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人类线粒体DNA转录的小分子抑制剂gydF4y2Ba

自然gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba588gydF4y2Ba，gydF4y2Ba页面gydF4y2Ba712 - 716 (gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用本文gydF4y2Ba

主题gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

线粒体DNA (mtDNA)表达的改变发生在衰老和一系列人类病理中(例如，先天性代谢错误，神经退行性变和癌症)。在这里，我们描述了一类针对人类线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的特异性线粒体转录抑制剂(IMTs)，这对氧化磷酸化(OXPHOS)系统的生物发生至关重要gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．IMTs有效地损害重建重组系统中的mtDNA转录，并在细胞系中引起mtDNA表达和OXPHOS的剂量依赖性抑制。为了验证细胞靶点，我们对诱变细胞进行了外显子组测序，并在POLRMT中发现了一组氨基酸取代，导致对IMTs的耐药性。我们获得了与IMT结合的POLRMT的冷冻电子显微镜(cro - em)结构，进一步确定了POLRMT活性中心裂口附近的变构结合位点。癌细胞的生长和治疗耐药癌症干细胞的持久性先前已被报道依赖于OXPHOSgydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，因此我们研究了imt是否具有抗肿瘤作用。四周的IMT口服治疗在小鼠中耐受性良好，并且不会导致正常组织中的OXPHOS功能障碍或毒性，尽管在人类癌细胞异种移植中诱导了强烈的抗肿瘤反应。综上所述，IMTs为研究mtDNA表达在生理和疾病中的作用提供了一种有效而特异的化学生物学工具。gydF4y2Ba

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图1:IMTs影响POLRMT的稳定性、底物结合和酶活性，抑制线粒体基因表达。gydF4y2Ba
图2:POLRMT是IMTs的体内靶点。gydF4y2Ba
图3:IMTs特异性抑制癌细胞增殖。gydF4y2Ba
图4:IMT治疗以剂量依赖的方式抑制体内肿瘤生长和线粒体基因表达。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

本研究中产生和分析的所有相关数据都包含在文章中。补充图中提供了未裁剪的凝胶。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．本研究中使用的公开数据集是人类蛋白质组数据库(UP000005640, UniProt)和POLRMT结构(PBD代码5OLA和4BOC)。关于独特试剂的进一步信息和要求请联系相应的作者。用于分析的蛋白质组学数据和R脚本已保存在PRIDE中，数据集标识符为PXD018426。电子显微镜图已存入电子显微镜数据库(登录代码)gydF4y2Baemd - 11679gydF4y2Ba)，与IMT1B结合的POLRMT结构模型已存入PDB(登录代码gydF4y2Ba7 a8pgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba源数据gydF4y2Ba提供了这篇论文。gydF4y2Ba

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下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作得到了马克斯·普朗克学会、瑞典研究委员会(2015-00418至n.g.l.、2013-3621至m.f.、2012-2583至C.M.G.)、瑞典癌症基金会(至m.f.、C.M.G.和n.g.l.)、克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会(至m.f.、C.M.G.和n.g.l.)、德国研究协会(SFB1218/A06至n.g.l.)、欧洲研究理事会(高级拨款2016-741366授予n.g l .)和瑞典政府根据瑞典政府与县议会之间的协议提供的拨款，ALF协议授予M.F. (ALFGBG-727491)， C.M.G. (ALFGBG-728151)和n.g l . (SLL2018.0471)。P.C.得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB860, SPP1935)，欧洲研究委员会(高级研究员资助TRANSREGULON，资助协议编号:693023)、大众汽车基金会和德国卓越战略(EXC 2067/1- 390729940)。H.S.H.由德国Forschungsgemeinschaft (FOR2848)资助。我们感谢N. Hochhard和S. Miethe的技术援助;德尔皮拉尔·米兰达先生请求协助;T. Colby, A. Taha, Y. Hinze, S. Perin和C. Edlich-Muth的支持;I. Ivanov在Oncolead提供细胞面板数据;C. Dienemann协助冷冻电子显微镜数据收集和处理; and Y. Chen for providing purified RNA polymerase II.

