一个完整的人类X染色体端粒到端粒的组装gydF4y2Ba

完整的端粒到端粒参考基因组组装是必要的，以确保所有的基因组变体被发现和研究。目前，人类基因组中尚未解决的区域是由位于染色体周围区域的多兆酶卫星阵列和位于染色体末端短臂上的核糖体DNA阵列，以及长度大于数百千碱基的片段重复丰富的区域来定义的，这些区域在对位序列之间显示出超过98%的序列一致性。由于缺乏参考文献，这些富含重复序列经常被排除在遗传学和基因组学研究之外，这限制了关联和功能分析的范围gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}．未解决的重复序列也会导致意想不到的后果;例如，副同源序列变异被错误地称为等位变异gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba以及细菌基因数据库的污染gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba．完整的人类基因组有望有助于我们对染色体功能的理解gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba，人类疾病gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba以及基因组变异，这将改善生物医学中使用短读映射到参考基因组的技术(例如RNA测序(RNA-seq))gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba，染色质免疫沉淀，测序(ChIP-seq)gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba利用测序(ATAC-seq)测定转座酶可及染色质gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

从许多相对较短的测序读数(称为基因组组装)重建基因组的根本挑战是将重复序列彼此区分开来gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba．解决这种重复依赖于测序读取足够长，以跨越整个重复或准确到区分每个重复副本的基础上的唯一变体gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba．2001年首次公开的人类基因组在20年后仍未完成，这突显了组装问题的困难和过去技术的局限性gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba．美国国家生物技术信息中心(NCBI Build 28)发布的第一个人类参考基因组高度碎片化，一半的基因组包含在500kb或更多的连续序列(contigs)中(NG50)。努力完成基因组gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba，以及基因组参考联盟(GRC)的管理工作gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba这大大增加了最近发布的grch38中NG50 contig长度为56 Mb的引用的连续性，但基因组中最重复的区域仍然没有解决，没有染色体是完全代表端粒到端粒的。超长(大于100 kb)纳米孔读数的从头组装在最困难的区域显示出有希望的组装连续性gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba但是这个概念验证项目对基因组的测序只有5倍的覆盖深度，并且未能组装最大的人类基因组重复序列。先前基于人类基因组中大重复序列的大小和分布进行的建模预测，30×超长reads的组装将接近人类参考序列的连续性gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．因此，我们假设高覆盖率超长读取纳米孔测序将使人类染色体的第一次完整组装成为可能。gydF4y2Ba

为了避免组装二倍体基因组的两种单倍型的复杂性，我们选择了有效的单倍体CHM13hTERT细胞系进行测序(以下简称CHM13)。gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．该细胞系来源于一个完整的葡萄胎(CHM)，核型为46,XX。这种子宫痣的基因组来源于一个经历了减数分裂后染色体复制的单一精子;因此，对于一组等位基因来说，这些基因组是均匀纯合的。CHM13以前曾被用于修补人类参考中的空白gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba、基准基因组组装器和二倍体变体调用器gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba，并研究人类片段复制gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．CHM13系的核型分析证实为稳定的46,XX核型，没有可观察到的染色体异常。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．最大似然混合分析gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba有信心地将大多数单倍型确定为欧洲起源，有可能是一些亚洲或美洲印第安人的混合物(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

