672933、81874229)、上海市教委高峰临床医学基金(20181703)、上海市卫生计生委(2017YQ064、2018YQ20)、上海市明日之星计划(18QA1403900)。我们感谢荷兰癌症研究所的设施:动物实验室，小鼠临床成像单元，实验动物病理学，流式细胞仪，测序和生物成像。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

  1. 这些作者贡献均等:王村，Serena Vegna，金浩杰，Bente BenedictgydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

  1. 致癌基因及相关基因国家重点实验室，上海交通大学医学院仁济医院，上海癌症研究所，中国上海gydF4y2Ba

    王村，金浩杰，秦文欣gydF4y2Ba

  2. 荷兰癌症研究所分子癌变部Oncode研究所，阿姆斯特丹，荷兰gydF4y2Ba

    王存，金豪杰，Cor Lieftink, Rodrigo Leite de Oliveira, Ben Morris, Aimée du Chatinier，王丽琴，Bastiaan Evers，郑雪，Arnout Schepers, Fleur Jochems, Antonio Mulero Sanchez, Sara Mainardi, Roderick L. Beijersbergen和René BernardsgydF4y2Ba

  3. 荷兰癌症研究所肿瘤生物学和免疫学分部Oncode研究所，荷兰阿姆斯特丹gydF4y2Ba

    Serena vevena, Bente Benedict, Christel Ramirez, Jules gadoot, Hein te Riele和Leila AkkarigydF4y2Ba

  4. 细胞生物学分部，荷兰癌症研究所，阿姆斯特丹，荷兰gydF4y2Ba

    魏王gydF4y2Ba

  5. 复旦大学附属中山医院肝癌研究所，肿瘤发生与肿瘤侵袭教育部重点实验室，上海gydF4y2Ba

    Dongmei高gydF4y2Ba

  6. 中国上海第二军医大学附属东方肝胆外科病理科gydF4y2Ba

    Guangzhi金gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 王村gydF4y2Ba
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  2. 瑟瑞娜VegnagydF4y2Ba
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  3. Haojie金gydF4y2Ba
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  4. Bente本尼迪克特gydF4y2Ba
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  5. 软木LieftinkgydF4y2Ba
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  6. Christel拉米雷斯gydF4y2Ba
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  7. Rodrigo Leite de OliveiragydF4y2Ba
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  8. 本•莫里斯gydF4y2Ba
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  9. 朱尔斯GadiotgydF4y2Ba
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  10. 魏王gydF4y2Ba
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  11. Aimée杜查蒂耶gydF4y2Ba
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  12. Liqin王gydF4y2Ba
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  13. Dongmei高gydF4y2Ba
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  14. Bastiaan埃弗斯gydF4y2Ba
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  15. Guangzhi金gydF4y2Ba
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  16. 郑薛gydF4y2Ba
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  17. Arnout斯奇gydF4y2Ba
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  18. 弗勒JochemsgydF4y2Ba
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  19. 安东尼奥·穆雷罗·桑切斯gydF4y2Ba
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  20. 莎拉曼拉德gydF4y2Ba
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  21. Hein te RielegydF4y2Ba
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  22. Roderick L. BeijersbergengydF4y2Ba
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  23. 杨伟鑫秦gydF4y2Ba
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  24. 莱拉AkkarigydF4y2Ba
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  25. 雷内·伯纳德gydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba

C.W.和R.B.构想了这个想法并设计了这项研究。r。b。洛。a。w。q。和r。l。b。监督所有研究。r.b.， l.a.， C.W.和S.V.撰写了手稿并准备了数据。C.W.设计、执行和分析了体外实验，并解释了异种移植模型的结果。在J.G. H.J.和D.G.的技术支持下，S.V.设计、执行和分析了具有免疫能力的小鼠模型的体内数据，并进行了异种移植实验。B.B.设计、执行和分析中性彗星实验。C.L.和B.E.进行数据分析。C.R.进行体内染色定量分析。B.M.进行gpcr -复合物筛选。W.W.进行免疫荧光。 A.d.C. and A.M.S. performed and analysed SHP2 experiments. G.J. provided clinical samples. R.L.d.O., L.W., Z.X., A.S., F.J., S.M. and H.t.R. provided advice for the project. All authors commented on the manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba杨伟鑫秦gydF4y2Ba，gydF4y2Ba莱拉AkkarigydF4y2Ba或gydF4y2Ba雷内·伯纳德gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

