摘要
最近的研究表明,在厌氧微生物中,三羧酸(TCA)循环,包括看似不可逆的柠檬酸合成酶反应,可以被逆转,并用于碳的自养固定1,2.这种逆向氧化TCA循环需要铁氧还原蛋白依赖的2-氧戊二酸合成酶,而不是nadd依赖的脱氢酶,以及极高水平的柠檬酸合成酶(超过细胞中蛋白质的7%)。在这一途径中,柠檬酸合酶取代了还原性TCA循环的atp -柠檬酸裂解酶,这导致每循环周期减少一个atp当量的消耗。这里我们用的是嗜热减硫德尔塔变形杆菌Hippea maritima这一过程是由CO的高分压驱动的2.这些高分压对于丙酮酸合酶催化的乙酰辅酶A(乙酰辅酶A)通过还原羧化反应脱除丙酮酸尤为重要。反氧化TCA循环可能在自养型CO中起作用2固定在原始的大气中,被认为富含CO2.
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确认
我们感谢G. Fuchs在这项工作期间的讨论和对手稿的批判性阅读,感谢W. Schulz在克隆柠檬酸合成酶基因方面的帮助,感谢A. M. Berg和D. Ackermann在技术上的帮助,感谢A. Probst在生物信息学分析方面的帮助。这项工作得到了德国研究基金会(DFG)项目id BE 4822/5-1 (I.A.B.)和项目id 364653263-TRR 235 (W.E.)以及Hans-Fischer Gesellschaft(慕尼黑)(W.E.)的支持
作者信息
作者及隶属关系
贡献
L.S.和E.P.进行了生长实验、酶的克隆、纯化和表征以及酶的测定。L.S进行密码子使用分析和硫化物测定。进行了同位素剖面实验和GC-MS分析h . maritima媒介。S.K.进行了蛋白质组学分析。A.M.进行了系统发育分析和生物能学计算。I.A.B.和W.E.根据其他作者的意见撰写了手稿。l .,密纹唱片,T.M.S点,”栏目,星河准备数据。该手稿由所有合著者审阅并批准。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有利益竞争。
额外的信息
同行评审信息自然感谢William Martin和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。同行评审报告是可用的。
出版商的注意施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。
扩展的数据图形和表格
图2重组柠檬酸合成酶的SDS-PAGE (12.5%)d . acetivoransNi-NTA柱净化后。
M,分子质量标准蛋白质;lane 1, Desace_08345 (2 μg);lane 2, Desace_06860 (2 μg);lane 3, Desace_09325 (2 μg)。它们的预测分子量为49 kDa (Desace_08345)和50 kDa (Desace_06860;Desace_09325)。用考马斯蓝染色。凝胶源数据参见补充图。1.SDS-PAGE分析进行了三次,所有结果都与此处所示相似。
扩展数据图3用质谱法定量蛋白质。
一个通过MAFFT (v.7.452)对柠檬酸合酶异构体的序列部分进行CLUSTAL格式比对,以说明选择用于定量的独特肽。Desace_06 Desace_06860;Desace_08 Desace_08345;Desace_09 Desace_09325。b,利用一维PAGE分离的重组蛋白的胰蛋白酶消化生成每种柠檬酸合成酶的校准曲线。标准溶液注入量(μl,y轴)与MRM实验中MS峰面积(x轴线),由Skyline计算。
扩展数据图4h . maritima生长介质。
一个在混合营养条件下,生长过程中硫化物的产生(CO2H2,年代0和0.2 g l−1酵母提取物)。b、接种后和培养1、2、3 d后培养基中潜在发酵产物和部分氨基酸的浓度。数据为硫化物测定的4个生物重复以及培养基中潜在发酵产物和氨基酸的3个生物重复和3个技术重复的平均值±s.e.m.。
扩展数据图5h . maritima用不同的基质。
一个,增长h . maritima80% H2, 20% co2, 0.2 g l−1酵母提取物5 g l−1醋酸盐,80% N2, 20% co2, 0.2 g l−1酵母提取物5 g l−1醋酸盐,在100% N2, 0.2 g l−1酵母提取物5 g l−1醋酸。b,增长h . maritima80% H2, 20% n2和0.2 g l−1酵母提取物,含80% N2, 20% co2和0.2 g l−1酵母提取物,含100% N2和0.2 g l−1酵母提取物,80% H2和20% CO2, 80% H2, 20% co2和0.2 g l−1酵母提取物。对于所有的生长曲线,数据以三个生物重复的平均值±s.e.m.表示。
图7 rTCA循环变异体、丙酮酸合酶和2-氧戊二酸合酶反应的能量效率对CO的依赖性2浓度。