从CHM13细胞中提取高分子量DNA，并使用先前描述的超长读取方案制备纳米孔测序gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．我们总共测序了98个MinION流单元，总容量为155 Gb (50×覆盖率，每个流单元1.6 Gb，补充说明gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．所有测序的碱基中有一半包含在70 kb或更长的reads中(78 Gb, 25×基因组覆盖)，最长的验证reads为1.04 Mb。一旦我们收集到足够的从头组装测序覆盖，我们将39×覆盖的超长reads与70×覆盖的先前生成的PacBio数据结合起来，并使用Canu组装CHM13基因组gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．Canu选择了最长的30×-coverage ultra-long和7×-coverage PacBio reads进行校正和组装。这个初始组装的总长度为2.90 Gb，其中一半的基因组包含在长度为75 Mb或更大的连续序列(contigs)中(NG50)，这超过了GRCh38参考基因组的连续性(NG50为75 Mb, NG50为56 Mb)。然后，通过一系列测序技术(nanoore、PacBio和链接读取Illumina)对该组装进行迭代优化。共识精度从初始装配的99.46%提高到经过Nanopore抛光的99.67%，经过PacBio抛光的99.99%。Illumina数据仅用于纠正基因组中唯一可映射区域的小插入和删除错误，这对平均精度有边际影响，但减少了帧移基因的数量。通过分析未用于初始装配的Illumina链接读取条形码(10X Genomics)和光学映射(Bionano Genomics)数据，确定了假定的误装配。最初的contigs在低映射覆盖区域被破坏，然后使用光学映射对校正后的contigs进行排序和相对定向。超过90%的6条染色体在2个contigs中表示，10条染色体由2个支架表示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

最终组装由448个contigs中的2.94 Gb组成，其中contig NG50为70 Mb。共有98个支架(173个contigs)被明确分配到一条参考染色体上，代表了组装碱基的98%。基于之前完成的两个BAC序列，我们估计该全基因组组装的一致准确性中位数至少为99.99%gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba和映射的Illumina链接读取(补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．虽然与GRCh38未加壳长度(2.95 Gb)相似，但我们的组装大小比估计的人类基因组大小3.2 Gb短。我们使用段复制汇编器(SDA)方法估计大约170 Mb的崩溃基gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba．与最近的其他组装相比，我们解析了更大比例的341个CHM13细菌人工染色体(BAC)序列，这些序列之前已经从基因组的分段复制和其他难以组装的区域中分离和完成gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．我们的全基因组组装的比较注释也表明，与以前的组装相比，映射转录本的一致性更高，与GRCh38相比，潜在的框架转移率仅略有增加gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba．在CHM13 de novo组合中注释的19,618个蛋白质编码基因中，只有170个(0.86%)包含预测的移码，或者，如果通过转录本测量，83,332个转录本中只有334个(0.40%)包含预测的移码(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．当被用作调用其他基因组中的结构变异的参考序列时，CHM13报告了插入和删除调用的平衡(扩展数据图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，正如预期的那样，而GRCh38显示出删除偏倚，如先前报道的那样gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba．与其他长读程序集相比，GRCh38调用的反转次数是CHM13的两倍(平均每个基因组26次对13次反转)，这表明一些定向错误的序列仍然存在于当前的人类参考中(补充说明)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在这些倒置中，有19个是GRCh38特异性的，而在最近组装的5个长读人类基因组中没有发现(补充表)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．我们在组装和读取中识别了端粒序列(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，它们在端粒大小上高度一致，并且我们的组装在contig末端包括46个预期端粒中的41个。因此，在连续性、完整性和正确性方面，我们的CHM13组装体通过一些质量指标超过了所有以前的人类从头组装体——包括当前的人类参考基因组(补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

以这种全基因组组装为基础，我们选择了X染色体进行人工整理和验证，因为它在初始组装时具有较高的连续性;独特且特征良好的中心点阿尔法卫星阵列gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}；开发过程中的独特行为gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba；以及与孟德尔病的比例失调gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．X染色体的从头组装在三个地方被破坏:着丝粒和两个几乎相同的大于100 kb的片段重复(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．通过识别完全跨越重复的超长读取，并在两侧唯一锚定，手动解决了破坏组件的两个片段重复，从而允许在组件中有一个自信的位置。通过映射从CHM13生成的PacBio高保真(HiFi)长读取的正交集来评估这些困难区域的组装质量的改进gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba以及评估信息性单核苷酸变异差异的阅读深度(方法)。此外，采用液滴数字PCR (ddPCR)的实验验证证实，现在完整的组装正确地代表了CHM13基因组的串联重复序列，包括7个CT47基因(7.02±0.34 (mean±s.d.))， 6个CT45基因(6.11±0.38)，19个完整和2个部分GAGE基因(19.9±0.745)，55个DXZ4重复序列(55.4±2.09)和3.1 mb的中心体DXZ1阵列(1408±40.69 2,057 bp重复序列)(补充注)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