作者信息gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

  1. 这些作者贡献均等:妮娜·a·博内坎普，布拉德利·彼得gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

  1. 线粒体生物学系，马克斯普朗克衰老生物学研究所，科隆，德国gydF4y2Ba

    Nina A. Bonekamp & Nils-Göran LarssongydF4y2Ba

  2. 瑞典哥德堡大学医学生物化学和细胞生物学系gydF4y2Ba

    Bradley Peter, Maria Falkenberg和Claes M. GustafssongydF4y2Ba

  3. 德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所分子生物学系，GöttingengydF4y2Ba

    豪克·s·海伦和帕特里克·克莱默gydF4y2Ba

  4. 瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院医学生物化学和生物物理系gydF4y2Ba

    Andrea Felser & Nils-Göran LarssongydF4y2Ba

  5. 领先探索中心，德国多特蒙德gydF4y2Ba

    Tim Bergbrede, Axel Choidas, Anke Unger, Raffaella Di Lucrezia, Uwe Koch, Sascha Menninger, Joanna Boros, Peter Habenberger, Peter nussbamer和Bert KleblgydF4y2Ba

  6. 衰老的代谢和遗传调控，马克斯普朗克衰老生物学研究所，科隆，德国gydF4y2Ba

    莫里茨·霍恩和马丁·s·丹泽尔gydF4y2Ba

  7. Acus实验室，德国科隆gydF4y2Ba

    莫里茨角gydF4y2Ba

  8. JLP卫生，维也纳，奥地利gydF4y2Ba

    莫里茨角gydF4y2Ba

  9. 蛋白质组学核心设施，马克斯普朗克衰老生物学研究所，德国科隆gydF4y2Ba

    Ilian Atanassov &李新平gydF4y2Ba

  10. 代谢组学核心设施，马克斯普朗克衰老生物学研究所，德国科隆gydF4y2Ba

    帕特里克GiavaliscogydF4y2Ba

  11. 马克斯普朗克老年生物学研究所-卡罗林斯卡研究所实验室，卡罗林斯卡研究所，斯德哥尔摩，瑞典gydF4y2Ba

    Nils-Goran拉尔森gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 尼娜·a·博内坎普gydF4y2Ba
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  2. 布拉德利彼得gydF4y2Ba
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  3. 豪克·s·海伦gydF4y2Ba
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  4. 安德里亚·费尔斯gydF4y2Ba
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  5. 蒂姆BergbredegydF4y2Ba
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  6. 阿克塞尔ChoidasgydF4y2Ba
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  7. 莫里茨角gydF4y2Ba
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  8. Anke昂格尔gydF4y2Ba
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  9. Raffaella Di LucreziagydF4y2Ba
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  10. 平民AtanassovgydF4y2Ba
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  11. 新平李gydF4y2Ba
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  12. 乌维科赫gydF4y2Ba
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  13. Sascha门宁格gydF4y2Ba
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  14. 乔安娜·米德尔斯堡gydF4y2Ba
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  15. 彼得HabenbergergydF4y2Ba
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  16. 帕特里克GiavaliscogydF4y2Ba
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  17. 帕特里克·克莱默gydF4y2Ba
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  18. 马丁·s·丹泽尔gydF4y2Ba
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  19. 彼得•努斯鲍姆gydF4y2Ba
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  20. 伯特KleblgydF4y2Ba
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  21. 玛丽亚·法尔肯贝里gydF4y2Ba
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  22. 克拉斯·m·古斯塔夫松gydF4y2Ba
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  23. Nils-Goran拉尔森gydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba

