摘要gydF4y2Ba
在哺乳动物中，端粒保护是由必需蛋白TRF2介导的，它结合染色体末端并确保基因组的完整性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．到目前为止，TRF2缺失在所有已测试的细胞类型中导致端到端染色体融合。本研究发现TRF2对小鼠胚胎干细胞(ES)的增殖和存活是不可缺少的。gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba(亦称gydF4y2BaTerf2gydF4y2BaES细胞不表现出端粒融合，可以无限扩展。在对TRF2缺失的反应中，ES细胞表现出一种沉默的DNA损伤反应，其特征是将γ h2ax(而不是53bp1)募集到端粒。为了定义控制ES细胞中这种独特DNA损伤反应的机制，我们进行了crispr - cas9敲除筛选。我们发现trf2缺失的ES细胞对端粒相关蛋白POT1B和染色质重塑因子BRD2有很强的依赖性。POT1B或BRD2与TRF2的共损耗恢复了端粒上的典型DNA损伤反应，导致频繁的端粒融合。我们发现，在ES细胞中TRF2的缺失激活了一个全能性的双细胞阶段转录程序，其中包括高水平的ZSCAN4。我们发现，在TRF2缺失的情况下，ZSCAN4的上调有助于端粒保护。总之，我们的研究结果揭示了在早期发育过程中端粒去保护的独特反应。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢A. Nussenzweig, A. Sfeir, C. Attwooll和Lazzerini Denchi实验室的成员对手稿的讨论和批判性阅读;F. Livak和NCI流式细胞仪核心设备FACS用于辅助流式细胞仪分析;以及S. Shema和CCR Genomics Core对下一代测序实验的帮助。M.M.-P。获威廉·盖伊·福贝克研究基金会奖;T.O.是海伦·海·惠特尼博士后奖学金的获得者。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
作者及隶属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
e.l.d和m.p。构思研究并设计实验;M.M.-P。A.M.L.进行了实验;e.l.d和m.p。分析数据;ok和A.L.产生TRF2条件敲除ES细胞。T.O.和S.R.提供了关键试剂，并协助ES细胞分化研究。e.l.d和m.p。在a.m.l.、T.O.和S.R.的编辑帮助下撰写了手稿gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
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相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba
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同行评审信息gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba感谢Ylli Doksani和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba胚胎干细胞在分化后不能存活。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，显示用于生成胚状体(EBs)和分化的flic的悬挂滴协议的示意图。gydF4y2BabgydF4y2Ba，来自对照和trf2缺失的ES细胞黏附前(左)和诱导分化后3天(右)的胚状体代表图像。实验进行了三次，结果相似。比例尺，400 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba，由trf2富集(对照(续))或trf2缺失ES细胞(OHT)分化而来的胚状体的生长特性通过融合测量。均值和标准差来自于对每种条件下47张图像的分析。gydF4y2BadgydF4y2Ba，多能性标志物OCT4在ES细胞和FLICs中的免疫荧光染色。所示为阳性细胞百分比。实验进行了三次，结果相似。比例尺，10 μm。gydF4y2BaegydF4y2Ba，用于在ES细胞和FLICs中hht介导的TRF2缺失后3周获得单细胞分离物的实验方法示意图。该表总结了接种的细胞数量，获得的菌落数量和分离菌落的TRF2基因型。对结果克隆进行基因分型PCR的一个例子gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba-floxed和gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba无效等位基因gydF4y2Ba1gydF4y2Ba如下所示。未处理的图像在扩展数据图的源数据中提供。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2BafgydF4y2Ba，通过4个杂合胚胎干细胞克隆的合流来测定其生长特性(gydF4y2BaTrf2gydF4y2Baf /gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)(深蓝色)及4个基因敲除克隆(gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)(红色)由中所描述的实验衍生而来gydF4y2BaegydF4y2Ba，亲代胚胎干细胞(gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba/ fgydF4y2Ba)(浅蓝色)。均值和标准差来自于对每个条件下36张图像的分析。gydF4y2Ba