先前对X染色体上单倍体着丝粒卫星阵列(DXZ1)的高分辨率研究为我们目前的人类着丝粒组织基因组模型提供了信息gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba．与所有正常的人类着丝粒一样，X着丝粒在序列水平上由α卫星dna定义——一个富含at(约171 bp)的串联重复，或“单体”。gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．DXZ1阵列的标准重复是由12个分散的单体定义的，这些单体被有序地形成一个约2 kb的更大的重复单元，这被称为“高阶重复”(HOR)。gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba}．HORs被串联排列成一个大型的、多兆字节大小的卫星阵列(即2.2-3.7 Mb;平均3,010 KB (s.d = 429，gydF4y2BangydF4y2Ba= 49))gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba重复副本之间的核苷酸差异有限gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}．这些之前的评估被用来指导我们对DXZ1组件的评估，并提供了既定的实验方法来评估DXZ1阵列的结构gydF4y2Ba^{25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．为了组装X着丝粒，我们在经典DXZ1重复单元内构建了一个结构和单核苷酸变体目录(约2 kb)gydF4y2Ba^{28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba}并使用这些变体作为路标gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba在整个中心点卫星阵列(DXZ1)上唯一地平铺超长读取(扩展数据图。gydF4y2Ba5中gydF4y2Ba)，就像之前对Y着丝粒所做的那样gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba．通过脉冲场凝胶电泳(PFGE) Southern blotting估计DXZ1阵列在大约2.8-3.1 Mb的范围内(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，得到的约束轮廓与预测的阵列组件结构一致(图2)。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba)．ddPCR对DXZ1重复序列的拷贝数估计与PFGE Southern blotting之前大小的阵列面板进行了比较，并进一步支持了约2.8 Mb(1408±81.38)个2057 kb标准重复序列的拷贝数。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba，补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．此外，DXZ1结构变异频率与PacBio HiFi数据的直接比较高度一致gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

当前的长读取程序集需要严格的共识抛光，以实现最大的基本调用精度gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba}．给定每个读取点在组件中的位置，这些抛光工具对底层信号数据进行统计建模，以对每个测序碱基进行准确预测。这个过程的关键是每次阅读的正确位置，这将有助于抛光。由于模糊的读映射，我们最初的抛光尝试降低了最大的x染色体重复中的组装质量(扩展数据图。gydF4y2Ba7 a、bgydF4y2Ba)．为了克服这一问题，我们分析了Illumina测序数据，编目了CHM13 X染色体上的短(21 bp)、唯一(单拷贝)序列(扩展数据图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．即使在最大的重复序列阵列中，如DXZ1，重复拷贝之间也有足够的变化，以半规则的间隔诱导独特的21-mer标记(图2)。gydF4y2Ba2 e, fgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．这些标记被用来告知长x染色体在组装中的正确位置(方法)。每种技术进行两轮迭代抛光;首先是Oxford Nanopore，然后是PacBio，最后是Illumina链接阅读gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba，并且在每一轮之后，共识的准确性都有所提高。Illumina数据太短，无法使用唯一的标记来确定，只能用于抛光映射明确的唯一区域。这种精心的抛光过程被证明是精确完成超过纳米孔和PacBio读取长度的x染色体重复的关键。gydF4y2Ba

