目标搜索过程中的DNA表面探测和操作符绕过gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba结构模型(基于蛋白质数据库(PDB)代码1OSL)。LacI，蓝色和青色;若丹明,绿色;DNA,灰色的。gydF4y2BabgydF4y2Ba，用罗丹明(LacI - r和LacI - mmp - r)或Cy3 (LacI - far)荧光显示去除染料后标记的LacI组分的SDS-PAGE。与LacI-R(左)、LacI-Far(中)和LacI-MBP-R(右)的单体尺寸相对应的带用箭头表示。LacI-R和LacI-MBP-R的单体带强度相对于单体带和二聚带强度之和分别为77%和86%。凝胶源数据请参见gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaxgydF4y2Ba(DNA方向)和gydF4y2BaygydF4y2Ba电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)以50ms帧率跟踪得到的滑动LacI-Far(红色)和LacI-R(蓝色)分子坐标。LacI-Far和LacI-R共捕获了779和409个滑动分子。沿gydF4y2BaxgydF4y2Ba坐标(gydF4y2BaDgydF4y2Ba_xgydF4y2Ba)为平均值±S.E.M.gydF4y2BadgydF4y2Ba， LacI-Far不同时间步长的均方位移(MSD)(红色)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 779滑动分子)和LacI-R(蓝色)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 409个滑动分子)±S.E.M.gydF4y2BaegydF4y2Ba，解离常数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba)的LacI-Far和LacI-R。LacI = 7.3 nM, NaCl = 1 mM。gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba数值计算如下gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba＝gydF4y2BakgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司,gydF4y2Ba}/gydF4y2BakgydF4y2Ba_{,奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}由于速率常数的传播误差而产生的误差。速率常数为平均值±s.e.m (gydF4y2BakgydF4y2Ba_{,奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}，gydF4y2BangydF4y2Ba= LacI-R和LacI-Far分别为248和200个事件;gydF4y2BakgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司,gydF4y2Ba}，gydF4y2BangydF4y2BaLacI-R和LacI-Far分别= 367和322个事件)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，在532 nm(上)(供体激发)和638 nm(下)(受体激发)光照下的受体通道EMCCD图像。个别供体标记的LacI-R分子(上排的个别斑点)的特异性结合发生在存在(+gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2BaDNA;单个点，底部一排;DNA图像是在添加LacI之前获得的，同样的DNA图像显示在第3列和第4列中，以供参考)，但没有(−gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba含有操作位点的受体标记DNA。加入异丙基β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-1-硫半乳糖yranoside (+IPTG)在同一视野内取代特异性结合的LacI。本对照实验进行了一次。gydF4y2BabgydF4y2Ba， LacI-R占用在一个视场的时间痕迹(1,244个人gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2BaDNA分子)。在20秒后提供7.3 nM LacI-R(第一条虚线)，90秒后加入7.3 nM LacI-R和100 mM IPTG。gydF4y2BacgydF4y2Ba，直方图gydF4y2BatgydF4y2Ba_{等待gydF4y2Ba}的值gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba当LacI = 7.3 nM和NaCl = 1 mM或其他时，在不同LacI和NaCl浓度下，分别为310或100个轨迹。gydF4y2BadgydF4y2Ba的直方图gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba的值gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba在LacI-R = 7.3 nM和NaCl = 1 mM(上)和80 mM(下)时，分别为190和184个事件。对，在标准成像条件下(星号标记)测量gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba用于绑定到gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba不受光漂白的影响。的意思是相对的gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba对于特定的绑定gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba从左到右分别为106、146、92和243个单个分子，平均结合时间±s.e.m.)，在NaCl = 1 mM时，使用不同的激光功率密度观察到。停留时间和激光功率密度归一化为所有其他分析使用的标准成像激光功率密度(星号)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，直方图gydF4y2BatgydF4y2Ba_{等待gydF4y2Ba}的值gydF4y2BaOgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}（gydF4y2BangydF4y2Ba= 109个单个分子)，LacI = 7.3 nM, NaCl = 1 mM。