图2端粒去保护后ES细胞中DDR的激活降低。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，在ES细胞和FLICs中，在Cre诱导(OHT)之前或之后，在S824位点磷酸化的KAP1的代表性免疫荧光(p-KAP1)。比例尺，10 μm。p- kap1阳性细胞的百分比在图中和gydF4y2BabgydF4y2Ba．实验对ES细胞进行了两次，结果相似，对FLICs细胞进行了一次。gydF4y2BacgydF4y2Ba、trf2富集(续)和trf2缺乏(OHT) ES细胞中γH2AX(红色)、p-KAP1(粉红色)的代表性免疫荧光染色和端粒DNA的FISH染色(绿色)。图中显示TIF阳性细胞的百分比(左起第三个图)和TIF阳性且p-KAP1阳性细胞的百分比(左起最后一个图)。比例尺，4 μm。gydF4y2BadgydF4y2Ba，含10 γH2AX TIF以上的ES细胞和FLICs百分比。在指定的情况下，用ATM抑制剂治疗trf2精通(续)或trf2缺乏(OHT)细胞。图中的数据面板代表了三个实验。Ns，无显著性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba≥0.05)，*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，单因素方差分析。gydF4y2BaegydF4y2Ba， 53BP1(红色)在trf2 -精通(续)和trf2 -缺乏(OHT) ES细胞和FLICs中端粒DNA(绿色)的定位。这些数据的量化结果见图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba．比例尺，4 μm。gydF4y2BafgydF4y2Ba， Western blotting分析p-KAP1， γH2AX和作为负载对照的微管蛋白。在收集前30分钟，从模拟处理或γ辐照(2.5 Gy)的ES细胞或FLICs中分离蛋白裂解物。gydF4y2BaggydF4y2BaWestern blotting分析p-KAP1或as负载对照微管蛋白的表达。蛋白质裂解物来自未处理或用ATM抑制剂处理的ES细胞，如所示。在指定的地方，用OHT处理细胞以诱导TRF2耗尽，紫外(1200 J / mgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或使用伽玛照射(2.5 Gy)。gydF4y2BahgydF4y2Ba， FLICs(左)和ES细胞(右)中ir诱导损伤后53BP1 DNA损伤灶的消散。细胞用2.5 Gy的γ照射处理，并固定在指定的时间点。0，未处理的对照样品。对于每个时间点，至少对140个核进行评分，并显示在任何给定时间点具有53BP1病灶数量的细胞百分比;详情见补充表格gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图3 trf2缺陷ES细胞中合成致死基因的鉴定。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，来自图中三个独立的CRISPR-Cas9屏幕的散点图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba．用TRF2敲除合成致死的基因用深蓝色圆点标记。对胚胎干细胞至关重要的基因用洋红色的点标记出来。gydF4y2BabgydF4y2Ba，显示重要性评分的热图(gydF4y2BaβgydF4y2Ba13个候选合成致死基因(深蓝色)的-score)，以及之前被描述为ES细胞必需的8个基因gydF4y2Ba31gydF4y2Ba(紫色)，横跨3个独立的实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaPot1bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaBrd2gydF4y2Ba显示基因组组织的基因组位点，预测的CRISPR-Cas9切割位点(剪刀，红色)和蛋白质功能所需的关键域(蓝色)。桑格测序gydF4y2BaPot1bgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba(外显子2)和gydF4y2BaBrd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba(外显子4)显示了不同克隆的分离。为gydF4y2BaPot1bgydF4y2Ba，使用包含多个STOP密码子的修复模板盒。gRNA序列以红色突出显示。gydF4y2Ba
TRF2和POT1A或POT1B的共损耗导致lig4依赖的端到端融合。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba免疫荧光染色为多能性标志物OCT4(绿色)gydF4y2BaPot1bgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBrd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2BaES细胞。所示为阳性细胞百分比。比例尺，10 μm。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BaLig4gydF4y2Ba基因组位点，显示了预测的CRISPR-Cas9切割位点(剪刀，红色)，以及编码必需R278残基的序列gydF4y2Ba32gydF4y2Ba(蓝色)。Sanger测序结果显示基因编辑成功gydF4y2BaLig4gydF4y2Ba4个独立克隆的位点;gRNA序列用红色突出显示。gydF4y2BacgydF4y2Ba，来自特定基因型ES细胞的中期酶。显示参与端粒融合的端粒百分比。总共进行了三个独立的实验。有关数据的详细摘要，请参见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图的源数据。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图5gydF4y2BaPot1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaPot1agydF4y2Ba而且gydF4y2BaBrd2gydF4y2Batrf2缺失细胞的缺失可诱导DDR通路。