C.W.和R.B.被列为一项专利申请的发明人，该专利申请使用CDC7抑制剂和mTOR抑制剂治疗肝癌gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变。R.B.是Oncosence公司的创始人，该公司利用促衰老疗法治疗癌症。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba感谢Hisao Masai和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba

扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba

扩展数据图1gydF4y2BaCDC7gydF4y2BamRNA与HCC患者不良预后相关gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba敲低使野生型肝癌细胞敏感gydF4y2BaTP53gydF4y2BaCDC7抑制剂。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在Hep3B和Huh7细胞中，通过CRISPR筛选鉴定出38个常见命中(在每个细胞系中消耗最强的前50个命中中)。红色表示小分子化合物可靶向的因子。蓝色代表非目标命中。gydF4y2BabgydF4y2BaWestern blot分析非转化细胞系和肝癌细胞系中CDC7、MCM2和磷酸化MCM2的水平。HSP90作为加载控制。gydF4y2BacgydF4y2Ba免疫组化分析显示，与配对的相邻非肿瘤组织相比，HCC组织中CDC7的表达增加。gydF4y2BadgydF4y2Ba，根据的水平gydF4y2BaCDC7gydF4y2Ba从TCGA数据库(gydF4y2BangydF4y2Ba= 365例)，将HCC患者分为3组:前33.3%为高表达，中33.3%为中表达，最低33.3%为低表达。Kaplan-Meier曲线描述了gydF4y2BaCDC7gydF4y2BamRNA与HCC患者不良预后相关。采用双侧对数秩检验计算统计显著性。gydF4y2BaegydF4y2Ba，野生型肝癌细胞系gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(SK-Hep1和Huh6)通过对照pLKO载体或三个独立的靶向shrna之一稳定地转导gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(这里标记为shp53 #1， #2和#3)。基于打倒效率，gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba成分不。1,gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba成分不。其中3个被选作进一步实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba表达对照shRNA (pLKO)或敲除的SK-Hep1和Huh6细胞gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(shp53)在菌落形成实验中暴露于指定浓度的XL413。培养10-14天后固定细胞，染色并拍照。gydF4y2BaggydF4y2Ba表达对照shRNA或抗shRNA的SK-Hep1和Huh6细胞gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba暴露在指定浓度的XL413中5天。CellTiter-Blue活性测定显示gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba在SK-Hep1和Huh6细胞中，敲除与XL413处理协同作用。图表表示六个技术重复的平均值±标准差。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba采用包含80例HCC标本的组织芯片进行免疫组织化学分析的代表性图像。gydF4y2Ba

图2抑制CDC7可选择性诱导肝癌细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，肝癌细胞系与gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba在10 μM XL413溶液中培养4 d，诱导细胞衰老(SA-β-gal染色检测)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，肝癌细胞系的生长曲线(由诱导细胞活细胞分析测量)gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba这些突变要么未治疗，要么继续用XL413治疗，要么在停药前用10 μM的XL413治疗5或6天。图表表示5个技术重复的平均值±标准差。gydF4y2BacgydF4y2BaH3K9me3染色肝癌细胞系的代表性图像gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba10 μM XL413暴露7天。gydF4y2BadgydF4y2Ba用10 μM XL413处理Hep3B和Huh7细胞7天，可诱导衰老相关的分泌表型(SASP)。通过qRT-PCR分析测定衰老相关分泌表型相关基因的mRNA表达。图表表示四个技术重复的平均值±标准差。gydF4y2BaegydF4y2Ba肝癌细胞在10 μM XL413培养基中培养4 d，采用caspase-3和caspase-7凋亡检测方法观察凋亡细胞。数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。数据gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba代表了两个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