gydF4y2BafgydF4y2Ba，左，的直方图gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba的值gydF4y2BaOgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}（gydF4y2BangydF4y2Ba在LacI-R = 7.3 nM和NaCl = 1 mM时= 91个单个分子)。对，在标准成像条件下(用星号标记)，测量gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba用于绑定到gydF4y2BaOgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}不受光漂白的影响。平均相对gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba对于特定的绑定gydF4y2BaOgydF4y2Ba_{3 gydF4y2Ba}（gydF4y2BangydF4y2Ba从左到右分别为79、196、83和107个单个分子，平均结合时间±s.e.m.)，在NaCl = 1 mM时，使用不同的激光功率密度观察到。停留时间和激光功率密度归一化为所有其他分析使用的标准成像激光功率密度(星号)。gydF4y2BaggydF4y2Ba，均值的依赖关系gydF4y2BatgydF4y2Ba_{等待gydF4y2Ba}(左)和gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba(右)在NaCl (LacI-R = 7.3 nM)浓度上的结合值。gydF4y2BatgydF4y2Ba_{等待gydF4y2Ba}(左),gydF4y2BangydF4y2Ba当NaCl = 1 mM或所有其他条件时，分别为130或100个单个分子;gydF4y2BatgydF4y2Ba_住gydF4y2Ba(右)gydF4y2BangydF4y2Ba从左到右分别为190、164、164、82、184和153个分子。数据以均数±s.e.m表示。gydF4y2Ba

左，六种不同LacI-R结合状态的卡通示意图(gydF4y2Ba补充的方法gydF4y2Ba)用具有两个外部的结构来观察gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba网站。不同状态之间的转换用箭头表示。右，在不同LacI-R浓度下观察到的切换速率，归一化到LacI-R浓度为0.9 nM，(星号，用于确定图中所示的所有切换速率。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，处于不受多个LacI分子占用影响的浓度状态。误差估计代表s.e.m (gydF4y2BangydF4y2Ba从左到右分别为22720、12408、13714和3601个分子)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba、CNBr裂解肽后LacI-R和LacI-Cy3-2的SDS-PAGE分析。LacI-R被设计用于双功能标记(罗丹明附着在两个相邻的Cys残基上)，LacI-Cy3-2用于同一α-螺旋的单功能标记(仅使用两个Cys中的一个)。Precision Plus Protein Dual Xtra standard (Bio-Rad)被用作两种凝胶的阶梯。实验至少重复了三次。凝胶源数据请参见gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba．gydF4y2BabgydF4y2Ba，基于相机偏振测量的设置原理图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(蓝色)和gydF4y2BaPgydF4y2Ba_45gydF4y2Ba(红色)偏振分布平均超过600毫秒(3帧)每计数测量滑动LacI-R(左)(79和172滑动事件gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPgydF4y2Ba_45gydF4y2Ba，分别)和LacI-Cy3(右)(61和53滑动事件gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPgydF4y2Ba_45gydF4y2Ba分别)。为gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba测量时，水平极化轴与DNA拉伸方向对齐;为gydF4y2BaPgydF4y2Ba_45gydF4y2Ba测量时，水平极化轴旋转45°远离DNA的拉伸方向。详情载于gydF4y2Ba补充的方法gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，均匀(gydF4y2BadgydF4y2Ba)，线性(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和旋转耦合(gydF4y2BafgydF4y2Ba)滑动模型。gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba，平均值±s.e.m. (gydF4y2BaggydF4y2Ba)和s.d.±s.e. (gydF4y2BahgydF4y2Ba)的实验极化分布gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba．从左到右，gydF4y2BangydF4y2Ba= 800、16606、887、673、78和104个极化信号平均超过600 ms时间步长。误差条表示s.e.m。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，用于操作者结合极化测量的7 kb DNA示意图(上)和LacI-R结合到人工的EMCCD图像，强gydF4y2BaOgydF4y2Ba_{信谊gydF4y2Ba}流拉伸DNA上的算子，其中检测到11个结合事件进行测量gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(底部)。gydF4y2BajgydF4y2Ba，gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(蓝色)和gydF4y2BaPgydF4y2Ba_45gydF4y2Ba(红色)偏振分布平均超过600毫秒(3帧)，每次计数测量的操作约束LacI-R。检测到11和15个结合事件的测量gydF4y2BaPgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPgydF4y2Ba_45gydF4y2Ba,分别。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba荧光偏振显微镜和单分子共聚焦跟踪联合系统的光学布局。