m.f.、C.M.G.和n.g . l.s提出了最初的IMT概念。m.f.， C.M.G, n.g l, b.k.， N.A.B.和B.P.概念化了研究目标和实验。N.A.B.和B.P.策划、执行和分析了大部分实验。N.A.B.在组织培养(IMT1, IMT1B和con IMT)和异种移植中进行了qPCR和western blotting实验，并进行了siRNA转染实验，细胞增殖实验，ROS测量，代谢组学，定量蛋白质组学和细胞器翻译实验。B.P.进行并分析了差示扫描荧光法、微尺度热泳分析和体外转录分析(IMT1、IMT1B和con IMT)和表达突变的POLRMT构建。H.S.H.设计并进行了低温电镜实验和RNA Pol II引物延伸实验。A.F.使用IMT1计划、执行和分析qPCR、western blotting和呼吸测量。T.B.设计了基于htrf的POLRMT检测方法，并对IMT开发过程中的实验进行了分析。A.C.和P.H.计划、执行和分析细胞增殖试验。M.H.计划、执行和分析正向遗传筛选并生成A2780突变细胞系。 A.U. designed and analysed toxicology, pharmacology and efficacy data. R.L. designed IMT compounds and synthesis routes, analysed data and devised strategies to elaborate the structure–activity relationship of inhibitors. I.A. and X.L. performed, analysed and interpreted quantitative proteomics data. P.G. performed, analysed and interpreted metabolomics data. U.K. carried out structural modelling of human POLRMT, docking of compounds and aided in cluster analysis of inhibitors. S.M. and J.B. designed and carried out qPCR and western blot experiments in the course of IMT development. M.S.D. planned and interpreted the forward genetic screens. P.N. aided in compound and synthesis design. P.C. designed and supervised cryo-EM experiments and RNA Pol II primer extension assays. M.F. planned, performed and analysed in vitro assays on RPO41, T7 RNA Pol,大肠杆菌gydF4y2BaRNA Pol, RevertAid逆转录酶和POLG。na.b、b.p.、C.M.G.和n.g.l.撰写了手稿，并听取了所有作者的意见。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba克拉斯·m·古斯塔夫松gydF4y2Ba或gydF4y2BaNils-Goran拉尔森gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

IMT化合物的知识产权已发布为WO 2019/ 07821，并已获得马克斯普朗克学会和铅发现中心有限公司的许可。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba感谢Navdeep Chandel, Angela Koehler和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。同行评审报告是可用的。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba