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba代表IF-FISH的γH2AX(红色)和端粒(绿色)的对照(续)和trf2耗尽(OHT)的ES细胞gydF4y2BaPot1bgydF4y2Ba基因型。量化方法如图所示。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba．比例尺，4 μm。gydF4y2BabgydF4y2Ba，散点图表示所示对照组(续)和trf2耗尽(OHT) ES细胞中端粒融合的分布gydF4y2BaPot1agydF4y2Ba基因型。每个圆点代表在一个中期扩散中端粒融合的百分比。详细信息请参见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图的源数据。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba（gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立实验)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，表示端粒融合在对照(续)和trf2耗尽(OHT)中的分布的散点图。gydF4y2BaPot1agydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba未处理或用ATR抑制剂(ATRi)处理的ES细胞。每个圆点代表在一个中期扩散中端粒融合的百分比。详细信息请参见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图的源数据。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba，源自TRF2-proficient(续)或TRF2-deficient (OHT .)的MetaphasesgydF4y2Ba) Pot1bgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba用ATMi(左)或ATRi(右)处理的ES细胞。端粒融合的百分比是根据每个基因型共有>19个中期来计算的。gydF4y2BaegydF4y2Ba，表示指定基因型和治疗的flic中端粒融合的百分比的图表。总共分析了每个基因型和处理的>30个中期。gydF4y2BafgydF4y2Ba，在存在(续上)或不存在TRF2 (OHT)时，所示基因型的ES细胞中p-KAP1的代表性免疫荧光(红色)。比例尺，10 μm。gydF4y2BaggydF4y2Ba在指定基因型的ES细胞和对照细胞中，响应TRF2耗尽(OHT)的p- kap1阳性细胞的百分比。附加信息gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba是在补充表中提供的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图的源数据。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图6 ZSCAN4有助于trf2缺失细胞的末端保护。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，在ES细胞(左)和分化细胞(FLICs)(右)中响应TRF2缺失的差异表达基因。火山图代表了圆木gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-变换折叠变化(FC) (gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴)和−loggydF4y2Ba2gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba值)(gydF4y2BaygydF4y2Ba轴)。在hht介导的TRF2缺失3天后进行转录谱分析。在最上面的组中，基因下调(gydF4y2BaPgydF4y2BaOHT处理后的< 0.005和FC <−2)被标记为深蓝色圆点，并且上调(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.005和FC >2)用红点标记。底部面板，在2细胞阶段表达的基因标记为紫色，庇护素成分标记为绿色。gydF4y2BabgydF4y2Ba， ZSCAN4C下调后ES细胞中检测到的端粒融合定量(相对于图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．端粒融合分布的散点图。每个圆点代表在一个中期扩散中端粒融合的百分比。具体分析信息请参见补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图的源数据。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba， ZSCAN4C下调不诱导ES细胞分化。ZSCAN4C下调后，对照组和oht处理的ES细胞中多能性标志物OCT4的代表性免疫荧光染色。oct4阳性细胞的百分比如图所示。比例尺，10 μm。gydF4y2BadgydF4y2BaZSCAN4在FLICs中具有代表性的免疫荧光染色，稳定整合了强力环素诱导的ZSCAN4C表达结构(iZSCAN4)。细胞要么不处理(上)，要么用强力霉素诱导gydF4y2BaZscan4cgydF4y2Ba表达式(下)在收集前两天。gydF4y2BaegydF4y2Ba中描述的flicgydF4y2BadgydF4y2Ba多西环素诱导(+)和非多西环素诱导(−)均用OHT处理，4天后采集用于western blot分析。作为对照(续)，使用了不含诱导盒的flic。gydF4y2BafgydF4y2Ba，增长gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba/ fgydF4y2Ba在Cre诱导(OHT)之前或之后，未处理(圆圈)或用强力霉素诱导(倒三角)处理(倒三角)gydF4y2BaZscan4cgydF4y2Ba．均值和标准差来自于对每个条件下49张图像的分析。gydF4y2BaggydF4y2Ba， trf2富集(续)或trf2缺失的FLICs中53BP1(红色)和端粒DNA(绿色)的代表性IF-FISH染色。在采集前7天，用强力霉素(Dox)处理细胞，诱导外源性gydF4y2BaZscan4cgydF4y2Ba．比例尺，4 μm。gydF4y2BahgydF4y2Ba，所示数据的量化gydF4y2BaggydF4y2Ba，端粒处53BP1灶超过10个的细胞被判定为TIF阳性。gydF4y2Ba