扩展数据图3对CDC7的药理学或遗传抑制诱导肝癌细胞衰老表型gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，肝癌细胞系与gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(Hep3B, Huh7, SNU398, MHCC97H和HCCLM3)(蓝色)和野生型肝癌细胞株gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(SK-Hep1和Huh6)(红色)在低汇流下播种，并在没有或存在CDC7抑制剂LY3177833或TAK-931的情况下以指定的浓度进行长期菌落形成实验。培养10-14天后固定细胞，染色并拍照。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，肝癌细胞系的生长曲线(由诱导细胞活细胞分析测量)gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(Hep3B和Huh7)(蓝色)和野生型肝癌细胞株gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(SK-Hep1和Huh6)(红色)暴露于LY3177833或TAK-931。图表表示四个技术重复的平均值±标准差。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba肝癌细胞在CDC7抑制剂LY3177833或TAK-931的浓度下培养4天。SA-β-gal染色显示CDC7抑制剂(LY3177833或TAK-931)选择性诱导肝癌细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(蓝色)，而非野生型肝癌细胞gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(红色)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，肝癌细胞系与gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(Hep3B和Huh7)和肝癌细胞系的野生型gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(SK-Hep1和Huh6)通过对照pLKO载体或两个独立的靶向shrna稳定转导gydF4y2BaCDC7gydF4y2Ba(这里标记为shCDC7 #1和#2)和CDC7敲除在肝癌细胞系中的效率通过western blot进行评估。gydF4y2BahgydF4y2Ba，肝癌细胞系的集落形成分析gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(蓝色)和野生型肝癌细胞系gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(红色)，分别进行CDC7敲除和不敲除。培养10天后固定细胞，染色并拍照。gydF4y2Ba我gydF4y2BaCDC7敲低诱导Hep3B和Huh7细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba但在具有野生型的SK-Hep1和Huh6细胞中没有突变gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba．SA-β-gal染色检测衰老。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

图4 CDC7的抑制导致肝癌细胞DNA损伤的积累gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2BaWestern blot分析CDC7抑制剂(LY3177833或TAK-931)处理7天的肝癌细胞系。CDC7的抑制诱导肝癌细胞中dna损伤标志物γH2AX的表达gydF4y2BaTP53gydF4y2BaγH2AX降低，p53和p21功能性上调gydF4y2Bacip1gydF4y2Ba观察到gydF4y2BaTP53gydF4y2Baxl413治疗后的野生型肝癌细胞株。gydF4y2BacgydF4y2Ba具有代表性的肝癌细胞中性彗星检测图像gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(Hep3B和Huh7)和野生型肝癌细胞gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(SK-Hep1和Huh6)用XL413治疗7 d。gydF4y2BadgydF4y2Ba，热图显示折叠基因表达变化(以对数表示)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)在野生型细胞中gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(BJ和SK-Hep1)和肝癌细胞gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba用XL413 (10 μM, 4 d)处理后，出现Huh7和Hep3B突变。gydF4y2BaegydF4y2Ba，对Hep3B、Huh7、SK-Hep1和BJ细胞用10 μM XL413处理4 d的rna测序数据进行GSEA;这表明dna修复特征(重组修复和范可尼贫血途径)在不同的细胞之间显著不同gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变和野生型细胞gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba（gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．gydF4y2BafgydF4y2Ba中性彗星实验对20 μM XL413联合AZD6738 (ATR抑制剂，2.5 μM)或MK-8776 (CHK1抑制剂，2.5 μM)处理的SK-Hep1和Huh6细胞进行3天。各处理组的尾矩值以对照细胞的平均值(gydF4y2BangydF4y2Ba=每个细胞系和条件50个细胞)。图表示均数±标准差，用未配对的双面学生曲线分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba在无或存在XL413 (10 μM)条件下培养H2B-GFP Hep3B和Huh7细胞，96 h后进行延时显微镜观察有丝分裂长度。图表表示平均值±s.d。gydF4y2BangydF4y2Ba每个细胞系和条件下= 30个细胞，用未配对的双面分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba、不同基因背景的肝癌小鼠细胞模型(gydF4y2Ba国家管制当局方面gydF4y2BaG12VgydF4y2Ba；gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba和gydF4y2Ba国家管制当局方面gydF4y2BaG12VgydF4y2Ba；gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaCdkn2agydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)暴露于指示浓度的CDC7抑制剂(XL413, LY3177833或TAK-931)中7天，进行菌落形成实验。gydF4y2BajgydF4y2BaWestern blot分析XL413、LY3177833或TAK-931治疗7 d肝癌小鼠细胞模型。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba代表了两个独立的生物学实验。数据gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

图5抑制CDC7可选择性地诱导癌细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，肺癌细胞系与gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(蓝色)和野生型肺癌细胞系gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(红色)在低汇流处播种，并在没有或存在XL413的情况下以指定浓度生长10-14天，进行菌落形成试验。gydF4y2BabgydF4y2Ba结果表明，10 μM XL413对肺癌细胞有选择性的诱导衰老作用gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(SA-β-gal染色检测)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，在等基因中检测p53的表达gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba和gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba+/+gydF4y2Bawestern blot检测HCT116结肠癌细胞系。gydF4y2BadgydF4y2Ba, HCT116gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba+/+gydF4y2Ba和HCT116gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba细胞在低汇流下播种，在没有或存在XL413的情况下以指定浓度培养7天，进行集落形成试验，以评估其增殖能力。gydF4y2BaegydF4y2Ba, HCT116gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba+/+gydF4y2Ba和HCT116gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba在10 μM XL413溶液中培养4 d，选择性诱导细胞衰老gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaHCT116细胞(SA-β-gal染色检测)。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba代表了两个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