图1 IMT1影响POLRMT稳定性和DNA结合。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， imt的高通量筛选程序概述。gydF4y2BabgydF4y2Ba， IMT1 (LDC195943)的化学结构。gydF4y2BacgydF4y2Ba，在IMT1存在下进行差示扫描荧光法。熔化温度的变化(ΔgydF4y2BaTgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)与IMT1浓度(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，用于单核苷酸掺入和MST测定的模板。NT2，非模板链;TS2，模板链;R14, 14-mer RNA。gydF4y2BaegydF4y2Ba，图中用于测定Michaelis-Menten动力学的代表性凝胶。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba．显示了p32标记的14聚合物支架和扩展的15聚合物产品。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba，与稳态POLRMT动力学数据拟合的残差。gydF4y2BaggydF4y2Ba，在0-10 μM IMT1存在下，不同底物浓度下单核苷酸的掺入gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验)。gydF4y2BahgydF4y2Ba，在0-10 μM IMT1B存在的线性LSP和超螺旋圆形LSP模板上体外启动子依赖性转录。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。量化结果如图所示。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，结合亲和力的浓度依赖性降低(gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Ba)在IMT1B水平增加时，POLRMT和RNA-DNA支架之间观察到(平均±s.d.，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验)。gydF4y2BajgydF4y2Ba，原始MST迹。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图2 IMT1影响线粒体基因表达。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， IMT1处理6 h和4 d后ND1线粒体转录水平(均值±s.e.m.，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3-4个生物重复，双向方差分析，Sidak多重比较检验，DMSO-IMT1)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， IMT1处理后mtDNA水平(均值±s.e.m，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 (144 h, 192 h)， 4 (4 h, 6 h, 96 h)， 6 (24 h, 48 h, 72 h)或8个(DMSO)生物重复)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， IMT1处理后OXPHOS蛋白水平(30 μg / lane)的免疫印迹分析。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BadgydF4y2Ba， IMT1治疗随时间变化的定量蛋白质组学(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5个生物重复)。在每个时间点，imt处理的样品与对照样品(DMSO)进行比较。OXPHOS复合物、有丝核糖体亚基和细胞质核糖体蛋白水平的变化被绘制成对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-随着时间的推移，相对于控制的丰度变化。中位数、上下箱铰、上下须的准确数值见补充表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(复合IMT1)。gydF4y2BaegydF4y2Ba， IMT1暴露后HeLa细胞呼吸功能完好。测定基础呼吸、漏呼吸和最大呼吸(mean±s.e.m;gydF4y2BangydF4y2Ba= 4次独立测量，双向方差分析，Sidak多重比较检验，各自DMSO对照- imt1)。gydF4y2BafgydF4y2BaIMT1后ND1转录水平比较(扩展数据图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和IMT1B(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)在HeLa和A2780细胞中进行治疗。虚线表示dmso处理对照组中ND1转录水平。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图3 imt是高度特定的。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba，使用扩展数据图中显示的模板进行单核苷酸掺入分析。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba．IMT1B抑制POLRMT，但不影响RPO41 (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)、T7 RNA聚合酶(gydF4y2BabgydF4y2Ba)或gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaRNA聚合酶(gydF4y2BacgydF4y2Ba)．每个面板的第一个通道仅为模板，不添加酶。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BadgydF4y2Ba， IMT1B不抑制RevertAid逆转录酶合成cDNA。逆转录酶在第二通道被省略。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在IMT1B浓度增加的情况下，进行POLRMT和RNA聚合酶II的引物扩展试验。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba， IMT处理不影响核RNA聚合酶靶点的表达。HeLa和A2780细胞分别用DMSO或IMT1、IMT1B和一种市售IMT (con IMT)作为对照。