图7 trf2缺失的细胞端粒长度增加。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba、代表性的FACS图(gydF4y2BaygydF4y2Ba轴，单元格计数;gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴，PI染色)显示trf2 -精通(续)和trf2 -缺乏(OHT)的flic的细胞周期特征。在采集细胞前，用强力霉素(Dox)处理细胞7天，诱导外源性gydF4y2BaZscan4cgydF4y2Ba．细胞周期G1期为蓝色;黄色为S相;绿色是G2期。无标记峰表明存在多倍体细胞。gydF4y2BabgydF4y2Ba， trf2 -精通染色体端粒长度分布的Q-FISH直方图(gydF4y2BaTrf2gydF4y2Baf /gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)和缺乏trf2 (gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba) ES细胞克隆，如扩展数据图所示。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba．根据端粒FISH探针(PNA-TelC)的荧光强度计算端粒长度。gydF4y2BacgydF4y2Ba，在trf2 -精通的情况下，Flow-FISH定量端粒长度(gydF4y2BaTrf2gydF4y2Baf /gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)和缺乏trf2 (gydF4y2BaTrf2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)胚胎干细胞克隆。上图显示端粒信号强度(PNA-TelC)的分布(gydF4y2BaygydF4y2Ba轴)和DNA含量(DAPI) (gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴)。底部面板显示细胞的分布(gydF4y2BaygydF4y2Ba轴)基于端粒信号强度(gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴)。根据DNA含量将细胞分为G1(浅蓝色)和S/G2(橙色)。注意trf2富集和trf2缺失细胞之间端粒长度的变化。gydF4y2Ba
扩展数据图8 ES细胞独特的端粒保护机制模型。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，体细胞中TRF2缺失反应的DDR概述。ATM激酶响应未封顶的端粒，启动DDR，通过NHEJ途径导致端到端融合。gydF4y2BabgydF4y2BaPOT1A, POT1B和brd2通过抑制ATM和ATR激酶的活性来确保多能小鼠ES细胞的基因组稳定性。因此，轻微的DDR不足以引起端到端融合。gydF4y2BacgydF4y2Bazscan4(一组双细胞特征基因)表达的增加可能导致基于重组的端粒伸长。另外，ZSCAN4依赖的抑制ATM和ATR激酶在缺乏trf2的ES细胞端粒确保端粒的稳定性。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
:本研究中进行的每个实验所分析的染色体数量和检测到的端粒融合的相对数量。在该表中，对所分析的染色体总数进行了统计分析。该表包含与图:1b-c, 3a-b, 4d-f和扩展数据图:4c, 5b-e, 6b相关的数据。用于生成图形的原始数据在源数据文件中。gydF4y2Ba
补充表gydF4y2Ba
补充表2:IF、IF- fish和TIFs分析检测的细胞数量。该表包含了图:1e-f, h-i, 3e-f, 4b和扩展数据图:1d, 2b,d,h, 4a, 5g, 6c,g所示数据的所有独立重复的数据点。gydF4y2Ba
补充表gydF4y2Ba
补充表3在三个独立的实验中，本研究中鉴定的排名最高的基因与TRF2合成致死(合成致死)和在ES细胞中必不可少(无论TRF2状态如何)的重要性得分(β-得分)。采用MAGeCK-MLE模块计算β评分。所有剩余基因的重要性得分可以在源数据文件中找到。gydF4y2Ba
补充表gydF4y2Ba
补充表4:在ESCs (DE_ESCs)和FLICs (DE_FLICs)中检测到oht介导的TRF2缺失时差异表达(DE)的基因列表。使用DESeq2计算折叠变化和p值。gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
关于本文gydF4y2Ba
引用本文gydF4y2Ba
Markiewicz-Potoczny, M.， Lobanova, A.， Loeb, A.M.gydF4y2Baet al。gydF4y2Batrf2介导的端粒保护在多能干细胞中是可有可无的。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba589gydF4y2Ba， 110-115(2021)。https://doi.org/10.1038/s41586-020-2959-4gydF4y2Ba
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