图6舍曲林通过抑制mTOR信号通路选择性诱导xl413诱导的衰老细胞凋亡。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， gpcr -复合物屏幕示意图。Huh7细胞用10 μM XL413处理5 d后播种于96孔板。所有化合物在4种浓度下测试6天，并使用CellTiter-Blue法测量细胞活力。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，描述化合物对细胞活力影响的图表。每个点代表一种化合物，活性百分比由5 μM的该化合物存在时的细胞活力分数除以阴性对照的平均活力计算。蓝点表示在对照和xl413诱导的衰老细胞中诱导细胞死亡的化合物。舍曲林(红点)诱导xl413诱导的衰老细胞选择性死亡。化合物对xl413处理和未处理细胞的影响的代表性图像显示。gydF4y2BadgydF4y2Ba，对照细胞和xl413诱导的衰老细胞依次用增加浓度的舍曲林培养48 h，通过caspase-3和caspase-7凋亡实验观察凋亡细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba10 μM舍曲林作用于对照组和xl413处理的细胞，用Incucyte活细胞法测定细胞生长曲线。图表表示三个技术重复的平均值±标准差。gydF4y2BafgydF4y2Ba对照组和处理过xl413的细胞分别用10 μM舍曲林处理96 h，进行菌落形成实验。gydF4y2BaggydF4y2Ba用舍曲林(10 μM)作用于对照组和xl413处理的Huh7和Hep3B细胞24 h, western blot检测mTOR信号通路指示蛋白。gydF4y2BahgydF4y2BaHep3B和Huh7细胞用10 μM XL413处理10 d后，用舍曲林(10 μM, 24 h)依次处理，并进行RNA测序。GSEA表明，在XL413和舍曲林连续治疗的肝癌细胞中，与mTOR信号下调相关的基因集呈负富集(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba，肝癌细胞与gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba突变(SNU449和PLC/PRF/5)和肺癌细胞系与gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba用10 μM XL413或载体处理NCI-H358和PC9基因突变5-7 d，然后依次暴露于浓度增加的AZD8055中。AZD8055作用96 h后，通过caspase-3和caspase-7凋亡检测观察凋亡细胞。gydF4y2BakgydF4y2Ba，肝癌细胞与gydF4y2BaTP53gydF4y2BaHep3B和Huh7基因突变用10 μM XL413或载体处理7-10 d。对照细胞和xl413诱导的衰老细胞被镀并暴露于浓度增加的mTORC1和mTORC2抑制剂AZD2014中。AZD2014作用96 h后，通过caspase-3和caspase-7凋亡检测观察凋亡细胞。gydF4y2BalgydF4y2Ba，野生型肝癌细胞系gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba(SK-Hep1和Huh6)用10 μM XL413或载体处理5-7 d后，再暴露于浓度增加的AZD8055中。AZD8055作用96 h后，通过caspase-3和caspase-7凋亡检测观察凋亡细胞。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，对照组细胞和xl413诱导的衰老细胞用AZD2014处理48 h，用指示抗体(左)进行Western blot分析，磷酸化的S6RP和磷酸化的4EBP1水平分别归一化至S6RP和4EBP1的总水平(右);这表明使用AZD2014治疗可导致xl413诱导的衰老细胞中mTOR信号的强烈抑制。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。数据gydF4y2BahgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba米gydF4y2Ba代表了两个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

图7在xl413诱导的衰老细胞中，AZD8055处理后诱导的RTK反馈激活被中断。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba对照组细胞和xl413处理过的Hep3B细胞用AZD8055处理48小时，提取的蛋白用人磷酸化rtk阵列试剂盒分析(左)。磷酸化RTK蛋白水平归一化至阳性对照(右)。gydF4y2BabgydF4y2Ba通过western blot分析验证了RTK阵列识别的RTK激活和SHP2的磷酸化。gydF4y2BacgydF4y2Ba，用AZD8055处理Hep3B细胞48 h后提取mRNA，通过qRT-PCR对RTK蛋白的指示基因进行定量。该图表示三个技术重复的平均值±标准差。gydF4y2BadgydF4y2Ba，用AZD8055处理Hep3B细胞，在指定的时间点收集细胞裂解液，用指定的抗体进行western blot分析。gydF4y2BaegydF4y2Ba， Hep3B细胞暴露于增加浓度的AKT抑制剂MK-2206联合AZD8055，并进行长期集落形成实验;这揭示了这两种化合物对细胞活力的协同作用。gydF4y2BafgydF4y2Ba， Hep3B细胞分别用AZD8055、MK-2206或两者以指定浓度联合作用5天，通过caspase-3和caspase-7凋亡实验观察凋亡细胞。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．所示的所有实验(RTK阵列分析除外)都代表了两个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