聚合酶靶标(RNA Pol I: 18S, 28S;RNA Pol II: POLRMT， β-actin;RNA Pol III: 5S;POLRMT: ND1, CYTB, COX1)以均数±s.e.m表示(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4 (con IMT)或5 (IMT1, IMT1B)个生物重复，双向方差分析，Sidak多重比较检验，dmso各自的IMT处理)。gydF4y2BaggydF4y2Ba， IMT1B不抑制POLγ引物伸长。POLγ的输入模板是3800 nt单链DNA，当合成时变成3800 bp的缺口圆形模板产品。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。第一车道，ddCTP控制。gydF4y2BahgydF4y2Ba，在存在或不存在IMT1B的情况下，新分离的线粒体的细胞器翻译。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物重复。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， conimt的化学结构(SC-6238532)，一种与IMTs结构相关的类似物。gydF4y2BajgydF4y2Ba，在有无con IMT情况下进行的差示扫描荧光法(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验)。gydF4y2BakgydF4y2Ba在0-10 μM con IMT存在下，在线性LSP和超螺旋圆形LSP模板上进行了体外启动子依赖性转录。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。R/O，决胜成绩单。gydF4y2BalgydF4y2Ba，量化gydF4y2BakgydF4y2Ba．的平均值gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，不同浓度的con IMT处理HeLa细胞6 h后，ND1和CYTB的线粒体转录水平(平均值±s.e.m.，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3、4 (0.1 μM)或5 (DMSO, 10 μM, 5 μM)个生物重复)。gydF4y2BangydF4y2Ba， con IMT处理的HeLa细胞mtDNA水平(平均值±s.e.m，gydF4y2BangydF4y2Ba= 3,4(72小时)或5 (DMSO)生物重复)。gydF4y2BaogydF4y2Ba， Con IMT处理4 d(每道20 μg) HeLa细胞中OXPHOS蛋白水平的免疫印迹分析。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BapgydF4y2Ba， con IMT治疗随时间变化的定量蛋白质组学(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5个生物重复)。在每个时间点，处理样品与对照样品(DMSO)进行比较。OXPHOS复合物、有丝核糖体亚基和细胞质核糖体蛋白水平的变化被绘制成对数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-随着时间的推移，相对于控制的丰度变化。中位数、上下箱铰、上下须的准确数值见补充表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba(复合con IMT)。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图4 IMT-binding pocket的识别。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，化学诱变抗imt筛的实验工作流程示意图。gydF4y2BabgydF4y2Ba在0-10 μM IMT1B存在下，使用抗imt的L816Q和A821V POLRMT突变体进行体外启动子依赖转录。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba，量化gydF4y2BabgydF4y2Ba．的平均值gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BadgydF4y2Ba，抗imt的POLRMT突变体的转录起始抑制。在线性LSP模板上使用野生型和抗imt的POLRMT蛋白进行体外转录启动，无论是否存在IMT1。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba在IMT1B存在的情况下，增加POLRMT的数量并不能挽救野生型活动。在10 μM的IMT1B存在下，使用浓度增加的野生型或突变型POLRMT (L816Q或A821V)，在超螺旋圆形LSP模板上进行体外启动子依赖性转录。代表图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba，量化gydF4y2BaegydF4y2Ba．的平均值gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BaggydF4y2Ba，引入A2780细胞的crispr - cas9工程POLRMT突变的Sanger测序。gydF4y2BahgydF4y2Ba， POLRMT突变细胞系(L796Q和L816Q， #表示两个独立克隆)中线粒体基因的表达。数据以未处理野生型对照(DMSO)的倍数表示，并以均数±s.e.m表示(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7-9个生物重复;双向方差分析，Sidak多重比较检验，DMSO-IMT1)。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图5用IMT1B冷冻电镜测定POLRMT结构。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， 40°倾斜数据采集的代表性显微照片(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2077张显微照片)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，大多数填充类从二维分类使用cryoSPARC 6。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Cryo-EM处理流程。gydF4y2BadgydF4y2Ba，在POLRMT拇指和手掌结构域之间的IMT1B结合袋。POLRMT显示为半透明的卡通，IMT1B 4 Å内的残留物显示为棒状。IMT1B是基于低温电镜密度和化学因素(方法)建立模型的。gydF4y2BaegydF4y2Ba，傅里叶壳层相关图。gydF4y2BafgydF4y2Ba，粒子视图的角分布。gydF4y2BaggydF4y2Ba，采用RELION 3计算局部分辨率估计。IMT1B的位置用红色虚线框表示。gydF4y2BahgydF4y2Ba， IMT1B附近的Cryo-EM密度。IMT1B显示为棒状，低温em密度显示为蓝色网格，雕刻值为2 Å。gydF4y2Ba