净方程如下2.roTCA循环(柠檬酸合成酶,如在脱硫科;红色和橙色线):2 CO2(总数)+ NADPH + 2 NADH + 2 Fd红色的+ CoA + ATP↔乙酰-CoA + NADP++ 2 nad++ 2 Fd牛+ adp + p我+ 4小时2O. rTCA循环绿硫细菌(ACL;深蓝线和浅蓝色线):2 CO2(总数)+ NADPH + 2 NADH + 2 Fd红色的+ CoA + 2 ATP↔乙酰-CoA + NADP++ 2 nad++ 2 Fd牛+ 2 adp + 2 p我+ 3小时2O. rTCA循环Hydrogenobacter酸奶(柠檬酸辅酶a合成酶/柠檬酸辅酶a裂解酶和atp依赖性2-羟戊二酸羧化酶;绿色和橄榄色线):2 CO2(总数)+ 3 NADH + 2 Fd红色的+ CoA + 3atp↔乙酰-CoA + 3nad++ 2 Fd牛+ 3 adp + 3 p我+ 2小时2O.富马酸还原酶被认为是nadh依赖性的2.对于铁氧还蛋白,是还原电位°E '为−418 mV,对应于氢/质子对。假设温度为25°C, pH值为7,离子强度为0.1 M. CO2CO的和是多少2(aq)及其水化形式(H2有限公司3., HCO3.−和有限公司3.2−).下d . acetivorans生长条件(55°C, pH值7,2 bar压力,30.15 g l−1盐度),一个CO2分压40%对应147.6 mM CO2,分压为1% ~ 3.7 mM。一个,标准条件(除CO外,所有反应物的浓度为1 M2).b,假设生理代谢产物浓度(0.1 mM NADPH, 0.01 mM NADP)+, 0.1毫米NADH, 1毫米NAD+, 5毫米ATP, 0.5毫米ADP, 10毫米磷酸盐49, 1.07 mM CoA, 0.013 mM乙酰辅酶a2, 0.1 mM Fd红色的, 0.001/0.0001 mM Fd牛(参考文献。3.,50), 0.23 mM琥珀酰辅酶a, 0.44 mM 2-氧戊二酸盐13丙酮酸0.18 mM51).计算是用均衡器完成的52.
图8产甲烷菌和乙酰菌还原乙酰辅酶a途径能量效率对CO的依赖关系2浓度。
产甲烷菌和乙酰菌还原乙酰辅酶a途径的净方程如下2.产甲烷菌(Methanothermobacter marburgiensis;红色和橙色线):2 CO2(总数)+ 4个Fd红色的+ CoA + 2f420H2↔乙酰辅酶a + 4fd牛+ 2 f420+ 5小时2O.乙酰元(醋酸杆菌属woodii;深蓝线和浅蓝色线):2 CO2(总数)+ NADPH + NADH + 4 Fd红色的+ CoA + ATP↔乙酰-CoA + NADP++ NAD++ 4 Fd牛+ adp + p我+ 4小时2O.自由能量变化(ΔG’)在生理条件下通常不足以驱动每摩尔产物合成1 mol ATP,能量的产生需要化学渗透偶联和黄素基电子分叉30.,31.然而,高CO2分压可能使结合CO的混合还原性乙酰辅酶a途径发挥作用2与铁氧还蛋白还原,如产甲烷菌,以及由乙酰辅酶a与底物磷酸化结合形成乙酸,如在乙酰菌中。计算如扩展数据图所示。7.一个,标准条件(除CO外,所有反应物的浓度为1 M2).b,假设生理代谢产物浓度(0.1 mM NADPH, 0.01 mM NADP)+, 0.1毫米NADH, 1毫米NAD+, 5 mM ATP, 0.5 mM ADP, 0.1 mM还原辅酶F420, 0.1 mM氧化辅酶F420, 10 mM磷酸盐49, 0.28 mM CoA, 0.0104 mM乙酰辅酶a51, 0.1 mM Fd红色的, 0.001/0.0001 mM Fd牛(参考文献。3.,50).
补充信息
补充信息
该文件包含补充表2、3、4、5、6、7、8、10、补充讨论和补充参考。
补充图1
扩展数据的凝胶源数据图2。
补充表1
细胞裂解物的蛋白质组表达数据d . acetivorans生长在自养(CO2+ H2+ S0)和异养(乙酸+ CO2+ S0)条件。所示为含有单向方差分析的Progenesis QIP生成的处理输出P值,问值和功率以及进一步的参数,如唯一肽的数量。为了提高视觉效果,根据p = 0.05和折叠值< 2等标准对条目进行了着色。通过删除所有不符合条件p < 0.05的条目,折叠值> 2,创建第二个Excel表格。
补充表9
细胞裂解物的蛋白质组表达数据h . maritima以4%和20%的CO生长2在混合营养条件下(CO2+ 80% h2+ S0+ 0.2 g l-1酵母提取物)。所示为含有单向方差分析的Progenesis QIP生成的处理输出P值,问值和功率以及进一步的参数,如唯一肽的数量。选择标准见补充表1。
补充表11
扩展数据的对齐图1。
权利和权限
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斯蒂芬斯,L,佩蒂纳托,E,斯坦纳,T.M.et al。高有限公司2水平驱动TCA循环向自养方向倒退。自然592, 784-788(2021)。https://doi.org/10.1038/s41586-021-03456-9
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