图8 AZD8055治疗不诱导顺铂或阿利塞替诱导的衰老细胞凋亡。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba, BJ / ET / RASgydF4y2BaV12gydF4y2Ba用100 nM 4-OHT处理21天诱导细胞衰老，SA-β-gal染色检测。gydF4y2BabgydF4y2Ba控制或衰老BJ/ET/RASgydF4y2BaV12gydF4y2Ba分别用载体液和400 nM AZD8055处理细胞96 h，通过caspase-3和caspase-7凋亡实验观察凋亡细胞。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Hep3B细胞在顺铂或alisertib (aurora-A -激酶抑制剂)的作用下按指定浓度培养4天，SA-β-gal染色检测细胞衰老诱导。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Hep3B细胞用顺铂(1 μg ml)处理gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或阿利泽tib (250 nM)作用4天，然后暴露于载体或400 nM AZD8055 96 h。通过caspase-3和caspase-7凋亡实验观察凋亡细胞。gydF4y2BaegydF4y2Ba用AZD8055处理对照细胞或顺铂、阿利塞替或xl413诱导的衰老细胞，并在指定的时间点收集细胞裂解液。用所示抗体进行Western blot分析，结果显示mTOR信号反馈环在顺铂和阿利塞提诱导的衰老细胞中是有效的(而在xl413诱导的衰老细胞中被有效抑制)。凝胶源图像参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba代表了两个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