图6 POLRMT缺失导致细胞活力下降。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在HeLa细胞中，POLRMT沉默影响细胞活力。使用ViCell细胞计数器评估细胞活力。的意思是gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。NT, non-transfected。gydF4y2BabgydF4y2Ba转染4 d后，免疫印迹法检测POLRMT水平(20 μg / lane)。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba使用SRB增殖试验分析癌细胞增殖表明，IMT1治疗特异性地抑制了多种癌细胞系的癌细胞增殖，但在对照细胞中没有。集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba绘制了89个癌细胞系(灰色)和原代细胞(黑色，IMR90肺成纤维细胞和人pbmc)上的IMT1值。gydF4y2BadgydF4y2BaHeLa细胞(ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.838 μM);肺癌细胞(A594)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.643 μM)和IMR90肺成纤维细胞(ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba采用SRB法测定IMT1处理后的> 30 μM)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在指定的抑制剂浓度下，使用CellTiter-Glo试验评估对人(h) pbmc(两种不同的供体，左)或原代人肝细胞(右)的细胞毒性(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验)。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图7 imt诱导细胞毒性的基础。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， IMT1处理后A2780细胞的ROS水平通过细胞ROS检测试剂盒Orange (mean±s.e.m.，gydF4y2BangydF4y2Ba= 5个生物重复)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，免疫印迹分析凋亡标记物裂解PARP。在指定的时间点用IMT1处理A2780细胞，并通过胰蛋白酶处理收集细胞(见附件)。在之后的时间点，收集并分离细胞培养上清液或通过离心(上清液)分离死亡细胞(20 μg / lane)。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba，凋亡(左上)、单碳通路(左下)、降解和应激反应(右)中蛋白质水平的折叠变化热图。gydF4y2BadgydF4y2Ba， IMT1处理后中枢碳代谢变化概述。代谢物水平的变化在指定的时间点作为对照的倍数给出。深蓝色，最小值(0);暗红色，最大值(2)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，免疫印迹法检测增殖标志物PCNA。在指定的时间点(20 μg / lane)，用IMT1B(+)或DMSO(−)处理A2780细胞。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图8体内IMT治疗。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，体内研究中使用的IMT1B药代动力学(PK)参数:静脉给药(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或口服剂量(gydF4y2BabgydF4y2Ba) (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物重复)。gydF4y2BatgydF4y2Ba1/2，消去半衰期;gydF4y2BaTgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba，给药后达到血药浓度峰值的时间(即gydF4y2BaCgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba）;gydF4y2BaCgydF4y2Ba0gydF4y2Ba，浓度外推至原点;gydF4y2BaCgydF4y2BaMax，血药浓度峰值;AUC 0-inf，从时间0到无穷远血浆浓度时间曲线下面积;gydF4y2BaVgydF4y2BaZ，分布体积;CL，血浆总清除率;gydF4y2BaFgydF4y2Ba,生物利用度。gydF4y2BacgydF4y2BaIMT1B稳定小鼠POLRMT。在IMT1B存在或不存在的情况下，使用人(左)或小鼠(右)POLRMT (gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验)。给出了确定的熔化温度。gydF4y2BadgydF4y2Ba， IMT1B在体外以浓度依赖的方式使用小鼠POLRMT抑制启动子依赖的转录。在0-10 μM的IMT1B存在下，在线性LSP和超螺旋圆形LSP模板上进行了体外启动子依赖性转录。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba小鼠每天用载体(veh)或IMT1B (100mg kg)治疗一次gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)．均数±s.e.m.;gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个生物重复，曼-惠特尼gydF4y2BaUgydF4y2Batest，确切显著性，单尾，vehicle-IMT1B)。gydF4y2BafgydF4y2Ba， IMT1B治疗在体内抑制DLD-1异种移植瘤生长。小鼠每日一次，分别给药或IMT1B (100mg kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)．均值±s.e.m，gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个生物重复，曼-惠特尼gydF4y2BaUgydF4y2Batest，确切显著性，单尾，vehicle-IMT1B。gydF4y2BaggydF4y2Ba，在A2780异种移植中，imt1b处理小鼠与载体处理对照组的平均体重。均值±s.e.m，gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个生物重复。gydF4y2BahgydF4y2Ba，治疗4周后，IMT1B治疗未引起急性肝或肾毒性。NMRI小鼠分别用载体或IMT1B口服治疗4周，每天1次。在治疗的第一天(基线)和最后一天(4周IMT)禁食后从尾静脉采血。分析的血液参数包括谷丙转氨酶水平(ALT, U lgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST，在U lgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)，以确定肝毒性以及肌酐(CREA，毫克dlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)以确定肾脏毒性。数据以均数±s.e.m表示，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个生物重复。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， IMT1B治疗不影响IMT治疗后的血计数。雌性NMRI小鼠分别用载体或IMT1B口服治疗4周，每天1次。在实验的最后一天采血，并对上述参数进行分析。数据以mean + s.e.m表示，gydF4y2BangydF4y2Ba= 4个生物重复。MCHC，平均红细胞血红蛋白浓度;MCH，指红细胞血红蛋白;MCV，平均微粒体积。gydF4y2BajgydF4y2Ba，肿瘤、肝脏和心脏线粒体DNA水平(平均值±s.e.m)，gydF4y2BangydF4y2Ba= 8个生物重复)。gydF4y2BakgydF4y2Ba，肿瘤组织裂解物中磷酸化AMPK和核糖体S6蛋白水平的免疫印迹分析。为了测定总AMPK水平，将样品放在单独的凝胶上并并行处理(每通道20 μg)。一个典型的形象gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验。gydF4y2Ba

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博尼坎普，N.A，彼得，B，海伦，H.S.gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba人类线粒体DNA转录的小分子抑制剂。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba588gydF4y2Ba， 712-716(2020)。https://doi.org/10.1038/s41586-020-03048-zgydF4y2Ba

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