我们手工完成的x染色体组装是完整的，无间隙的，根据x特异性BACs估计准确率为99.991%，根据Illumina数据映射准确率为99.995%。有明确的支持99.9%的装配基地(补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，以符合已完成基因组序列的原始百慕大标准gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．预测最大重复序列(如DXZ1卫星阵列)的准确度略低(中位数识别率99.3%)，但由于缺乏来自这些区域的BAC克隆，这很难测量。映射的长读和光学映射数据显示完整的X染色体覆盖均匀，在可映射区域没有结构错误的证据(图2)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba8 b, cgydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，以及Strand-seq数据证实没有任何反转错误gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba8 d, egydF4y2Ba)．通过长读映射的单核苷酸变体调用显示，在大量串联重复的GAGE和CT47基因家族中，初始组装质量较低，但这些问题通过优化和超长读映射和光学映射得到了解决(图2)。gydF4y2Ba1 c, dgydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba7 c-jgydF4y2Ba，补充表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．通过TandemQUAST测量，DXZ1阵列映射的长读覆盖显示了均匀的覆盖深度和高精度gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 e fgydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baj,gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．我们识别了所有与DXZ1重复序列匹配的高保真读数。所有的读数——除了一个大的，可能是错误的均聚物——都被我们的重建解释了，证实了DXZ1阵列的完整性。整个X染色体的覆盖范围是均匀的，只有一小部分碱基的覆盖范围比平均值高出三个标准差(0.44% Nanopore, 0.77% PacBio continuous long reads (CLR)， 2.4% HiFi)。低覆盖的HiFi区域因其较低的唯一标记密度而富集，这使得它们由于长度相对较短而难以分配(补充说明)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．此外，变量调用没有从HiFi或CLR数据中识别出高频变量，只从超长读取数据中识别出低复杂度变量，这些变量可能代表超长读取数据中的错误，而不是真正的装配错误。我们完整的端粒到端粒版本的X染色体完全解决了29个参考空白gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba，总计1,147,861 bp之前的模糊碱基(n -碱基)。gydF4y2Ba

纳米孔测序对甲基化碱基敏感，正如原始电信号的调制所揭示的那样gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba．精确锚定的超长reads提供了一种新的方法来分析重复区域的甲基化模式，这通常很难用短读测序来检测。X染色体具有许多人类基因组中独一无二的表观基因组特征。X染色体失活，其中一个女性X染色体在发育早期沉默，并在体细胞组织中保持不活跃，预计将提供一个独特的甲基化染色体范围。与之前的研究一致gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba，我们观察到位于x染色体臂两端尖端的大多数假常染色体区域(PAR1和PAR2)甲基化下降(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．失活的X染色体也采用了不寻常的空间构象和，与先前的研究一致gydF4y2Ba^{44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba}CHM13染色体构象捕获(Hi-C)数据支持在宏卫星重复序列DXZ4上划分的两个大的超域(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在对DXZ4阵列的进一步分析中，我们发现了明显的甲基化带(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)，在远端边缘观察到低甲基化，这通常与先前描述的染色质结构一致gydF4y2Ba^46gydF4y2Ba．值得注意的是，我们还在DXZ1着丝粒阵列中发现了一个甲基化降低的区域(约60 kb, chrX: 59,217,708-59,279,205)(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．为了测试这一发现是否只存在于X阵列，或者也存在于其他着丝粒卫星上，我们在8号染色体(D8Z2)上手工组装了一个约2.02 Mb的着丝粒阵列。gydF4y2Ba^{47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba}并使用相同的唯一标记映射策略在数组中自信地锚定长读取(G.A.L.等人，手稿正在准备中)。在此过程中，我们在D8Z2阵列中发现了另一个低甲基化区域，与我们在DXZ1阵列上的观察相似(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，这进一步证明了我们的超长读取映射策略能够提供基本水平的染色体范围DNA甲基化图。还需要进一步的研究来验证这一发现，并评估这些甲基化模式的潜在重要性(如果有的话)。gydF4y2Ba