图9促衰老治疗联合mTOR抑制剂抑制肝癌异种移植瘤生长。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，对用载体、XL413、AZD8055或两者联合处理12天的皮下huh7肿瘤异种移植物的甲醛固定、石蜡包埋或冷冻切片进行γH2AX和SA-β-gal染色的代表性图像。gydF4y2BabgydF4y2BaSA-β-gal染色的代表性图像来自于用载体剂或XL413处理21天的sk - hep1肿瘤皮下移植瘤的冷冻切片。gydF4y2BacgydF4y2Ba在终点时，用载体、XL413、AZD8055或两者的组合治疗携带Huh7-和MHCC97H肿瘤异种移植的小鼠的肿瘤体积测量(Huh7为12天，MHCC97H为22天)。样本量见图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．载药组的一只小鼠和XL413组的一只小鼠被排除在分析之外，因为最大允许的肿瘤体积(2000 mmgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)在试验结束前在这些小鼠中达到。图表显示平均值±s.e.m，用双面未配对的学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba携带Huh7和MHCC97H肿瘤的小鼠，用对照剂或索拉非尼治疗16或22天，肿瘤体积的纵向进展;这表明sorafenib治疗在这两种异种移植模型中疗效有限。图表显示平均值±s.e.m。gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，苏木精和伊红(H & E)、PCNA、裂解的caspase-3和磷酸化的4EBP1染色的代表图像，这些染色来自于最后一次剂量载体、XL413、AZD8055或这两种药物的组合后死亡的小鼠，用甲醛固定、石蜡包埋的Huh7和MHCC97H异种移植。数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图10促衰老治疗联合mTOR抑制剂抑制p53缺陷、免疫功能正常的HCC体细胞小鼠模型中的肿瘤生长。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，水动力尾静脉基因传递示意图gydF4y2BaMycgydF4y2Ba原癌基因转座子系统和靶向的CRISPR-Cas9载体gydF4y2BaTrp53gydF4y2Ba或者是gydF4y2BaPtengydF4y2Ba肿瘤抑制剂，用于HDTVi后2 - 3周诱导肝癌模型。gydF4y2BabgydF4y2Ba对小鼠模型冰冻切片进行SA-β-gal染色定量gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaPtengydF4y2BaKOgydF4y2Ba或gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2BaHCC，用载体或XL413单药治疗后14天gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba图中也显示了HCC。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．用于分析gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaPtengydF4y2BaKOgydF4y2Ba肿瘤、vehicle-treatedgydF4y2BangydF4y2Ba= 3只小鼠9个生物独立结节;XL413-treated,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3只小鼠的16个生物独立结节。用于分析gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba肿瘤、vehicle-treatedgydF4y2BangydF4y2Ba=来自7只小鼠的41个生物独立结节;XL413-treated,gydF4y2BangydF4y2Ba=来自11只小鼠的81个生物独立结节。图中为SA-β-gal数量的平均值±s.e.m.gydF4y2Ba+gydF4y2Ba每毫米每肿瘤结节的细胞数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．统计数据由双侧未配对学生计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BacgydF4y2Ba试验设计评估促衰老治疗联合mTOR抑制剂对小鼠生育的疗效gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba肝细胞癌。HDTVi后每周对小鼠进行MRI监测，并纳入对照，XL413 (100 mg kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba，每日灌胃)，AZD8055 (20 mg kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(每日灌胃)或XL413 + AZD8055组合在肿瘤发展的第一个迹象(MRI显示)。每周给药6天，当老鼠出现症状时就会被杀死。免疫组化分析证实终点MYC表达和p53敲除gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba肝细胞癌。gydF4y2BadgydF4y2Ba，小鼠负重的纵向个体体重曲线gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba肿瘤，用XL413 + AZD8055的组合治疗。gydF4y2BaegydF4y2Ba，使用载体、XL413、AZD8055或两种药物联合治疗小鼠的肿瘤生长曲线，根据小鼠轴承的MRI图像计算gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba肿瘤。gydF4y2BafgydF4y2Ba，数量gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba携带肝癌的小鼠肿瘤，用载体治疗(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5，如图所示gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)、索拉非尼(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)或XL413 + AZD8055 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)在第0天和第14天。图表显示均数±s.e.m，用双面未配对学生曲线分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba， SA-β-gal的代表图像(gydF4y2BaggydF4y2Ba)及p16 (gydF4y2BahgydF4y2Ba)分别对冷冻切片和石蜡包埋切片进行染色gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba肿瘤，用指定的药物治疗，并在中间时间点(时间匹配的治疗队列中的14-16天)死亡。量化结果如图所示。gydF4y2Ba4 f, ggydF4y2Ba．比例尺，50 μm。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，小鼠轴承gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba用载体、XL413、AZD8055或两种药物的组合治疗的肿瘤在治疗后的指定时间点被杀死。将肿瘤分离成单细胞悬液，流式细胞术分析肿瘤相关巨噬细胞(CD45)含量gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba+gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba−gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba−gydF4y2Ba)， CD8 T细胞(CD45gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaNK1.1gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和CD4 T细胞(CD45gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaNK1.1gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)相对于总CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba白细胞。细胞增殖(Ki67gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)在CD8 T细胞群和CD4 T细胞群中测定。图表显示均数±s.e.m，用双面未配对学生曲线分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。样本量在方法中给出。gydF4y2BajgydF4y2Ba，小鼠轴承gydF4y2BaMycgydF4y2BaOEgydF4y2Ba；gydF4y2BaTrp53gydF4y2BaKOgydF4y2Ba用XL413 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 20)或XL413 + AZD8055组合(gydF4y2BangydF4y2Ba= 14天。在接受xl413治疗的小鼠中，一个子集(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)在治疗后14天死亡，与药物联合治疗组同时死亡。其余接受xl413治疗的小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)停服XL413 4天。在冷冻切片上进行SA-β-gal染色，观察每个肿瘤结节衰老细胞的绝对数量，并对每个治疗组(xl413治疗，gydF4y2BangydF4y2Ba=来自10只小鼠的60个生物独立结节;XL413-withdrawn,gydF4y2BangydF4y2Ba=来自10只小鼠的63个生物独立结节;XL413 + azd8055处理，gydF4y2BangydF4y2Ba=来自7只小鼠的57个生物独立结节)。图表显示均数±s.e.m.分析与双面未配对学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。数据gydF4y2BacgydF4y2Ba分别代表了三个独立的生物学实验。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

补充图1gydF4y2Ba

Uncropped墨迹。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

补充图2gydF4y2Ba

FACS门控策略。gydF4y2Ba

补充表1gydF4y2Ba

肝癌细胞中kinome中心基因筛选。gydF4y2Ba

补充表2gydF4y2Ba

FACS抗体表。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

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王，C, vevena, S, Jin, H。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba诱导和利用肝癌治疗的薄弱环节。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba574gydF4y2Ba， 268-272(2019)。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1607-3gydF4y2Ba

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