在激发路径中，偏光器后面放置半波片(HWP)和四分之一波片(QWP)，在物镜上产生圆偏振光。APD，雪崩光电二极管;DM，二向色镜;HWP，半波板;PBS，偏振分束器;QWP，四分之一波板。gydF4y2BabgydF4y2Ba，以固定化荧光珠为平台，测试实时跟踪系统的跟踪能力。仿真结果表明，该平台绕直径为2.8 μm的圆运动，光子计数率平均为24 kc sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(18 kc sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}包括激光休息时间)。每个灰色区域代表1秒的旋转，然后是800毫秒的暂停。在每个暂停部分，定位sd为20nm，并包括来自其反馈回路的级噪声。gydF4y2BacgydF4y2Ba如图b所示，该图描述了20 ns时的高后脉冲峰值，在500 ns后迅速下降并变平。灰色区域对应于图中为acf绘制的时间区域。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba．1ms后出现振荡，这是由4ms仪器跟踪周期引起的。自相关曲线在这里补偿了每500 μs测量之间166 μs的测量中断时间。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba(左)gydF4y2BaxgydF4y2Ba(DNA方向)和gydF4y2BaygydF4y2Ba共聚焦跟踪得到的滑动LacI-MBP-R(蓝色)和LacI-R(红色)分子坐标。LacI-MBP-R和LacI-R总共捕获了151和90个滑动分子。沿的平均扩散常数gydF4y2BaxgydF4y2Ba坐标为0.027±0.001 μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}0.035±0.002 μmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．扩散常数表示为20%修剪后的平均值±s.e.m。对，LacI-MBP-R不同时间步的均方位移(蓝色)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 151个滑动分子)和LacI-R(红色)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 90个滑动分子)±S.E.M.gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaxgydF4y2Ba(DNA方向)和gydF4y2BaygydF4y2Ba通过共聚焦跟踪得到的静止LacI-MBP-R(蓝色)和LacI-R(红色)分子坐标。为了清晰起见，为每个LacI物种显示了100个代表性的轨迹。总共检测到3773和1594个LacI-MBP-R和LacI-R固定分子。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，来自模拟自相关的音调估计，作为不同背景振幅的模拟中使用的音调的函数。gydF4y2BabgydF4y2Ba，对于不同的音调，音调估计误差是背景振幅的函数。只考虑与图中观察到的实验结果相关的模拟结果。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，仅报告了9到75 bp之间的估计音调，并且当模拟自相关差异的最大距离(振幅)至少是观测到的实验差异振幅的50%时的值。gydF4y2BacgydF4y2Ba，滑动(左)和静止(右)LacI-MBP-R(蓝色)和LacI-R(红色)分子的荧光信号的平均归一化自相关性，当数据被合并为两个系列时(当数据被捕获时按时间顺序分开)，用于较早(上)和较晚(下)记录的数据。报告的扩散常数是每个系列中所有跟踪分子的平均值。误差条和误差估计代表s.e.。扩散常数表示为20%修剪后的平均值±s.e.m。对于第一个实验系列，LacI-MBP-R分析了69个滑动分子和2758个静止分子，LacI-R分析了36个滑动分子和903个静止分子。在第二个实验系列中，laci - mmp - r分析了82个滑动分子和1015个静止分子，LacI-R分析了54个滑动分子和691个静止分子。中间，LacI-MBP-R和LacI-R±s.e.之间的平均自相关的差异。线代表旋转耦合滑动模型的最佳拟合。gydF4y2BadgydF4y2Ba，复制实验数据集和滤波步骤的模拟自相关的差异。红点表示自相关差异。计算得到的道数、平均道长和平均光子数与实验一致，旋转扩散常数为实验拟合值。平均和期望标准差(蓝色交叉)被计算为60个单独模拟的平均值和标准差。实验(黑钻)的均值和标准差估计如图所示。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2BaLacI-MBP-R和LacI-R的信息自相关分别为86和54)。gydF4y2Ba

来自模拟的模型参数，与观察到的两个外部转换速率相兼容gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba有(蓝色)和没有(紫色)内部介入的操作符gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba操作符，并且与同一操作符上的翻转方向兼容(橙色)。在给定实验数据的情况下，用参数的概率密度对表面的透明度值进行缩放。由四种不同的联合概率密度计算的平均跳长的均值和标准误差gydF4y2BakgydF4y2Ba_在gydF4y2Ba，gydF4y2Ba_μgydF4y2Ba从左到右分别为:22±16bp、18±11bp、16±8bp和18±12bp。的值增加，翻转速率面不减小gydF4y2BakgydF4y2Ba_从gydF4y2Ba，gydF4y2Ba_μgydF4y2Ba，因为模拟产生了最大可能的翻转速率。换句话说，对应于较高的最大翻转速率的参数也可能产生较低的实际翻转速率。虽然gydF4y2BakgydF4y2Ba_在gydF4y2Ba，gydF4y2Ba_μgydF4y2Ba在这些模拟中有限且固定在四个不同的水平，gydF4y2BakgydF4y2Ba_在gydF4y2Ba，gydF4y2Ba_μgydF4y2Ba在图中显示和使用的模拟中为无穷大。gydF4y2Ba4汉英gydF4y2Ba．样本量为gydF4y2BangydF4y2Ba= 1108, 574和699个单个分子gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba会,gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba开关速率，LacI-R翻转速率和gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-gydF4y2BaOgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba分别为开关速率。gydF4y2Ba