人类染色体端粒到端粒的完整组装表明，现在有可能使用现有技术完成整个人类基因组。虽然我们在这里的重点是完成X染色体，但我们的全基因组组装已经重建了其他几条染色体，只剩下一些空白，并且可以作为完成其他染色体的基础。然而，仍有许多挑战需要克服。例如，将这些方法应用于二倍体样本将需要对潜在的单倍型进行分期，以避免复杂结构变异的混合区域。我们对其他染色体的初步分析表明，比X染色体大的重复区域和着丝粒卫星将需要开发更多的方法gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba．这尤其适用于人类的末端染色体，其大量的卫星阵列和片段复制尚未在序列水平上得到解决。此外，图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba突出显示了预计非同源染色体之间序列相似的着丝粒卫星阵列。像这样的阵列需要在染色体之间和染色体内部进行相控。gydF4y2Ba

完成人类基因组将随着这些剩余挑战的解决而继续进行，从相对容易组装的染色体(例如，3、6、8、10、11、12、17、18和20)开始，最终以包含大块经典人类卫星染色体(1、9和16)和末端染色体(13、14、15、21和22)的染色体结束。在短期内，CHM13基因组中闭合的参考缺口将使用GRC现有的“补丁”基础设施整合到GRCh38中。一旦所有CHM13染色体完成，我们计划将其提供给GRC，作为一个新的、完全无间隙的参考基因组发布的基础，这可能是当前参考序列与CHM13序列在最困难区域的马赛克。最终完成GRC人类参考基因组的努力将有助于推进必要的技术，实现我们的最终目标，即所有人类基因组的完整、端粒到端粒的二倍体组装。gydF4y2Ba

数据报告gydF4y2Ba

没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估期间没有对分配盲目。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

完整葡萄胎CHM13的细胞最初是从马吉妇女医院(匹兹堡)的一例葡萄胎中培养出来的，这是21世纪初进行的一项研究的一部分(IRB mh -20-054)。同时，培养CHM13细胞，使用Q带核型，随后使用人端粒酶逆转录酶(hTERT)进行永生化。在本研究中，冷冻保存的CHM13细胞在完整的AmnioMax C-100基础培养基(Thermo Fisher Scientific)中解冻培养，并添加1%青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific)，并在37°C的湿度控制环境中生长，95% OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．每三天更换一次新鲜培养基，用于本研究的所有细胞均未超过10代。细胞已鉴定，支原体污染检测呈阴性。gydF4y2Ba

核型分析gydF4y2Ba

中期载玻片制剂取自人葡萄胎细胞系CHM13，并采用前面描述的标准风干技术制备gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba．采用DAPI条带技术根据ISCN鉴定核型中的结构和数量染色体畸变gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．核型分析使用蔡司M2荧光显微镜和应用光谱成像软件(补充注gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

DNA提取，文库制备和测序gydF4y2Ba

从5 × 10中提取高分子量DNAgydF4y2Ba^7gydF4y2BaCHM13细胞使用改良的Sambrook和Russell协议gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba}．文库使用Oxford Nanopore Technologies公司的快速测序试剂盒(SQK-RAD004)和15 μg DNA构建。初始反应通常分为三部分进行加载，并加入FRA缓冲液(104 mM Tris pH 8.0, 233 mM NaCl)，使体积达到21 ul。这些反应在4°C下孵育48小时，以使缓冲液在加载前达到平衡。大多数测序在nanoore GridION上使用FLO-MIN106或FLO-MIN106D R9流池进行，只有一个Flongle流池用于测试。在初始组装中使用的测序读数是测序仪上的第一个碱基。在收集了所有数据后，读取数据再次使用最新的Guppy算法(v.2.3.1中启用了' flip-flop '模型)进行基调用。gydF4y2Ba

根据制造商的协议，使用10X Genomics Chromium设备和Chromium Reagent Kit v.2，从1ng高分子量基因组DNA制备了10X Genomics链接阅读基因组文库。该文库在Illumina NovaSeq 6000 DNA测序仪上对S4流式细胞进行测序，产生5.86亿对端151碱基reads。采用RTA 3.3.3和bwa 0.7.12对原始数据进行处理gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．由此产生的分子大小被计算为来自超新星的130.6 kbgydF4y2Ba^55gydF4y2Ba组装。gydF4y2Ba

使用“Bionano Prep细胞培养DNA分离方案”制备DNA。收集细胞后，在植入琼脂糖之前，将细胞进行多次清洗。进行蛋白酶K消化，随后进行额外的洗涤和琼脂糖消化。使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒和CHEF凝胶对DNA的数量和质量进行评估。按照Bionano Prep直接标记和染色(DLS)方案标记和染色750 ng的DNA。染色后，使用Qubit dsDNA HS Assay试剂盒对DNA进行量化，并在Saphyr芯片上运行。gydF4y2Ba

Hi-C文库由Arima Genomics使用四种限制性内切酶复制生成。经过修饰的染色质消化后，标记消化的末端，近端结扎，然后纯化近端结扎的DNA。在Arima-HiC方案后，通过首先剪切然后使用SPRI珠选择大小的DNA片段制备illumina兼容的测序文库。使用Arima-HiC试剂盒中提供的Enrichment Beads对含有连接连接的大小选择片段进行富集，并使用Swift Accel-NGS 2S Plus试剂盒(P/N: 21024)试剂将其转化为illumina兼容的测序文库。连接接头后，用pcr扩增DNA，用SPRI珠纯化。纯化的DNA经过标准质量控制(qPCR和Bioanalyzer)，并按照制造商的方案在HiSeq X上测序。gydF4y2Ba

纳米孔和PacBio全基因组组装gydF4y2Ba

Canu v.1.7.1gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba使用2018年11月7日或之前生成的所有rel1 Oxford Nanopore数据(on-instrument basecaller, rel1)和2014年和2015年生成的PacBio序列(Sequence Read Archive (SRA): PRJNA269593)(总覆盖率为70倍)运行。gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba}．装配中的一些染色体仅在着丝粒区被破坏(例如，chr10, chr12, chr18等)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．尽管几个着丝粒之间存在明显的连续性(例如chr8、chr11和chrX)，但组装者报告的重复拷贝数量远低于预期。gydF4y2Ba

手动封缝gydF4y2Ba

X染色体上的缺口是通过将所有读对装配进行映射，并手动识别不包括在自动Canu装配中的连接contigs的读来关闭的。这产生了一个初始的候选染色体集合，除了着丝粒。候选装配的四个区域被发现与Bionano光学图在结构上不一致，并通过手动从这些区域中选择读取值并使用Canu进行局部重组来纠正gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba和Flye v.2.4gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．低覆盖率的长读数自信地横跨整个重复区域，用于指导和评估可用的最终装配。使用hmm (v.3)评估重组版本和跨读之间的拷贝数和重复组织gydF4y2Ba^{58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba}在特定的串联重复单元上进行训练，并手动比较所报告的结构。Minimap2的默认参数gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba导致不均匀的覆盖和抛光精度在串联重复序列。通过将Minimap2 -r参数从500增加到10,000，并将报告的次要对准的最大数量(-N)从5增加到50，成功地解决了这个问题。通过PacBio数据集(CLR和HiFi)的映射来确定重复基本水平质量的最终评估(扩展数据图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

X着丝粒中的α卫星阵列，由于其在男性基因组中作为单倍体阵列的可用性，是基因组水平上研究最好的着丝粒区域之一，具有明确的2-kb重复单位gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba物理和基因图谱gydF4y2Ba^{8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}以及数组长度的预期范围gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba．我们最初生成了一个包含超长reads的alpha卫星数据库，通过用至少一个完整的一致序列标记这些readsgydF4y2Ba^33gydF4y2Ba在两个方向都有171bp的标准重复，如前所述gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．反向补全含有alpha的Reads，并使用2057 bp DXZ1重复单元用HMMER (v.3)筛选。然后，我们使用运行长度编码，其中2057 bp标准重复(定义为最小值:1957 bp，最大值:2157 bp范围内的任何重复)的运行被存储为单个数据值和计数，而不是原始运行。这允许我们将所有的读取重新定义为一系列的变体或重复，它们在大小或结构上与预期的规范重复单元不同，并在两者之间定义一个间隔。在超长读取数据中鉴定出的CHM13 DXZ1结构变异与先前发表的PacBio (CLRgydF4y2Ba^50gydF4y2Ba和音响系统gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba)使用Alpha-CENTAURI，如所述gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．结构变量的输出注释和每个读取的规范DXZ1间距被手动聚类以生成六个初始contig，其中两个已知锚定在相邻的Xp或Xq中。为了定义contigs之间的顺序和重叠，我们在从CRISPR-Cas9 Duplex-seq (CRISPR-DS)靶向重测序中获得的高质量DXZ1阵列数据中确定了所有精确匹配的21个mersgydF4y2Ba^62gydF4y2Ba(补充注gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．两个或多个21-mer之间的重叠以相等的间距指导了组装的组织。附加超长读覆盖支持contig间距(和contig结构)的正交验证，为除三个区域外的所有区域提供了高置信的重复单元计数。gydF4y2Ba

X染色体长读抛光gydF4y2Ba

我们使用了一种新颖的映射管道，使用唯一的标记在重复中放置读取。长度gydF4y2BakgydF4y2Ba子(gydF4y2BakgydF4y2Ba-mers)是从Illumina的链接reads中收集的，在修剪条形码(成对的第一个reads的前23个碱基)后。读取数据被放置在与读取数据具有最独特标记的程序集的位置。进一步筛选以排除短的和低身份的队列。这一过程在每一轮抛光后重复，在每一轮抛光后重新计算新的唯一标记和对齐。抛光过程先进行一轮Racon，然后是两轮Nanopolish和两轮Arrow。抛光后，所有先前标记的低质量基因座都显示出显著改善，除了139-140.3的覆盖率仍有下降，并被Canu使用PacBio HiFi数据生成的替代补丁组件所取代。gydF4y2Ba

全基因组长读抛光gydF4y2Ba

整个基因组的其余部分被打磨得与X染色体类似，但没有使用uniquegydF4y2BakgydF4y2Ba- m锚定。相反，使用上述参数运行了两轮Nanopolish，然后是两轮Arrow，这些参数依赖于映射质量和长度以及身份阈值来确定长读取的最佳位置。由于没有一致的努力来正确地在X染色体以外的染色体上组装大型卫星阵列，这种默认的抛光方法被认为对基因组的其余部分足够了。然而，未来的努力，以完成这些剩余的染色体，预计将受益于独特的gydF4y2BakgydF4y2Ba-mer锚定映射方法。gydF4y2Ba

全基因组短读抛光gydF4y2Ba

Illumina链接读取被用于整个组装的最终抛光，包括X染色体，但只使用明确的映射和纠正小的插入和删除错误(补充说明gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

甲基化分析gydF4y2Ba

为了测量纳米孔数据中的CpG甲基化，我们使用了NanopolishgydF4y2Ba^63gydF4y2Ba．Nanopolish在纳米孔电流信号上使用隐马尔可夫模型来区分5-甲基胞嘧啶和未甲基胞嘧啶。甲基化调用程序生成一个对数似然值，表示特定位置上甲基化cg与非甲基化cg的概率之比gydF4y2BakgydF4y2Ba- m。接下来，我们使用nanopore_methylation_utilities工具(gydF4y2Bahttps://github.com/isaclee/nanopore-methylation-utilitiesgydF4y2Ba)，它使用2.5的对数似然比作为调用甲基化的阈值gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba．对数似然比大于2.5(甲基化)或小于- 2.5(非甲基化)的CpG位点被认为是高质量的，并被纳入分析。没有任何高质量CpG位点的Reads被排除在后续的甲基化分析中。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba显示了至少一个高质量CpG站点的读取覆盖率。Nanopore_methylation_utilities将甲基化信息集成到比对BAM文件中，以便在IGV的亚硫酸氢盐模式下查看gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba并创建俾斯麦风格的文件，然后我们用R Bioconductor包BSseq (v.1.20.0)进行分析gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba．我们使用BSmooth算法gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba在BSseq包中平滑数据，以估计特定感兴趣区域的甲基化水平。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba